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¿Cómo se produce la terminación dependiente de rho?

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La terminación dependiente de Rho no se comprende completamente, pero hay una breve descripción en casi todos los libros relacionados al respecto.

En Snustard and Instant notes-Molecular Biology está escrito que, la proteína rho se une a un tramo de 72 nucleótidos en el extremo 3 'del ARN naciente, que podría ser un sitio de reconocimiento y luego se mueve a lo largo de la dirección 5' -> 3 'separando el híbrido ADN-ARN.

Pero, ¿cómo es posible que rho se una al extremo de 3 '(que no es libre) y se mueva en 5' -> 3 '(si es así, seguramente se caerá!)?

Diagrama de Berg que muestra algo opuesto, es decir, se ha adherido al extremo 5 'y se mueve en la dirección 5' -> 3 '.

¿Qué es lo correcto?


No hay dicotomía en las dos fuentes que ha descrito. El libro de texto al que vinculó dice exactamente (énfasis agregado):

Rho parece unirse a un tramo de 72 nucleótidos cerca el extremo 3 'del ARN naciente ...

No dice en el extremo 3 ', lo que obviamente es imposible ya que el extremo 3' forma un híbrido de doble hebra dentro de la burbuja de transcripción. Rho no está cargado a el extremo 5 'del ARN, tampoco, sino que se une internamente en los sitios de utilización de Rho ricos en citidina (rutina), que estarán en algún lugar 5' del punto real de terminación de la transcripción. Como mencionaste, hay mucha incertidumbre en el proceso y, aunque se sabe mucho sobre los sitios de rutina, por lo que puedo decir, no hay una secuencia de consenso, lo que dificulta la identificación sistemática de los sitios de rutina en todo el genoma. He encontrado artículos que identifican sitios de surcos en 5'-UTR (1) así como dentro de 3'-UTR, regiones intercistrónicas y secuencias de codificación (2, 3, 4).


Mecanismo de carga interna de Rho:

Koslover DJ, Fazal FM, Mooney RA, Landick R, Block SM. 2012. Enlace y translocación del factor de terminación Rho estudiado a nivel de una sola molécula. J Mol Biol 423: 664-676


Tu diagrama es correcto. La proteína Rho se une en el extremo 5 'y "persigue" la ARN polimerasa. No es posible que la proteína Rho se una al extremo 3 ', ya que aún no ha sido transcrita por la ARN polimerasa.


Terminación dependiente de Rho

Las tres etapas principales de la transcripción se conocen como inicio, alargamiento y terminación, la última de las cuales puede ser asistida por una proteína que se asocia con el complejo de ARN polimerasa, en Escherichia coli esto se conoce como factor Rho (ρ). Terminación dependiente de Rho es uno de los dos tipos de terminación en la transcripción procariota, siendo el otro intrínseco (o independiente de Rho).

La ARN polimerasa es capaz de terminar la transcripción de algunos genes sin ayuda, por ejemplo, en una serie de varios residuos U que siguen una horquilla en otros sitios, sin embargo, requiere la participación de un factor adicional. El método de terminación observado en presencia del factor Rho es similar al encontrado en la terminación intrínseca a través de las secuencias terminadoras reconocidas por la proteína que son largas y complejas [1].

La proteína Rho es una helicasa dependiente de ATP compuesta por seis subunidades idénticas que se unen a una región expuesta de ARN monocatenario siguiendo el marco de lectura abierto. Cada una de las subunidades tiene un dominio de hidrólisis de ATP y un dominio de unión de ARN que permite que el ARN pase a través del centro de la proteína hexamérica. Rho se inicia mediante secuencias ricas en citosina pero pobres en guanina. Después de unirse a la cadena de ARN recién formada, el factor ρ se mueve a lo largo de la molécula en una dirección 5'-3 'y estimula la disociación de la plantilla de ADN y la ARN polimerasa [2]. Interrumpe el complejo transcripcional actuando como una helicasa ARN-ADN cuando alcanza la burbuja transcripcional. Se forma un bucle polipeptídico de la proteína ρ cuando alcanza una señal de terminación, esto impide que se lleve a cabo la etapa de elongación ya que se inserta en el canal principal del complejo ARN polimerasa, separando el híbrido ARN / ADN.

El descubrimiento de este proceso fue impulsado por la observación de que las moléculas de ARN, cuando se fabrican in vivo, son más cortas que las sintetizadas in vitro por la ARN polimerasa sola. Esto condujo al aislamiento de Rho como la proteína que causó la terminación apropiada de la cadena y se obtuvo más información sobre el factor de terminación mediante la adición de ρ a una mezcla de incubación en diferentes momentos después del inicio de la síntesis de ARN [3].


Contenido

Un factor Rho actúa sobre un sustrato de ARN. La función clave de Rho es su actividad helicasa, para la cual se proporciona energía mediante una hidrólisis de ATP dependiente de ARN. El sitio de unión inicial para Rho es un extendido (

70 nucleótidos, a veces 80-100 nucleótidos) región monocatenaria, rica en citosina y pobre en guanina, llamada rHo Utahsitio de ilizaciónrodera), en el ARN que se sintetiza, aguas arriba de la secuencia del terminador real. Se han descubierto varias secuencias de unión a rho. No se encuentra consenso entre estos, pero las diferentes secuencias parecen específicas, ya que pequeñas mutaciones en la secuencia interrumpen su función. Rho se une al ARN y luego usa su actividad ATPasa para proporcionar la energía para translocar a lo largo del ARN hasta que alcanza la región helicoidal ARN-ADN, donde desenrolla la estructura dúplex híbrida. La ARN polimerasa se detiene en la secuencia de terminación, que se debe a que hay un sitio específico a unos 100 nt del sitio de unión de Rho llamado sitio de pausa sensible a Rho. Entonces, aunque la ARN polimerasa es aproximadamente 40 nt por segundo más rápida que Rho, no representa un problema para el mecanismo de terminación Rho, ya que la ARN polimerasa permite que el factor Rho se ponga al día. [ cita necesaria ]

En resumen, el factor Rho actúa como una enzima de desenrollado dependiente de ATP, moviéndose a lo largo de la molécula de ARN recién formada hacia su extremo 3 'y desenrollándola de la plantilla de ADN a medida que avanza.

Una mutación sin sentido en un gen de un operón impide la traducción de genes posteriores en la unidad. Este efecto se llama polaridad mutacional. Una causa común es la ausencia del ARNm correspondiente a las partes posteriores (distales) de la unidad. Supongamos que hay terminadores dependientes de Rho dentro de la unidad de transcripción, es decir, antes del terminador que se usa habitualmente. Normalmente, estos terminadores anteriores no se utilizan, porque el ribosoma evita que Rho alcance la ARN polimerasa. Pero una mutación sin sentido libera el ribosoma, por lo que Rho es libre de unirse y / o moverse a lo largo del ARN, lo que le permite actuar sobre la ARN polimerasa en el terminador. Como resultado, se libera la enzima y las regiones distales de la unidad de transcripción nunca se transcriben. [ cita necesaria ]


RESULTADOS

Los Salmonella corA líder puede adoptar dos conformaciones mutuamente excluyentes que controlan la accesibilidad de un rodera sitio

In vitro ensayos de sondeo de estructura demostraron previamente que el corA El ARNm líder es capaz de adoptar estructuras secundarias mutuamente excluyentes denominadas vástago-bucles A + B y vástago-bucles C + D (Figura 1) (3). Sin embargo, es poco probable que se forme el bucle de tallo A en vivo porque un marco de lectura abierto corto, denominado corL, se superpone a un tallo-bucle A de tal manera que los ribosomas se traducen corL debe evitar el emparejamiento de bases (Figura 1) (3). Nuestro trabajo anterior demostró que la conformación de tallo-bucle B promueve la terminación de la transcripción dependiente de Rho dentro del corA líder exponiendo nucleótidos que comprenden un rodera sitio (Figura 1) (3). Por el contrario, la conformación C + D de tallo-bucle dificulta la terminación dependiente de Rho dentro del corA líder secuestrando el rodera sitio (Figura 1) (3). Traducción eficiente de corL promueve la formación de tallo-bucle B, mientras que altera corL la traducción favorece los bucles de tallo C + D, por lo tanto, la transcripción del corA región de codificación está inversamente acoplada a la eficiencia de corL traducción (3).

Esquema del corA ARNm líder. los Salmonella corA El líder puede adoptar dos conformaciones mutuamente excluyentes, los vástagos A + B o C + D, que controlan el alargamiento de la transcripción en el corA región de codificación modulando la accesibilidad de un rodera sitio (3). Es posible que no se forme el vástago A en vivo debido a la traducción del ORF superpuesto corL (el cuadro negro punteado denota corL codones de inicio y parada) (3). Principales sitios de in vitro Se indican la pausa de RNAP (verde) y la terminación dependiente de Rho (azul). En este trabajo, identificamos una estructura de ARN adicional, tallo-bucle E (naranja), cuya formación puede ser independiente de los tallo-bucles B frente a C + D. Los bucles de vástago C + D suprimen la pausa de RNAP en U240 (estrella roja). Stem-loop E evita que Rho active la terminación de la transcripción en U192 (estrella verde).

Esquema del corA ARNm líder. los Salmonella corA El líder puede adoptar dos conformaciones mutuamente excluyentes, los vástagos A + B o C + D, que controlan el alargamiento de la transcripción en el corA región de codificación modulando la accesibilidad de un rodera sitio (3). Es posible que no se forme el vástago A en vivo debido a la traducción del ORF superpuesto corL (el cuadro negro punteado denota corL codones de inicio y parada) (3). Principales sitios de in vitro Se indican la pausa de RNAP (verde) y la terminación dependiente de Rho (azul). En este trabajo, identificamos una estructura de ARN adicional, tallo-bucle E (naranja), cuya formación puede ser independiente de los tallo-bucles B frente a C + D. Los bucles de vástago C + D suprimen la pausa de RNAP en U240 (estrella roja). Stem-loop E evita que Rho active la terminación de la transcripción en U192 (estrella verde).

Porque el corA líder se extiende ∼100 nt aguas abajo de las estructuras de ARN que regulan la capacidad de Rho para acceder a la rodera sitio (Figura 1) y la secuencia de nucleótidos de esta región está altamente conservada (Figura complementaria S1), razonamos que podría desempeñar un papel adicional en la regulación de la terminación de la transcripción dependiente de Rho. Por ejemplo, el Salmonella mgtA La conformación del ARN líder controla la terminación dependiente de Rho modulando rodera la accesibilidad del sitio y la pausa de RNAP, y la regulación de ambos aspectos es necesaria para el control de genes (20).

RNAP se detiene con frecuencia dentro del corA líder

Para investigar la posibilidad de que el corA líder influye en la pausa de RNAP, primero mapeamos los sitios de pausa de RNAP dentro de esta región realizando una ronda única, sincronizada in vitro reacciones de transcripción. La plantilla de ADN utilizada en estos experimentos codifica una secuencia transcrita inicial sin C de 26 nt, para facilitar la sincronización de la elongación de la transcripción, seguida de la secuencia completa corA líder y primeros 49 nt de la corA región codificante, todo bajo el control de un promotor constitutivo (Figura 2A) (20, 30). Las muestras se recolectaron a lo largo del tiempo en el orden de segundos, las bandas que aparecen y luego desaparecen a lo largo del transcurso del tiempo corresponden a posiciones en las que alguna fracción de moléculas de RNAP se detiene antes de continuar la transcripción.

Mapeo de sitios de pausa RNAP en el corA líder. (A) Esquema de las plantillas de ADN utilizadas para in vitro ensayos de transcripción, modificado de (20). La inclusión de una secuencia transcrita inicial (ITS) sin C de 26 nt facilita la sincronización de la transcripción (30). (B) Un gel desnaturalizante al 6% que muestra la secuenciación de ARN (izquierda), la terminación de la transcripción (centro) y los ensayos de pausa (derecha) realizados con un tipo salvaje corA plantilla líder generada a partir de pMK100 como se describe en Materiales y métodos. Todos los paneles son del mismo gel y se ordenaron nuevamente para mayor claridad. RNAP se detiene con frecuencia dentro del corA líder, incluso en los sitios de terminación dependiente de Rho (barras azules). El sitio de pausa principal, U192 (estrella verde) no es un sitio de terminación dependiente de Rho. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes y solo se muestra la porción relevante del gel.

Mapeo de sitios de pausa RNAP en el corA líder. (A) Esquema de las plantillas de ADN utilizadas para in vitro ensayos de transcripción, modificado de (20). La inclusión de una secuencia transcrita inicial (ITS) sin C de 26 nt facilita la sincronización de la transcripción (30). (B) Un gel desnaturalizante al 6% que muestra la secuenciación de ARN (izquierda), la terminación de la transcripción (centro) y los ensayos de pausa (derecha) realizados con un tipo salvaje corA plantilla líder generada a partir de pMK100 como se describe en Materiales y métodos. Todos los paneles son del mismo gel y se ordenaron nuevamente para mayor claridad. RNAP se detiene con frecuencia dentro del corA líder, incluso en los sitios de terminación dependiente de Rho (barras azules). El sitio de pausa principal, U192 (estrella verde) no es un sitio de terminación dependiente de Rho. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes y solo se muestra la porción relevante del gel.

RNAP se detiene con frecuencia dentro del corA líder in vitro (Figura 2B, derecha), incluso en los grupos esperados de sitios que corresponden a los sitios de terminación dependientes de Rho observados in vitro (Figura 2B, barras azules). Curiosamente, el sitio más eficiente de pausa, que se encuentra en la posición U192 (Figura 2B, estrella verde) y se ajusta a la secuencia de pausa de consenso recientemente identificada G -10Y-1GRAMO+1 (32, 33), no es un sitio de terminación dependiente de Rho (Figura 2B).

Los bucles de vástago C y D reducen la eficiencia de la pausa de RNAP en un sitio a más de 100 nt aguas abajo

A continuación, probamos si las dos conformaciones conocidas del corA líder, vástago-bucle B y vástago-bucles C + D, afectan diferencialmente la pausa RNAP. Los vástagos C + D secuestran el rodera sitio (3). La alteración de esta conformación por la mutación M1 (G84C G85C C86G, Figura 1) aumentó significativamente la pausa en U240, un sitio de terminación dependiente de Rho (Figura 3A). Este resultado fue inesperado considerando que el sitio de pausa afectado está 100-150 nt aguas abajo de M1 y los bucles de tallo B-D (Figura 1). M1 aumenta específicamente la eficiencia de la pausa, en lugar de su vida media (Figura 3A), lo que indica la modulación de la entrada de RNAP en el estado de pausa.

La misma conformación de ARN que secuestra el rodera El sitio (vástago-bucles C + D) reduce la eficiencia de la pausa de RNAP en U240. (A y B) Un gel desnaturalizante al 6% de ensayos de pausa de RNAP realizados utilizando plantillas de ADN generadas a partir del plásmido pMK100 o derivados que contienen mutaciones en (A) tallo-bucle C o (B) tallo-lazo D (Figura 1). Una estrella roja indica la posición de la pausa del U240, que se encuentra dentro del corA codón de inicio. La eficiencia de la pausa y la vida media se calcularon como se describe en Materiales y métodos. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes y solo se muestra la porción relevante del gel. Los datos mostrados en (A) son del mismo gel. La línea continua indica donde se omitieron los carriles intermedios para mayor claridad.

La misma conformación de ARN que secuestra el rodera sitio (vástago-bucles C + D) reduce la eficiencia de la pausa RNAP en U240. (A y B) Un gel desnaturalizante al 6% de ensayos de pausa de RNAP realizados utilizando plantillas de ADN generadas a partir del plásmido pMK100 o derivados que contienen mutaciones en (A) tallo-bucle C o (B) tallo-bucle D (Figura 1). Una estrella roja indica la posición de la pausa del U240, que está dentro del corA codón de inicio. La eficiencia de la pausa y la vida media se calcularon como se describe en Materiales y métodos. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes y solo se muestra la porción relevante del gel. Los datos mostrados en (A) son del mismo gel. La línea continua indica donde se omitieron los carriles intermedios para mayor claridad.

Teóricamente, la mutación M1 interrumpe los lazos A y C, pero no es probable que se forme el bucle A en vivo debido a la presencia de ribosomas que se traducen corL, un marco de lectura abierto que se superpone al vástago-bucle A (Figura 1) (3). De hecho, el efecto de M1 en la pausa de RNAP se debe específicamente a la interrupción del tallo-lazo C en lugar de la interrupción del tallo-lazo A debido a la restauración del potencial de emparejamiento de bases del tallo-lazo C al combinar M1 con M2 (G105C C106G C107G, Figura 1 ) devolvió una pausa a la eficiencia de tipo salvaje (Figura 3A), mientras que la restauración del potencial de emparejamiento de bases A de tallo-bucle mediante la combinación de M1 con M1 * (G24C C25G C26G, Figura 1) no revirtió el efecto de M1 (Figura complementaria S2) . Es importante tener en cuenta que la mutación M2, que interrumpe tanto los bucles de tallo B como C, provoca el mismo comportamiento de pausa que M1 (Figura 3A), lo que indica que el efecto en U240 se debe a la supresión de la pausa por el bucle de tallo C en lugar de promoción de la pausa por el tallo-bucle B.

Debido a que se espera que el tallo-lazo C facilite la formación de tallo-lazo D (en virtud de evitar la formación de tallo-lazo B) (Figura 1), probamos si la interrupción del tallo-lazo D también conduce a una pausa eficiente de RNAP en U240. De hecho, una mutación que interrumpe el tallo-lazo D (M5 [G121T G123T], Figura 1) mostró el mismo aumento en la eficiencia de pausa U240 que una mutación que interrumpe el tallo-lazo C (M1) (Figura 3B). Aunque se predice que M5 interrumpe tanto los vástagos B como D, el efecto de esta mutación en la pausa se debe específicamente a la interrupción del vástago D porque se combina M5 con M6 (C143A C145A, Figura 1) para restaurar la base D del vástago. -el potencial de emparejamiento restableció la eficiencia de pausa de tipo salvaje (Figura 3B), mientras que la combinación de M5 con M7 (T97G C99G, Figura 1) para restaurar el potencial de emparejamiento de bases B de tallo-bucle retuvo una eficiencia de pausa elevada en U240 (Figura complementaria S3). Inesperadamente, M6 solo no aumentó la eficiencia de pausa de U240 como M5, a pesar del hecho de que ambas mutaciones interrumpen el tallo-bucle D (Figura 3B).

Además de interrumpir el tallo-lazo C, la mutación M1 también debería prevenir la formación de tallo-lazo D porque el tallo-lazo B tendrá una ventaja cinética sobre el tallo-lazo D cuando el tallo-lazo C no puede formarse (Figura 1). Por lo tanto, parecía posible que la capacidad de M1 para mejorar la pausa en U240 se deba únicamente a la interrupción del bucle de tallo D. Sin embargo, este no parece ser el caso porque M1 + M5 + M6, que se espera que adopte el tallo- el bucle D a pesar de la interrupción del bucle de tallo C, mostró una pausa mejorada en U240 (Figura complementaria S4). Por lo tanto, los bucles de vástago C y D son necesarios para la supresión de la pausa en U240. La eliminación completa de la pausa en U240 por la mutación M18 (T240G G241A, Figura 1) (Figura complementaria S5A) desreprimió aún más la expresión de un corA líder-lacZ fusión transcripcional llevada a cabo en el plásmido pYS1040 que contiene una mutación que favorece la adopción de los bucles madre C + D (Figura complementaria S5D), lo que sugiere que la supresión de la pausa en U240 mejora la capacidad de los bucles madre C + D para promover corA expresión.

Los dinucleótidos YC aguas abajo del tallo-bucle D pueden influir en la actividad de Rho

U192 no es un sitio de terminación de la transcripción dependiente de Rho a pesar de ser el sitio de pausa de RNAP más eficiente en el corA líder (Figura 2B). los rodera Anteriormente se informó que el sitio abarcaba las posiciones 89-140 de la corA líder y, por lo tanto, se encuentran bien aguas arriba de U192 (Figura 1) (3). Sin embargo, debido a que esta región contiene solo tres dinucleótidos YC monocatenarios adecuadamente espaciados (posiciones 89-91, 129-130, 138-140, Figura 1) y Rho PBS puede acomodar hasta seis dinucleótidos YC, exploramos la posibilidad de que Los dinucleótidos YC corriente abajo de la posición 140 podrían estar implicados en la carga de Rho. los corA La secuencia líder contiene siete dinucleótidos YC entre la posición 140 y el primer sitio de terminación dependiente de Rho significativa (220), cuatro de los cuales no estarían disponibles para Rho cuando RNAP se pausa en U192 (Figura 1). Por tanto, es posible que Rho no termine la transcripción en U192 porque no ha completado la carga en el momento en que RNAP alcanza esta posición.

Primero probamos si la eliminación de un dinucleótido YC dado disminuía la eficiencia de la terminación de la transcripción dependiente de Rho in vitro. La mutación de cada uno de los tres primeros dinucleótidos YC aguas abajo de la posición 140 (M19 [T152C C153A], M20 [T168G C169G] y M21 [C176G C177T]) resultó en una reducción de la eficiencia de la terminación dependiente de Rho (Figura 4A), lo que revela que estos YC Los dinucleótidos pueden ser parte de la rodera sitio. Por el contrario, la mutación del cuarto y quinto dinucleótidos YC (M22 [T186A C187G T188A], M23 [C194A C195G C196T]) no afectó significativamente la eficiencia de terminación (Figura 4A), lo que indica que no son necesarios para la terminación dependiente de Rho en el corA líder.

Rho puede utilizar dinucleótidos YC cadena abajo de C140. (A) Un gel desnaturalizante al 6% de ensayos de terminación de la transcripción realizados utilizando plantillas de ADN generadas a partir del plásmido pMK100 o derivados que albergan mutaciones en dinucleótidos YC entre las posiciones 152-196 (Figura 1), en presencia de proteína Rho purificada. Las reacciones se realizaron por triplicado y solo se muestra la porción relevante del gel. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. La estrella verde indica la posición de la pausa U192. (B) Se controló la acumulación de fosfato libre para cuantificar la actividad de Rho ATPasa. La proteína Rho purificada se incubó con ARN correspondiente al tipo salvaje corA ARNm líder o variantes que albergan mutaciones de dinucleótidos YC entre las posiciones 152-196 (Figura 1). Los datos mostrados corresponden a valores medios y desviación estándar de duplicados técnicos y son representativos de tres experimentos independientes.

Rho puede utilizar dinucleótidos YC cadena abajo de C140. (A) Un gel desnaturalizante al 6% de ensayos de terminación de la transcripción realizados utilizando plantillas de ADN generadas a partir del plásmido pMK100 o derivados que albergan mutaciones en dinucleótidos YC entre las posiciones 152-196 (Figura 1), en presencia de proteína Rho purificada. Las reacciones se realizaron por triplicado y solo se muestra la porción relevante del gel. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. La estrella verde indica la posición de la pausa U192. (B) Se controló la acumulación de fosfato libre para cuantificar la actividad de Rho ATPasa. La proteína Rho purificada se incubó con ARN correspondiente al tipo salvaje corA ARNm líder o variantes que albergan mutaciones de dinucleótidos YC entre las posiciones 152-196 (Figura 1). Los datos mostrados corresponden a valores medios y desviación estándar de duplicados técnicos y son representativos de tres experimentos independientes.

Si los dinucleótidos YC interrumpidos por M19, M20 y M21 reducen la eficiencia de terminación al servir como componentes de la rodera sitio, entonces estas mutaciones deberían debilitar la interacción entre Rho y corA ARNm líder, independientemente del proceso de transcripción. Para probar esta noción, medimos la capacidad de corA ARNm líder que alberga las mutaciones M19, M20 y M21 para estimular la actividad de Rho ATPasa in vitro. Los tres ARN mutantes mostraron una capacidad reducida para estimular la actividad de Rho ATPasa (Figura 4B), lo que indica que los dinucleótidos YC en las posiciones 152-153, 168-169 y 176-177 promueven la actividad Rho y, por lo tanto, pueden estar directamente involucrados en Rho PBS-RNA reconocimiento. Como resultado, concluimos que el rodera el sitio abarca las posiciones 89-177.

Stem-loop E evita que Rho acceda a los complejos RNAP pausados ​​en U192 en un rodera manera independiente del sitio

Paradójicamente, las mutaciones M19 y M20 provocaron que se produjera una terminación dependiente de Rho en un sitio corriente arriba (Figura 4A, estrella verde) que determinamos que era U192, el principal sitio de pausa de RNAP (Figura complementaria S6). Este resultado indica que los nucleótidos 152-153 y 168-169 inhiben de alguna manera la terminación dependiente de Rho en U192. Notamos una horquilla de ARN potencial ubicada en la posición 152-172 (Figura 1) que se conserva entre los analizados corA secuencias líder (Figura complementaria S1) designamos esta horquilla de tallo-lazo E. Probamos si la capacidad de M20 para promover la terminación dependiente de Rho en U192 es una consecuencia de interrumpir el tallo-lazo E. De hecho, la mutación de los nucleótidos predichos a base emparejarse con los interrumpidos por la mutación M20 (M24 [G155C G156C], Figura 1) también permitió que ocurriera la terminación dependiente de Rho en U192 (Figura 5A), mientras que la combinación de M24 + M20 para restaurar el potencial de emparejamiento de bases E del tallo-bucle evitó la terminación en U192 y restauró el patrón de tipo salvaje de ubicaciones de terminación (Figura 5A). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la formación E del tallo-bucle previene la terminación dependiente de Rho en U192.

Stem-loop E evita que Rho termine la transcripción en un sitio de pausa principal de RNAP, U192, en un rodera de manera independiente del sitio. (A) Un gel desnaturalizante al 6% de ensayos de terminación de la transcripción realizados usando moldes generados a partir del plásmido pMK100 o derivados que contienen mutaciones en el tallo-bucle E (Figura 1). La estrella verde indica la posición de la pausa U192. El cálculo de la eficiencia de terminación se realizó como se describe en Materiales y métodos. Las reacciones se realizaron por triplicado y solo se muestra la porción relevante del gel. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. (B) Un gel desnaturalizante al 6% de ensayos de pausa de RNAP realizados utilizando plantillas de ADN generadas a partir del plásmido pMK100 o derivados que contienen mutaciones en el tallo-bucle E (Figura 1). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes y solo se muestra la porción relevante del gel. La estrella verde indica la posición de la pausa U192. (C) Un gel desnaturalizante al 6% de ensayos de terminación de la transcripción realizados utilizando moldes generados a partir del plásmido pMK100 o derivados que contienen mutaciones que interrumpen el tallo-bucle E y / o eliminan los nucleótidos YC que se predice que participarán en el emparejamiento de bases del tallo-bucle E (Figura 1). Las reacciones se realizaron por triplicado y solo se muestra la porción relevante del gel. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. La estrella verde indica la posición de la pausa U192. Los datos mostrados son del mismo gel, se reordenaron los paneles y se omitieron los carriles intermedios para mayor claridad.

Stem-loop E evita que Rho termine la transcripción en un sitio de pausa principal de RNAP, U192, en un rodera de manera independiente del sitio. (A) Un gel desnaturalizante al 6% de ensayos de terminación de la transcripción realizados usando moldes generados a partir del plásmido pMK100 o derivados que contienen mutaciones en el tallo-bucle E (Figura 1). La estrella verde indica la posición de la pausa U192. El cálculo de la eficiencia de terminación se realizó como se describe en Materiales y métodos. Las reacciones se realizaron por triplicado y solo se muestra la porción relevante del gel. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. (B) Un gel desnaturalizante al 6% de ensayos de pausa de RNAP realizados utilizando plantillas de ADN generadas a partir del plásmido pMK100 o derivados que contienen mutaciones en el tallo-bucle E (Figura 1). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes y solo se muestra la porción relevante del gel. La estrella verde indica la posición de la pausa U192. (C) Un gel desnaturalizante al 6% de ensayos de terminación de la transcripción realizados utilizando moldes generados a partir del plásmido pMK100 o derivados que contienen mutaciones que interrumpen el tallo-bucle E y / o eliminan los nucleótidos YC que se predice que participarán en el emparejamiento de bases del tallo-bucle E (Figura 1). Las reacciones se realizaron por triplicado y solo se muestra la porción relevante del gel. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. La estrella verde indica la posición de la pausa U192. Los datos mostrados son del mismo gel, se reordenaron los paneles y se omitieron los carriles intermedios para mayor claridad.

Las mutaciones M24 y M20 introducen y eliminan, respectivamente, un dinucleótido YC de la corA secuencia de ARN líder. Para desacoplar los efectos de M24 y M20 en la estructura E de tallo-bucle de rodera composición del sitio, probamos las mutaciones alternativas M24 ∧ (G155T G156T C157G T158A) y M20 ∧ (G166T G167C T168A C169A). M24 ∧ interrumpe el brazo izquierdo del tallo-bucle E sin introducir un dinucleótido YC, y M20 ∧ interrumpe el brazo derecho del tallo-loop E pero retiene un YC dos nucleótidos aguas arriba de su posición de tipo salvaje (Figura 1). Al igual que con las mutaciones originales, M24 ∧ y M20 ∧ promueven la terminación dependiente de Rho en U192, y la combinación de M24 ∧ + M20 ∧ restauró las ubicaciones de terminación de tipo salvaje (Figura complementaria S7A). Además, la combinación de M24 ∧ con M20 * (T168A C169T), que no restaura el potencial de emparejamiento de bases E de bucle de tallo, no restauró el patrón de terminación de tipo salvaje (Figura complementaria S7B). Juntos, estos resultados indican que la propia E del tallo-bucle, en lugar de las secuencias de nucleótidos interrumpidas por las mutaciones M24 y M20, impide que Rho acceda a los complejos de transcripción detenidos en U192.

Es importante destacar que las plantillas que albergan las mutaciones M24 y / o M20 conservan la pausa de RNAP de tipo salvaje en U192 (Figura 5B), lo que indica que el tallo-bucle E evita la terminación en U192 mediante un mecanismo distinto de la inhibición de la pausa de RNAP en este sitio. Este resultado sugiere que E del tallo-bucle, en cambio, influye en la interacción Rho-RNA. Una posibilidad es que el tallo-bucle E evita que Rho PBS acceda a los dinucleótidos YC en la posición 152-153 y 168-169 secuestrándolos dentro de la horquilla del ARN (Figura 1), lo que obliga a Rho a utilizar dinucleótidos YC descendentes como C175- 177 y resulta en la terminación en los sitios aguas abajo. Sin embargo, esta explicación no es suficiente porque se observó terminación Rho-dependiente en U192 en presencia de mutaciones que interrumpen el tallo-lazo E y eliminan los dinucleótidos YC de las posiciones 152-153 y 168-169 (M20 * + M19, Figura 5C ). Este resultado indica que la terminación en U192 resultante de la interrupción del tallo-lazo E no es una consecuencia del acceso mejorado de Rho a los dinucleótidos YC dentro del tallo-lazo E.

Stem-loop E promueve la actividad Rho en un rodera manera independiente del sitio

Para investigar más a fondo cómo afecta el tallo-bucle E a la interacción Rho-ARN, probamos la capacidad de corA ARNm líder que alberga mutaciones M24 ∧ y / o M20 ∧ para estimular la actividad de Rho ATPasa in vitro. M24 ∧ o M20 ∧ solo, que previenen la formación de E de tallo-bucle, no afectó significativamente la actividad de la ATPasa (Figura 6A). Por el contrario, la combinación de M24 ∧ + M20 ∧ para restaurar el potencial de emparejamiento de bases E de tallo-bucle aumentó significativamente la actividad de Rho ATPasa (Figura 6A). Una posible interpretación de estos resultados es que el tallo-lazo E no es la conformación predominante bajo las condiciones probadas (por lo tanto, interrumpir el emparejamiento de bases tendría poco efecto), y que M24 ∧ + M20 ∧ fuerza la adopción de tallo-lazo E, que , a su vez, promueve la actividad de Rho. Este resultado es consistente con la capacidad de M24 + M20 para aumentar significativamente la eficiencia de la terminación dependiente de Rho in vitro (Figura 5A) y reprime significativamente la expresión en vivo (Figura 6B). Juntos, estos resultados indican que el tallo-bucle E mejora específicamente la interacción Rho-RNA.

Stem-loop E promueve la actividad Rho en un rodera de manera independiente del sitio. (A) Se controló la acumulación de fosfato libre para cuantificar la actividad de Rho ATPasa. La proteína Rho purificada se incubó con ARN correspondiente al tipo salvaje corA ARNm líder o variantes que albergan mutaciones en el tallo-bucle E (Figura 1). Los datos mostrados corresponden a valores medios y desviación estándar de duplicados técnicos y son representativos de tres experimentos independientes. (B) Actividad β-galactosidasa (unidades Miller) de tipo salvaje Salmonela (14028s) que alberga el plásmido pYS1040 o derivados que albergan mutaciones que interrumpen o restauran el potencial de emparejamiento de bases E de tallo-bucle (Figura 1). Los datos mostrados indican valores medios y desviaciones estándar de un experimento realizado por duplicado biológico que es representativo de tres experimentos independientes. (C) Se controló la acumulación de fosfato libre para cuantificar la actividad de Rho ATPasa. La proteína Rho purificada se incubó con ARN correspondiente al tipo salvaje corA ARNm líder o variantes que albergan mutaciones en el tallo-bucle E y / o la región rica en C en la posición 175-177 (Figura 1). Los datos mostrados corresponden a valores medios y desviación estándar de duplicados técnicos y son representativos de tres experimentos independientes. (D) Porcentaje de ARN radiomarcado 5΄ unido por Rho y retenido después de la filtración al vacío. Los ARN corresponden al tipo salvaje corA leader (black) or mutant derivatives containing mutations in stem-loop E (yellow, orange), stem-loop C (red, positive control) or the rut site (blue, negative control). Data shown are from a single experiment that is representative of three independent experiments.

Stem-loop E promotes Rho activity in a rut site-independent manner. (A) The accumulation of free phosphate was monitored to quantify Rho ATPase activity. Purified Rho protein was incubated with RNA corresponding to the wild-type corA leader mRNA or variants harboring mutations in stem-loop E (Figure 1). Data shown correspond to mean values and standard deviation of technical duplicates and are representative of three independent experiments. (B) β-galactosidase activity (Miller units) from wild-type Salmonela (14028s) harboring plasmid pYS1040 or derivatives harboring mutations that disrupt or restore stem-loop E base-pairing potential (Figure 1). Data shown indicate mean values and standard deviations from an experiment performed in biological duplicate that is representative of three independent experiments. (C) The accumulation of free phosphate was monitored to quantify Rho ATPase activity. Purified Rho protein was incubated with RNA corresponding to the wild-type corA leader mRNA or variants harboring mutations in stem-loop E and/or the C-rich region at position 175–177 (Figure 1). Data shown correspond to mean values and standard deviation of technical duplicates and are representative of three independent experiments. (D) Percentage of 5΄ radiolabeled RNA bound by Rho and retained following vacuum filtration. RNAs correspond to the wild-type corA leader (black) or mutant derivatives containing mutations in stem-loop E (yellow, orange), stem-loop C (red, positive control) or the rut site (blue, negative control). Data shown are from a single experiment that is representative of three independent experiments.

We next sought to determine how stem-loop E promotes Rho activity. A possible function of stem-loop E could be to bring disparate rut site elements into a favorable spatial orientation. For example, if stem-loop E enhances the Rho-RNA interaction by positioning the C175-177 YC dinucleotide near the rest of the rut site (Figure 1), then mutation of this YC dinucleotide should reverse the ability of a mutant RNA locked in stem-loop E to promote Rho ATPase activity in vitro. However, mutation of C175-177 (M21) in a stem-loop E-locked background (M24 ∧ +M20 ∧ ) only slightly decreased Rho ATPase activity relative to M24 ∧ +M20 ∧ (Figure 6C). That disruption of C175-177 is additive with rather than epistatic over locking the RNA in stem-loop E suggests that the mutations affect independent aspects of Rho activity. Thus, the ability of stem-loop E to promote Rho activity cannot be attributed to its effect on the orientation of C175-C177.

The effect of stem-loop E on Rho-dependent termination is independent of the RNA structures that regulate accessibility of upstream rut site components (stem-loops B versus C+D) because in vitro, formation of stem-loops B versus C+D influences the efficiency, rather than the location, of Rho-dependent termination ( 3), whereas stem-loop E affects the location and only modestly impacts termination efficiency (Figure 5A). Moreover, the effects of combining mutations that disrupt stem-loop E with those that favor stem-loop B (M1) or stem-loops C+D (M3) are additive ( Supplementary Figure S8 ), thus indicating that these mutations operate in different pathways. Since disruption of stem-loop E has effects in both stem-loop B-locked and stem-loop C+D-locked backgrounds ( Supplementary Figure S8 ), formation of stem-loop E appears to be independent of whether the upstream RNA adopts stem-loop B or stem-loops C+D.

Because the abilities of stem-loop E to promote Rho activity and influence the location of termination appear to be rut site-independent, we hypothesized that stem-loop E influences step(s) of the Rho-RNA interaction after initial Rho PBS-rut site binding has taken place. If this is the case, then alteration of stem-loop E should have no impact on the affinity of Rho for the corA leader mRNA. To test this possibility, we measured the ability of purified Rho protein to retain radiolabeled corA leader mRNA, or derivatives containing mutations in stem-loop E, on a filter. RNAs harboring M24, M20 and M24+M20 all yielded binding curves very similar to that of the wild-type RNA (Figure 6D), indicating that these mutations do not affect the ability of Rho to bind to corA leader mRNA. By contrast, Rho displayed a significantly higher affinity for M1 RNA, which constitutively exposes the rut site, and a lower affinity for M9+M10 RNA, in which key rut site nucleotides have been mutated (Figure 6D) ( 3). Therefore, we conclude that stem-loop E promotes Rho activity by influencing step(s) subsequent to rut site recognition.


MATERIALES Y MÉTODOS

DNA oligonucleotides, bacterial strains and plasmids

DNA oligonucleotides were purchased from Integrated DNA Technologies. Strains used in this study are derived from E. coli MG1665. Strain genotypes are listed in Supplementary Table S1 . Strain DH5α was used for routine cloning procedures ( 19), and BL21 (DE3) was used for overproduction of Rho and NusG proteins. los thiM transcriptional and translational fusions were constructed with the PM1205 strain ( Supplementary Table S2 ) ( 10). The polymerase chain reaction (PCR) strategy to obtain thiM riboswitch translational constructs is listed in Supplementary Table S3 . Transcriptional fusions used an additional PCR step (LB1–LB47) to insert a stop codon. Mutations performed in thiM were made using three PCR steps ( Supplementary Table S3 ). PCR1 and PCR2 were performed with the genomic DNA, and PCR3 was performed using products of the PCR1 and PCR2 reactions. DNA oligonucleotides used in this study are listed in the Supplementary Table S4 . The R66S rho mutant strains were constructed by P1 transduction, selected for tetracycline resistance and sequenced.

Enzymes and chemical

T7 polymerase, RNA degradosome, Rho and NusG protein were purified as described previously ( 20). los E. coli RNA polymerase (RNAP) was purchased from Epicentre. Bicyclomycin (BCM) was obtained from Santa Cruz Biotech. TPP and coenzyme B12 were purchased from Sigma Aldrich.

ChIP-qPCR

Wild-type MG1655 and MG1655 rhoR66S mutant strains were grown in Luria broth (LB) at 37°C to mid-exponential phase. ChIP of RNAP was performed as described previously ( 21) using anti-β mouse monoclonal antibody (NeoClone). After purification of ChIP and input (starting material) DNA samples, real-time PCR was performed using an ABI 7500 instrument with the primers listed in Supplementary Table S4 . In each reaction, forward and reverse primers were used to amplify either the UTR or ORF region of rho or selected riboswitch genes. The percentage of immunoprecipitation (IP) efficiency was calculated for each region of interest as the ratio of DNA in the ChIP sample compared to the input sample.

Northern blot analysis and mRNA half-life determination

Bacterial cultures were grown at 30 or 37°C in M63 0.2% glucose minimal medium to mid log-phase (OD600 of 0.35). Cells were then centrifuged and resuspended with sterile water, and total RNA was extracted immediately using the hot phenol method ( 10). TPP (500 μg/ml) or BCM (25 μg/ml) was added at indicated times. RNA transcription was blocked by adding rifampicin (250 μg/ml) to determine mRNA half-life. Northern blot experiments were performed as described previously ( 10). Probes were generated by PCR (see Supplementary Table S3 ).

Β-Galactosidase assays

Kinetic assays for β-galactosidase experiments were performed as described previously ( 10). Briefly, an overnight bacterial culture grown in M63 0.2% glycerol minimal medium was diluted to an OD600 of 0.02 in 50 ml of fresh medium. The culture was incubated at 37°C until an OD600 of 0.1 was obtained. Arabinose (0.1%) was then added to induce the expression of lacZ constructs. TPP (500 μg/ml) or AdoCbl (80 μg/ml) was added where indicated. β-Galactosidase experiments determining Rho factor involvement were performed in 3 ml of culture media as described above. BCM (25 μg/ml) was added where indicated. As for the Rho R66S mutant strains, the β-galactosidase experiments were performed in 50 ml of LB medium, following the same method described above.

Rho-dependent transcription termination assays

In vitro transcriptions were performed using either the first 400 nt of thiM mRNA or the first 336 nt of the 34-codon thiM–lacZ transcriptional fusion. The transcription buffer contained 40 mM Tris–HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 5 mM MgCl2 and 1.5 mM dithiothreitol (DTT). In a reacting vessel, 300 fmol DNA template, 10 μM CUGC tetranucleotide and 400 nM ATP/GTP were incubated in the transcription buffer at 37°C for 5 min. Rho (50 nM) and/or NusG were added where indicated. A mixture containing 0.2 U E. coli RNAP and 10 μCi [α- 32 P] UTP were then added to the transcription reaction and incubated at 37°C for 15 min. A solution containing 50 μM of nucleoside triphosphates (NTPs) and 1.5 μg/ml rifampicin was added to complete the transcription reaction. Resulting reactions were phenol/chloroform treated and mixed 1:1 with a stop solution containing 95% formamide, 10 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and 0.1% sodium dodecyl sulphate (SDS).

TPP binding kinetics monitored using RNase H assays

In vitro transcription assays were performed using the first 300 nt of thiM ARNm. The transcription buffer contained 20 mM Tris–HCl (pH 8.0), 20 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 100 μM EDTA and 14 mM β-mercaptoethanol. Radiolabeled transcripts were mixed 1:1 with a solution containing 0.12 U/μl RNase H and 200 μM DNA oligonucleotide (AC3, see Supplementary Table S4 ) in 5 mM Tris–HCl (pH 8.0), 20 mM MgCl2, 100 mM KCl, 50 μM EDTA and 10 mM β-mercaptoethanol at 37°C for 15 s. Reactions were stopped with denaturing buffer containing 95% formamide, 10 mM EDTA and 0.1% SDS.

Cotranscriptional and post-transcriptional TPP binding analysis was performed by adding TPP either at the beginning (cotranscriptionally) or after the transcription reaction (post-transcriptionally), which was stopped through the addition of heparin. In both cases, samples were taken at various time points and treated with RNase H for 15 s and stopped by adding the denaturing buffer. Ligand binding analysis assumed a 1:1 stoichiometry between the aptamer and TPP, consistent with in-line probing data ( 13) and crystal structure ( 18, 22, 23). The fitting was done using a single exponential decay to yield the pseudo-first order rate of ligand binding.

Rho binding monitored using RNase H assays

Using a DNA template corresponding to the first 400 nt of thiM mRNA, transcripts were prepared in the absence of Rho, as described in the section ‘Rho-dependent transcription termination assays.’ After transcription was complete, the mixture was filtered twice through a G50 column to remove free nucleotides. Purified transcripts were then incubated in presence of 70 nM Rho for 5 min at 37°C. The resulting mixture was incubated with a solution containing 10 μM of a DNA oligonucleotide (130 or 201, see Supplementary Table S4 ) and 0.12 U/μl RNase H in 5 mM Tris–HCl (pH 8.0), 20 mM MgCl2, 100 mM KCl, 50 μM EDTA and 10 mM β-mercaptoethanol at 37°C for 5 min. Reactions were stopped using 95% formamide, 10 mM EDTA and 0.1% SDS.

Bioinformatic analyses of riboswitch sequences for rut determination

A bash shell script was written to calculate the proportion of cytosines and guanines using riboswitch sequences obtained from public databases. A scanning window of 25 nt was used with a stepping value of 1 nt. The validity of the technique was verified using pgaA, which was shown to be a rut site recognized by Rho ( 24).


Processing generates 3' ends of RNA masking transcription termination events in prokaryotes

Two kinds of signal-dependent transcription termination and RNA release mechanisms have been established in prokaryotes in vitro by: (I) binding of Rho to cytidine-rich nascent RNA [Rho-dependent termination (RDT)], and (ii) the formation of a hairpin structure in the nascent RNA, ending predominantly with uridine residues [Rho-independent termination (RIT)]. As shown here, the two signals act independently of each other and can be regulated (suppressed) by translation-transcription coupling in vivo. When not suppressed, both RIT- and RDT-mediated transcription termination do occur, but ribonucleolytic processing generates defined new 3' ends in the terminated RNA molecules. The actual termination events at the end of transcription units are masked by generation of new processed 3' RNA ends thus the in vivo 3' ends do not define termination sites. We predict generation of 3' ends of mRNA by processing is a common phenomenon in prokaryotes as is the case in eukaryotes.

Keywords: RNA processing gal operon transcription termination translation–transcription coupling.

Declaracion de conflicto de interes

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Cifras

( A ) Schematic representation…

( A ) Representación esquemática del gal operon and the neighboring gpmA…

( A ) The 3′ RACE assay on transcripts generated from in vitro…

( A ) Northern analysis…

( A ) Northern analysis of mM1 and mM2 mRNA from WT, RDT…

( A ) The 3′ RACE assay on transcripts generated from in vitro…

Northern analysis of the full-length…

Northern analysis of the full-length transcripts from the gal operons in WT gal…


PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Bacterial Strains-E. coli

K-12 strain JM109 was used for the construction of plasmids and for en vivo análisis de ssrS transcripción. Plasmid-borne transcripts were analyzed using 6S RNA knock-out strains. MG1655 ssrS::kan was constructed based on the previously described report (21) with a corresponding primer pair ( Table 1 ). The 6S RNA knock-out derivatives of the following endoribonuclease-deficient strains were constructed by employing bacteriophage P1-mediated transduction with MG1655 ssrS::kan as the donor strain (21): GW10 (rne + rng + ), GW11 (rne + rng::cat), GW20 (GW10 rne-1), GW21 (rne-1 rng::cat) for RNase E or/and RNase G (22) SDF204 (rnc + ) and SDF205 (rnc105) for RNase III (23) NHY312 (rnpA + ) and NHY322 (rnpA49) for RNase P (24).

TABLA 1

Oligonucleotides used in this study

CebadorSequence (5′ to 3′)Usar
6SKO_up CCA CAA GAA TGT GGC GCT CCG CGG TTG GTG AGT CAG AAG AAC TCG TCA AG Construction of MG1655 ssrS::kan
6SKO_dn GCA GTT TTA AGG CTT CTC GGA CGG ACC GAG CAT GTA TGG ACA GCA AGC GAA CCG
ssrS-92_F CGG GGA TCC TTA CTT GAA CAA GGT CGC A DNA templates for in vitro transcription ( Figs. 1 , ​ ,2, 2 , and ​ and4) 4 ) or construction of pCAT (ssrS-CAT fusion) plasmids ( Fig. 2 )
ssrS+185_R CCC AAG CTT GGG AAT CTC CGA GAT GCC DNA templates for in vitro transcription ( Fig. 1 ) or construction of pCAT (ssrS-CAT fusion) plasmids ( Fig. 2 )
ssrS+238_R CCC AAG CTT ATA ATG TCA GTG GGA GTT CTG
ssrS+260_R CCC AAG CTT ATT TTG CGG ATT TCT TGT CG
ssrS+330_R CCC AAG CTT CCG GGT AGC GGC TTG
ssrS+348_R CCC AAG CTT CGG GGG ATA AGT CAT CAT
ssrS+448_R CCC AAG CTT ATA CGC GCT TAC CGG CGC
ssrS+548_R CCC AAG CTT GGC TCA TGG ATC TTC AAC CT
ssrS+648_R CCC AAG CTT GCC CAT TCC CAG GCG CTG A
ssrS+748_R CCC AAG CTT CAA CGG GGA GTT TTT CCA C
ssrS+780_R CCC AAG CTT AAC CAC CGC AGG AAG AGG GG
ssrS+848_R CCC AAG CTT GAA TCA ACG ATG TCA ATC AG
ssrS+931_R CCC AAG CTT CTC ATA AGT TTC AGC GCT TA
ssrS+1040_R CCC AAG CTT TTA CGA TGG CAG GGC AGC AT
ssrS+781_F CGC GGA TCC ACA CCG TCG AAA GTC TGG GA
cat_R ACG GTG GTA TAT CCA GTG AT DNA templates for in vitro transcription ( Fig. 4 )
a6S+185 GGG AAT CTC CGA GAT GCC GCC Anti-6S RNA probe or DNA templates for in vitro transcription ( Figs. 3 , ​ ,4, 4 , and ​ and6 6 )
atRNA_arg ACC TGT ACT CTA TCC AAC Anti-tRNA Arg probe ( Fig. 3 )
tRNA_F TAC AAG CTT GCG CTC GTA GCT CAG Construction of ssrS-tRNA Arg -CAT fusion plasmids ( Fig. 3 )
tRNA_R TAT AAG CTT TGG TGC GCC CGG CGG
TyrT_F GCG TCT TTG TTT ACG GTA ATC G tyrT template for in vitro transcription ( Fig. 4 )
TyrT_R GAT TCG TTT GAG AAT TCC GGG G
ERIT76S CGG AAT TCT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAT TTC TCT GAG ATG TTC DNA templates for in vitro transcription ( Fig. 4 )
ARrho1_F GGG GAC GTC ATT CAT AGT GGT GTG AGT TCT TAA ACT TGG AGT ACG TAA AAA CCC Construction of anti-rho expression plasmid ( Fig. 5 )
pnMTXbaI_R GCT CTA GAA AAG CAA AAA CCC GCC GAA GCG GGT TTT TAC GTA CTC CG
Rho216_R GTA GGA GCT GTC TGC GGA AC Reverse transcription of rho mRNA ( Fig. 5 )
6S+733_R CCA CCA ACT GAC AAT CAT GC Reverse transcription of ssrS-ygfA dicistronic RNA ( Fig. 5 )
Rho20_F AGA ATA CGC CGG TTT CTG AG RT- or qRT-PCR of rho mRNA ( Fig. 5 )
Rho196_R GGA GGA AAC CAA ATC CAT CC
6S+104_F AAG CCT TAA AAC TGC GAC GA RT- or qRT-PCR of ssrS-ygfA dicistronic RNA ( Fig. 5 )
6S+316_R GTT GAC CCA TTT CCT GCT GT
5S_F TGC CTG GCG GCC GTA GCG CGG RT- or qRT-PCR of 5S RNA ( Fig. 5 )
5S_R ATG CCT GGC AGT TCC CTA CTC TC
Preparation of Total Cellular RNA-E. coli

Overnight cultures grown at 37 ଌ were diluted 1:100 in LB broth containing ampicillin (50 μg/ml) or tetracycline (10 μg/ml) and grown to an A600 of 0.5 at the same temperature. If necessary, IPTG was added to the cell culture at 1 m m of final concentration and the culture was incubated further for 30 min. En el caso de rne-1 o rnpA49 cells, the cells were grown at 30 ଌ and then shifted to 44 ଌ for 1 h. rng::cat cells also treated as above to compare with rne-1 effect even though the strain itself is not temperature-sensitive. Total cellular RNA was isolated by hot phenol extraction as described previously (25).

Northern Blot Analysis

Total cellular RNA (15 μg) was fractionated on a 5% polyacrylamide gel/7 m urea and electrotransferred onto a Hybond-XL membrane (GE Healthcare). 5′-End-radiolabeled oligonucleotides a6S+185 and atRNA_arg ( Table 1 ) used as probes for 6S RNA and Brevibacterium albidum tRNA Arg , respectively. Hybridization was performed according to the manufacturer's instructions. The Northern blots were visualized and quantified using Image Analyzer FLA7000 (Fuji).

In Vitro Transcription by E. coli RNA Polymerase

The linear DNA templates used for in vitro transcription reactions were obtained with chromosomal or plasmid DNA via PCR with corresponding primer pairs ( Table 1 ). Some primers had extra linker sequences at the 5′-end. In vitro transcription reaction was conducted using E. coli Eσ 70 (Epicenter) according to the manufacturers' instructions with minor modifications. Briefly, the DNA templates (6 n m ) were incubated at 37 ଌ for 5 min in reaction buffer (40 m m Tris-HCl, pH 7.5, 150 m m KCl, 10 m m MgCl2, 0.05% Triton X-100, 10 m m DTT) containing Eσ 70 (1 unit) and 2 m m ATP. The reaction was then initiated by adding mixtures containing rNTPs (0.5 m m rGTP, 0.5 m m rUTP, and 0.025 m m rCTP including 10 㯌i of [α- 32 P]CTP) and rRNasin (4 units, Promega). After 25 min, the reactions were terminated by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation. The pellet was resuspended with gel-loading buffer II (Ambion) and loaded on a 5% polyacrylamide/8 m urea sequencing gel. The gel was visualized and analyzed by FLA7000 (Fuji).

Analysis of Transcription from ssrS-P1 Promoter in Vivo

ssrS-P1 promoter-containing DNA fragments (es decir. ranging from nucleotide position � to various downstream bases) were obtained via PCR amplification of genomic DNA with corresponding primer pairs ( Table 1 ). The resulting PCR products were digested with BamHI/HindIII and ligated into pKK232𠄸 (GE Healthcare) to generate pCAT plasmids. Cells containing fusion plasmids were exponentially grown in LB broth (1:300 dilution) of different chloramphenicol concentrations. The IC50 was measured as previously described (26).

Alternatively, a B. albidum tRNA Arg sequence (27) was amplified by PCR with a corresponding primer pair ( Table 1 ) and inserted immediately upstream of the CAT gene in the pCAT plasmids to measure the exogenous amount of tRNA Arg (es decir. as an indicator of transcription activity). Total RNAs isolated from cells containing the exogenous tRNA gene were subjected to Northern blot analysis as described above.

Analysis of Rho-dependent Termination

His-tagged Rho and IcdA (isocitrate dehydrogenase) proteins were purified from cells containing ASKA-rho and ASKA-icdA plasmids, respectively, as previously reported (28). The linear DNA templates were prepared and subjected to in vitro transcription analysis as described above except that Rho, or IcdA protein as a control, was added at 40 n m .

Gel Mobility Shift Assay

DNA templates for in vitro transcription of 6S RNA and precursor 6S RNA carrying the downstream sequence to +330 were obtained via PCR using pCAT330 DNA with primer pairs of ERIT76S/a6S+185 and ERIT76S/cat_R ( Table 1 ), respectively. In vitro transcription was carried out using T7 RNA polymerase (Promega). Gel-purified 6S RNA and precursor 6S RNA were 5′-end labeled with [γ- 32 P]ATP and re-purified by gel elution. Labeled RNAs (2 n m ) were incubated with the purified Rho protein in 10 μl of binding buffer (10 m m Tris-HCl, pH 8.0, 1 m m MgCl, 1 m m DTT, 100 m m NaCl, 0.06% Triton X-100, 0.25% glycerol, 10 μg of ytRNA) for 15 min at 25 ଌ. The reaction mixtures were then analyzed on 5% polyacrylamide gels, as described previously (20).

3′-RACE Assay

3′ RACE analysis was performed on the in vitro transcribed RNAs in the presence of Rho protein with the ssrS-containing DNA ranging from � to +448 as previously described (29), with following modifications. The Adaptor-ligated RNA was reverse transcribed and PCR amplified using a One-Step RT-PCR PreMix kit (Intron) according to the manufacturer's instructions. The PCR products were separated on a 2% agarose gel, purified, and analyzed by DNA sequencing after cloning into a pGEM-T-easy vector (Promega).

Analysis of Rho-knockdown Effects on ygfA Expression

Plasmid pAKA (20), a derivative of pACYC184, was used to construct an anti-rho RNA expression plasmid. El antirho RNA sequence linked to the rnpB terminator was amplified with a primer pair of ARrho1_F/pnMTXbaI_R by PCR and cloned into the AatII/EcoRI sites of pAKA so that anti-rho RNA could be induced by IPTG. Total RNAs were isolated from cells containing the anti-rho RNA expression plasmid pARRho after the IPTG induction for 30 min as described above, and treated with Turbo DNase (Ambion) to remove contaminating DNA. DNase was heat-inactivated and RNA samples were subjected to reverse transcription with MMLV RT (Enzynomics) with primers Rho216_R for rho mRNA, 6S+733_R for ssrS-ygfA dicistronic RNA, and 5S_R for 5S rRNA. The resulting cDNAs were amplified using Taq polymerase premix (Solgent) with primer pairs Rho20_F/Rho196_R for rho mRNA, 6S+104_F/6S+316_R for ssrS-ygfA dicistronic transcripts, and 5S_F/5S_R for 5S rRNA. The primers used were listed in Table 1 . The PCR products were electrophoresed on 2% agarose gels, stained by SYBR Safe (Invitrogen), and photographed by GelDoc 1000 (Bio-Rad). Quantitative real-time RT-PCR was done by ABI 7500 Real-time PCR (Applied Biosystems) with QuantiTect SYBR Green PCR premix kit (Qiagen) in triplicate experiments. The abundance of each RNA was normalized to the amount of 5S RNA and represented as a fold change. Data were analyzed using ABI 7500 SDS software (Applied Biosystems, ver. 1.3). The cycle threshold (CT) values obtained were an average of the triplicates.


Fondo

Rho-independent (also known as intrinsic) terminators are sequence motifs found in many prokaryotes that cause the transcription of DNA to RNA to stop. These termination signals typically consist of a short, often GC-rich hairpin followed by a sequence enriched in thymine residues [1]. The importance of Rho-independent termination varies across bacteria. In some bacteria, such as Escherichia coli, a large fraction of termination is mediated by the Rho protein or its homologs (reviewed in [2]). In others, such as Bacillus subtilis, Rho homologs play a smaller role, and Rho-independent termination is the norm.

Detection of transcription termination sites is key to understanding the operon structure of bacterial genomes. Understanding the operons, in turn, gives us strong hints about gene function. Computational detection of termination signals is the only practical means of identifying large numbers of terminators today, and few experimentally verified terminators exist outside of B. subtilis y E. coli. Several previous computational methods [3, 4] have relied on simple decision boundaries to separate terminators from non-terminators after training on experimentally known terminating and non-terminating sequences. Other studies have considered only the hairpin portion of potential terminators [5, 6]. Due to lack of sequence data, previous systems (for example, [4, 7]) have tended to focus on E. coli or on only a portion of the now-available genomes.

We describe here TransTermHP, a computational method for the rapid and accurate detection of these signals in genomic DNA. TransTermHP searches genomic DNA for terminators and assigns each candidate terminator a score related to the likelihood that it arose by chance. We assess sensitivity and specificity of our predictions using a set of experimentally verified operons [3]. Our method achieves accuracy comparable with a recent method [3] while at the same time being much faster and not dependent on a training set of known terminators.

A previous system [8] by one of the authors of the current study predicted terminators within intergenic regions by contrasting candidates with terminator-like structures that occur within genes. Since the intragenic sequences were used as a background signal, the system could not assign scores to structures inside genes and its scores depended on the distribution of relatively rare terminator-like sequences inside genes. TransTermHP uses a completely new, more general model of background signal and a new scoring function that makes it less sensitive to the accuracy of the genome annotation. TransTermHP is built around a new search algorithm that employs dynamic programming to search genomes ten times faster than the system of Ermolaeva et al. [8] and hundreds of times faster than the method of de Hoon et al. [3]. The algorithm can scan a 4 megabase genome in under 50 seconds on a single commodity processor.

Using the accuracy and speed of the new method we have made predictions of Rho-independent terminators for 343 bacterial and archaeal genomes (comprising the complete collection of finished prokaryotic genomes available from GenBank). These predictions are available on the web and represent the largest and most varied collection of putative terminators available to date.

A recent paper [3] considered Rho-independent terminators in the Firmicutes division of bacteria extensively and found within them a large number of intrinsic termination signals, a finding we corroborate. Outside the Firmicutes, we find that 15 organisms (from the Neisseria, Vibrio, y Psychrobacter genera, the Pasteurellaceae, as well as Pseudoalteromonas haloplanktis, Desulfovibrio desulfuricans, y Fusobacterium nucleatum) also appear to employ intrinsic termination for a large fraction of their termination signals.

It has been noted [9–11] for some organisms in the Neisseria genus and the Pasteurellaceae that transcription terminators often include DNA uptake signal sequences (USSs). These uptake signals are short (approximately 9-11 nucleotides (nt)), highly conserved sequences that occur repeatedly (generally ≥ 1,000 times) in a bacterial genome and that facilitate the incorporation of exogenous DNA into the cells of naturally transformable bacteria (see [12, 13] for reviews). Many of the termination signals predicted by TransTermHP in these organisms include USS motifs within their hairpins. We expand past analysis of this phenomenon to additional organisms and present evidence that this is not an artifact of the prediction method nor a result of some other preference for a hairpin configuration of USS sites: these organisms appear to have co-opted the uptake signals for use in transcription termination. In addition, we propose a new USS motif for H. ducreyi that has been overlooked by previous studies. Finally, we discuss a bias in the configuration of USS motifs that form hairpins.


The NUN termination protein of phage HK022

The NUT sites and the Nus factors also participate in a transcription termination reaction promoted by the 109 amino acids Nun protein of the lambdoid phage, HK022 ( Robert et al. 1987 Hung & Gottesman 1997 ). The N-terminal ARM of Nun resembles that of N and binds λ BOXB ( Chattopadhyay et al. 1995). The structure of the Nun/BOXB complex has recently been solved by NMR spectroscopy ( Faber et al. 2001). The complex of Nun (20–44) with BOXB is very similar to the N peptide/BOXB complex. Both proteins form a bent α-helix upon binding to BOXB. However, Nun amino acids Leu-22, Ile-30, Trp-33, Ile-37 and Leu-41 form a hydrophobic surface which is not present in N (1–36) bound to BOXB. This surface could be a recognition site for host factors.

The C-terminal domain is distinct from that of N. Coordination of zinc to three histidine residues in the C-terminus inhibits RNA binding by the N-terminal domain ( Watnick et al. 2000). Cross-linking experiments indicate that the Nun C-terminus makes Zn 2+ -dependent intramolecular contacts ( Watnick & Gottesman 1999 ). In vitro, NusA interacts with the C-terminus and stimulates the association of Nun with RNA. A mutation in nusA (E136K) blocks Nun activity en vivo ( Robledo et al. 1991 ). However, Nun is fully active in a nusA deletion strain, suggesting that nusAE136K is a gain-of-function mutation (R. Washburn & M.E. Gottesman, unpublished data). Clearly, NusA is required neither for unmasking of the Nun ARM nor for any subsequent step in the Nun termination reaction. The C-terminus also interacts with RNAP and blocks translocation without affecting the active centre of the polymerase ( Hung & Gottesman 1997 ). Nun tagged with a cross-linking reagent at the C-terminus reacts with DNA template in a paused TEC. A C-terminal Cu-phenanthroline group linked to the C-terminus cleaves the DNA template just promoter-distal to RNAP. These interactions with DNA depend upon a Trp residue at residue 108. Substitution of Trp with Ala or Leu blocks transcription arrest, whereas a Tyr substitution is innocuous. Wild-type Nun fails to arrest transcription on single-stranded templates. Thus, Nun inhibition of transcription elongation could be due in part to interactions between the C-terminal trp of Nun and double-stranded DNA, possibly by intercalation. Nun may arrest transcription by anchoring RNAP to the DNA (Fig. 4).

Model for transcription arrest by Nun. The NH2-terminal ARM motif of Nun interacts with BOXB, tethering Nun in proximity to the TEC. Histidine residues in the carboxy-terminal region permit Nun to contact RNAP in a Zn 2+ -dependent manner. The carboxy-terminus contacts DNA, possibly by intercalation of the penultimate tryptophane residue into the DNA template. The arrested complex is released by MFD in the presence of ATP.

Although Nun induces transcription arrest in a purified in vitro system, its activity en vivo appears to be true termination ( Robert et al. 1987 Sloan & Weisberg 1993 ). los E. coli MFD protein appears to be responsible for the dissociation of the arrested TEC. En vivo, MFD releases the TEC stalled at sites of UV damage and recruits UV repair functions to those sites. En B. subtilis, MFD displaces RNA polymerase stalled at downstream sites that function as transcriptional roadblocks, indicating a broader role for this function in transcription termination ( Zalieckas et al. 1998 ).

In vitro, MFD dissociates TEC stalled at any position along the template in ATP-dependant manner ( Selby & Sancar 1995a,b E. Nudler, unpublished results R. Washburn & M. Gottesman, unpublished results). MFD releases the Nun-arrested TEC. Furthermore, an mfd mutation enhances Nun activity en vivo (R. Washburn & M. Gottesman, unpublished results).


FOUR-CHOICE ASSOCIATION

If the word or phrase is associated only with A.

If the word or phrase is associated only with B.

If the word or phrase is associated with A and B.

Region I of the gel in Fig. 1 B.

____ Contains RNA a in sample 1.

____ Contains RNA a in sample 4.

____ Contains the plasmid in sample 2.

____ Contains the plasmid in sample 5.

____ Contains RNA polymerase in sample 7.

____ Contains RNA polymerase in sample 8.

____ Contains the Rho protein in sample 3.


Ver el vídeo: Transcripción del ADN Paso a Paso (Diciembre 2022).