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¿Qué es el miARN análogo?

¿Qué es el miARN análogo?


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Entiendo lo que son los miARN, pero no estoy seguro de lo que significa afín. Al mirar esta publicación, parece que un miARN análogo es un conocido miARN frente a un miARN recientemente descubierto / posible. ¿Está pensando en el camino correcto?


El uso de la palabra cognado en biología molecular refleja la definición adjetival 2 de Léxico:

2 formal Relacionado; conectado.
'materias afines como la física y la química'

El ejemplo dado muestra que esto se puede utilizar en el sentido más general de relacionado, por lo que no hay ningún requisito de algún antecedente común como sustituto de una madre o un antepasado humano.

Específicamente hay no implicación de la participación de una secuencia de ADN común, como en la respuesta de @Dirigible, ni el de un origen común como se invoca en una respuesta anterior sobre este tema.

Esto es bastante claro si se considera el uso mucho anterior de cognado en biología molecular en relación con un codón de ARNm y los anticodones de ARNt que pueden reconocerlo, o un ARNt y una aminoacil ARNt sintetasa que pueden aminoacilarlo.

En cuanto al uso con microARN está preocupado, un ARNm análogo es aquel con el que el miARN puede interactuar por emparejamiento de bases, ni más ni menos.


MicroARN

3 Organización genética, variación en microARN y expresión específica de tejido de microARN

Los microARN (miARN) se someten a múltiples eventos de procesamiento para alcanzar su secuencia funcional de ARN de ribonucleótidos 21-23. Los miARN canónicos se generan a partir de unidades transcripcionales que codifican proteínas, mientras que otros miARN (es decir, miARN no canónicos) se generan a partir de unidades transcripcionales que no codifican proteínas. En ambos casos, los miARN pueden ubicarse dentro de regiones intrónicas o exónicas. Una distinción mecanicista notable en miARN canónicos versus no canónicos es que los miARN intrónicos canónicos son dependientes de Drosha y, por lo tanto, se procesan cotranscripcionalmente con transcripciones que codifican proteínas en el núcleo. El premiRNA luego entra en la ruta de miRNA, mientras que el resto de la transcripción sufre un corte y empalme de premRNA para producir mRNA maduro que luego dirigirá la síntesis de proteínas. Los ARN pequeños intrónicos no canónicos (también llamados mirtrones) pueden derivar de pequeños intrones que se asemejan a los premiARN y evitan el paso de procesamiento de Drosha [11]. Los miARN tienden a organizarse en un grupo relacionado y también tienden a dirigirse a múltiples transcripciones de ARNm dentro de vías de respuesta celular comunes (por ejemplo, proliferación, apoptosis). Esta temática organizacional proporciona a los clústeres de miR la capacidad de coordinar la regulación de múltiples pasos dentro de una vía, brindando una oportunidad para un control regulatorio complejo y adaptativo de vías completas. Una clase interesante de miARN son los myomiR, llamados así porque están codificados dentro de los genes de la cadena pesada de miosina (MYH). myomiRs se transcriben en el mismo mRNA precursor que el gen MYH parental [4]. De especial interés es el myomiR-499, que a pesar de la ausencia de un ARNm original, es uno de los miARN más expresados ​​en el tejido cardíaco. En un fenómeno evolutivo aparentemente novedoso, el empalme alternativo en el corazón desacopla la producción de miR-499 maduro de la expresión del ARNm de MYH7b original, lo que significa que el ARNm quizás ha evolucionado a un ARNm del huésped no funcional para su miR intrónico (es decir, miR-499).

Los estudios comparativos que evalúan la estructura organizativa del genoma de los mamíferos han identificado una gran cantidad de inserciones-deleciones cromosómicas, variantes del número de copias y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) que, según el contexto ambiental, contribuyen a la variación genética que puede subyacer a la diversidad fenotípica. Esta diversidad es evidente en casi todos los aspectos de la salud y las enfermedades humanas que se han investigado. Quizás no sea sorprendente que ahora se reconozca cada vez más que la variación en los miARN y sus genes diana también contribuyen a esta variabilidad fenotípica. Varias neoplasias malignas sólidas y hematológicas pueden vincularse a miARN localizados en regiones cromosómicas amplificadas, delecionadas o translocadas en el genoma de los mamíferos [12]. La variación en la expresión y regulación génica probablemente esté influenciada por variantes genéticas en cis- y transSNP que actúan (también conocidos como loci de rasgos cuantitativos de expresión) [13]. Una observación interesante de la unión de miARN es su capacidad para reconocer el polimorfismo del sitio de unión (miRSNP) en genes funcionales transcritos. Por ejemplo, el miR-24 parece estar desregulado en un tumor colorrectal humano a través de un polimorfismo del sitio diana en el gen de la dihidrofolato reductasa. En otro ejemplo, un polimorfismo dentro del gen de la miostatina crea un sitio diana para miR-1 y miR-206, que están altamente expresados ​​en el músculo esquelético. La unión de estos miR al polimorfismo en la miostatina provoca una inhibición de la traducción de las transcripciones de la miostatina y puede fenocopiar la hipertrofia muscular observada que se observa con los knockouts genéticos del gen de la miostatina [14]. Dadas las diferencias significativas en la expresión génica y la variación genética entre las poblaciones humanas, es probable que el análisis del papel de los miARN en la contribución a las diferencias poblacionales en la expresión génica proporcione conocimientos sustanciales sobre las disparidades de salud basadas en la población y las funcionalidades físicas [13]. De hecho, los estudios genómicos comparativos indican que las secuencias de ARNm diana para los miARN: regiones no traducidas (UTR) en los ARNm a menudo muestran diversidad de secuencias. Esto puede sugerir una evolución adaptativa de miRNA coexpresados ​​y mRNA afines con estas variantes de UTR. Dependiendo de si la amortiguación de la producción de proteínas es beneficiosa, intrascendente o dañina, los sitios UTR pueden conservarse selectivamente, neutralizarse o evitarse durante la coevolución de miARN: ARNm [1].

Los estudios que evalúan la expresión específica de tejido de miARN ilustran una característica de “regulación cruzada” de los miARN que contribuye a la especificación del destino celular reprimiendo destinos celulares alternativos para facilitar el compromiso con el destino de una célula y mantener la estabilidad de un fenotipo diferenciado [15]. Por ejemplo, los myomiRs miR-1, miR-133, miR-206, miR-208, miR-486 y miR-499 están enriquecidos en músculo esquelético y juegan un papel crucial en el desarrollo, crecimiento y mantenimiento del músculo esquelético [16 ]. En particular, miR-133 previene la diferenciación del linaje celular osteogénico al reprimir Runx2, un factor esencial para la formación de hueso [15]. MiR-7, miR-24, miR-128, miR-134, miR-219 y otros están altamente expresados ​​en el cerebro de los mamíferos y regulan el crecimiento de neuritas, la diferenciación neuronal y el tamaño de la columna dendrítica [17]. Los miARN enriquecidos regionalmente en tejidos específicos pueden ejercer una función especializada. Por ejemplo, miR-7 y miR-24 están altamente expresados ​​en el hipotálamo y la expresión de ajuste fino de Fos y oxitocina, que desempeñan funciones vitales en el control del agua, la lactancia y el parto [18].


Biogénesis dependiente de la diana de microARN afines en células humanas

Una amplia investigación ha establecido cómo los miARN regulan los ARNm diana mediante la represión de la traducción y / o la degradación endonucleolítica en metazoos. Sin embargo, la información relacionada con el efecto del ARNm diana sobre la biogénesis y la estabilidad de los miARN correspondientes en animales es limitada. Aquí informamos sobre la biogénesis regulada de los miARN afines por sus ARNm diana. El procesamiento mejorado de pre-miRNA por DICER1 asociado a AGO contribuye a esta mayor formación de miRNP. Los miARN procesados ​​se cargan en AGO2 para formar miRISC funcionalmente competentes tanto in vivo como en un sistema in vitro sin células. Por lo tanto, identificamos una capa adicional de regulación postranscripcional que ayuda a la célula a mantener los niveles requeridos de formas maduras de los respectivos miARN modulando su procesamiento de una manera dependiente del objetivo, un proceso que ocurre para el miR-122 durante la reversión del estrés en las células hepáticas humanas.

Declaracion de conflicto de interes

Los autores declararon no tener conflicto de intereses.

Cifras

Figura 1. Reversión del estrés inducido por la inanición de aminoácidos ...

Figura 1. La reversión del estrés inducido por la inanición de aminoácidos aumenta la biogénesis de miR-122 en las células Huh7.

Figura 2. Aumento dependiente del ARNm diana de maduros…

Figura 2. Aumento dependiente de ARNm diana de miR-122 maduro en células humanas.

Figura 3. Efecto de la concentración de ARNm objetivo ...

Figura 3. Efecto de la concentración de ARNm diana sobre el aumento de miARN dependiente de sustrato en células humanas.

Figura 4. El ARNm objetivo impulsa una mayor biogénesis ...

Figura 4. El ARNm diana impulsa una mayor biogénesis de miARN maduro a partir de pre-miARN.

Figura 5. Mayor actividad de DICER1 asociado a AGO2 ...

Figura 5. El aumento de la actividad de DICER1 asociado a AGO2 contribuye a la producción de miARN dirigida por ARNm diana.

Figura 6. Mayor procesividad de DICER1 asociado a AGO2…

Figura 6. Procesamiento aumentado de DICER1 asociado a AGO2 en presencia de ARNm diana.


Tendencias en el desarrollo de herramientas bioinformáticas de miARN

Los microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes que regulan la expresión génica mediante el reconocimiento de secuencias afines y la interferencia de procesos transcripcionales, de traducción o epigenéticos. Las herramientas bioinformáticas desarrolladas para el estudio de miARN incluyen las de predicción y descubrimiento de miARN, estructura, análisis y predicción de objetivos. Seleccionamos manualmente 95 artículos de revisión y ∼1000 herramientas bioinformáticas de miARN publicadas desde 2003. Las clasificamos y clasificamos según el número de cita o la puntuación de PageRank, y luego realizamos análisis de red y minería de texto (TM) para estudiar las tendencias de desarrollo de herramientas de miARN. Se observaron cinco tendencias clave: (1) la identificación de miARN y la predicción de objetivos han sido puntos calientes en la última década (2) la curación manual y la MT son los principales métodos para recopilar conocimiento de miARN de la literatura (3) la mayoría de las herramientas tempranas están bien mantenidas y ampliamente utilizados (4) los métodos clásicos de aprendizaje automático conservan su utilidad, sin embargo, han comenzado a surgir nuevos (5) están surgiendo herramientas de miARN asociadas a enfermedades. Nuestro análisis arroja información significativa sobre el desarrollo pasado y las direcciones futuras de las herramientas de miARN.

Palabras clave: herramientas de bioinformática bibliométrica clasificación de miARN minería de textos.

© The Author (s) 2018. Publicado por Oxford University Press.

Cifras

Biogénesis de miARN de animal / planta y…

Biogénesis de miARN de animales / plantas y herramientas bioinformáticas asociadas a cada proceso. El canónico ...

Línea de tiempo histórica de miARN ...

Cronología histórica de la investigación de miARN. El desarrollo de aspectos experimentales y computacionales ...

Flujo de trabajo de análisis de miARN estandarizado y ...

Flujo de trabajo de análisis de miARN estandarizado y ejemplos de herramientas asociadas. El panel izquierdo con…

Gráfico circular de identificación de miARN ...

Gráfico circular de identificación de miARN y predicción de miARN objetivo mencionado en revisiones desde…

Estadística de herramientas de miARN. Línea…

Estadística de herramientas de miARN. Gráfico de líneas: el número de publicaciones de bioinformática relacionada con ncRNA ...

Estadísticas de etiquetas de las herramientas de miARN ...

Estadísticas de etiquetas de herramientas de miARN basadas en miRToolsGallery. Mapa de calor para las etiquetas principales…

Nube de palabras basada en la literatura ...

Nube de palabras basada en la literatura de cada año. Se generó la nube de palabras ...

Red de interacción de herramientas ncRNA. Los…

Red de interacción de herramientas de ARNc. La red de la izquierda se basó en la publicación de la herramienta ...


Discusión

RIP y mRNP

Usamos RIP junto con NanoString o secuenciación de alto rendimiento para examinar mRNP endógenos. Una ventaja de este enfoque es que permite la investigación de ARNm y proteínas de unión a ARN expresadas a partir de sus loci endógenos y, al hacerlo, evita la sobreexpresión del ARNm o de los componentes proteicos de los ARNm. La sobreexpresión puede conducir a una unión falsa y, por tanto, a una definición cuantitativa y cualitativa incorrecta de los componentes de mRNP en relación con la situación endógena en las células [75].

A pesar de estas ventajas, el protocolo RIP incluye la incubación y lavados in vitro que podrían perturbar la ocupación nativa de algunas proteínas de unión al ARN. Aunque modificamos el protocolo para minimizar la duración de la incubación in vitro, porque no pudimos eliminarlo por completo, los resultados que informamos son para interacciones que fueron lo suficientemente estables para sobrevivir a estos pasos. Por lo tanto, cualquier cambio en la estabilidad de las interacciones dentro de un mRNP podría haber contribuido, al menos en parte, a nuestros cambios observados en la ocupación aparente. Por ejemplo, la ocupación aparente podría haberse inflado si la remodelación de un mRNP añadiera interacciones que redujeran la tasa de disociación in vitro de la proteína inmunoprecipitada. No obstante, el aumento de la estabilidad de una interacción a menudo va de la mano con el aumento de su ocupación y, en cualquier caso, el resultado reflejaría un cambio en el mRNP nativo. En general, la correspondencia entre nuestros resultados y los de enfoques anteriores para estudiar la regulación mediada por miARN confirmó la utilidad de nuestro enfoque, extendió algunos de esos resultados previos a los ARNm endógenos y proporcionó una nueva perspectiva tanto de la represión mediada por miARN como de la organización del ARNm de manera más general. .

MRNP en la represión mediada por miRNA

La asociación con eIF4E, eIF4G y PABP es un sello distintivo de los mRNP citoplasmáticos estables y translacionalmente competentes, y una variedad de estudios basados ​​en reporteros implican a la represión mediada por miARN en la alteración de la asociación con estos factores clave [38, 47, 50, 51]. Con estos resultados en mente, el agotamiento del ARNm unido a PABP dependiente de miARN, medido usando PABP RIP-seq, se ha utilizado para identificar objetivos de miARN en células humanas, aunque esto se hizo sin distinguir el agotamiento causado por la menor ocupación de PABP del agotamiento causado por Desestabilización del ARNm [55]. Nuestro estudio ha extendido estos resultados a los mRNP endógenos en una escala de todo el transcriptoma, mostrando que incluso después de tener en cuenta los cambios en la abundancia de ARN, la pérdida de PABP y eIF4G es generalizada durante la represión mediada por miARN, a pesar de la naturaleza intrínsecamente dinámica y diversa de los mRNP. . Los mRNP remodelados que perdieron PABP y eIF4G fueron presumiblemente incapaces de apoyar el inicio de la traducción, de acuerdo con los informes de la importancia del complejo eIF4F en la represión traduccional mediada por miARN [49, 51].

A pesar de la disociación mediada por miARN fácilmente detectable de PABP y eIF4G, no pudimos detectar la disociación mediada por miARN de eIF4E, que podría ser una consecuencia de los ARNm dirigidos a miARN que han perdido eIF4E y se han degradado demasiado rápido para ser detectados por nuestro métodos. Esta interpretación se ve desafiada por los resultados de nuestro análisis de todo el transcriptoma de la unión de eIF4E, que reveló un rango de ocupaciones de eIF4E que abarcó & gt 100 veces (Fig. 5a), lo que implica que muchos ARNm que carecen de eIF4E unido no se decapan y degradan inmediatamente. Proponemos que la solución a esta aparente paradoja se basa directamente en el contexto de mRNP, que la disociación de eIF4E podría tener consecuencias muy diferentes para algunos mRNA en comparación con otros. En este modelo, la disociación de eIF4E es necesaria para el decapitado [17], pero no es suficiente, y las alteraciones adicionales de mRNP asociadas con el direccionamiento de miRNA favorecerían tanto el decapitado como la degradación. Tales alteraciones podrían incluir la disociación de PABP, el acortamiento de la cola de poli (A) o el reclutamiento de factores de desintegración [4], cada uno de los cuales se ha observado durante la represión mediada por miARN en el presente estudio (Figuras 1 y 2) también. como informes anteriores [30, 38, 47].

Con respecto a los factores de desintegración que predisponen a los ARNm para el desencadenamiento, un candidato superior es DDX6. Esta proteína interactúa con el complejo de descascarado a través de proteínas adaptadoras [39, 45] y está implicada en la represión de los reporteros mediada por miARN [41, 43, 44]. Además, descubrimos que DDX6 se recluta para muchos ARNm endógenos a medida que se convierten en el objetivo de los miARN y que DDX6 se asocia con muchos ARNm adicionales en descomposición, que presumiblemente no son el objetivo de los miARN. Las transcripciones unidas a DDX6 tienen colas poli (A) que son en promedio significativamente más cortas que las de la población en estado estable, lo que sugiere que el reclutamiento de DDX6 coincide con la deadenilación. Este resultado es consistente con el reclutamiento de DDX6 por el complejo CCR4-NOT deadenilasa a través de una interacción directa con CNOT1 [41, 43, 44]. No obstante, nuestro análisis de las longitudes de las colas de poli (A) en los ARNm que contienen el sitio de miARN indica que el reclutamiento corriente abajo de DDX6 es ampliamente similar en presencia y ausencia del miARN afín. Juntos, nuestros resultados apoyan un modelo en el que la represión mediada por miARN conduce al reclutamiento del complejo CCR4-NO deadenilasa a través de interacciones directas con TNRC6 [31, 37] y, una vez que se ha reclutado la deadenilasa, la densa red de interacciones entre ARNm Los factores de desintegración conducen a la destrucción final de la transcripción a través de mecanismos que también actúan sobre muchos otros ARNm y, por lo tanto, no están directamente orquestados por la maquinaria de miARN [42, 61].

Organización de mRNP: PABP y la cola de poli (A)

La PABP ha sido reconocida durante mucho tiempo como un factor crítico para la regulación postranscripcional y es esencial para la capacidad de la cola poli (A) para estabilizar las transcripciones. De acuerdo con esta comprensión, nuestros resultados han demostrado que una mayor ocupación de PABP se correlaciona con una mayor traducibilidad y estabilidad del ARNm. Se ha pensado durante mucho tiempo que la cola de poli (A) es fundamental en la regulación postranscripcional, con colas más largas que conducen a una mayor estabilidad y traducción a través de su capacidad para unir más PABP. Sin embargo, inesperadamente, encontramos una falta de correlación entre la ocupación de PABP y la longitud de la cola de poli (A), lo que sugiere que la relación entre la longitud de la cola de poli (A) y la unión de PABP es más compleja de lo que se pensaba anteriormente. De hecho, aunque entre las transcripciones derivadas del mismo gen, la ocupación de PABP se redujo algo para los ARNm con las colas más cortas, las diferencias en la longitud media de la cola de poli (A) no pudieron explicar las diferencias en la ocupación de PABP observadas para las transcripciones de diferentes genes. Por lo tanto, aunque PABP podría ser fundamental para señalar la presencia de una cola de poli (A), tanto en líneas celulares humanas como de mosca y en levaduras, PABP parece ser un "lector" muy pobre de la longitud de la cola de poli (A).

Estudios recientes han demostrado que, en contextos distintos de los ovocitos y los embriones tempranos, la longitud de la cola de poli (A) en estado estacionario no se correlaciona ni con la estabilidad del ARNm ni con la eficiencia de traducción del ARNm [36, 76].Estos resultados anteriores ahora pueden reconciliarse con las funciones conocidas de PABP en la promoción de la estabilidad y traducción del ARNm [15, 16, 77], ya que aquí hemos demostrado que las diferencias en la longitud de la cola de poli (A) en estado estable no necesariamente causan diferencias en la ocupación de PABP.

Nuestros resultados también han demostrado que la densidad de PABP a lo largo de las colas poli (A) puede diferir sustancialmente para los ARNm de diferentes genes. Por ejemplo, los ARNm de las proteínas ribosómicas tienen colas poli (A) muy cortas pero una ocupación de PABP muy alta. Aunque nuestro enfoque actual no puede determinar el número absoluto de PABP unidos a estos ARNm, nuestros resultados son consistentes con que la densidad de PABP en estas transcripciones es mayor que en otros ARNm. Será interesante explorar esta posibilidad más a fondo y determinar hasta qué punto la densidad de PABP influye en la desadenilación, desencadenamiento y / u otros procesos postranscripcionales.

Entonces, ¿qué podría determinar cuánto PABP está ligado? Nuestros resultados, junto con los de Drosophila extractos [47], muestran que la pérdida de PABP mediada por miARN puede ser sólo la punta del iceberg. La interacción entre varios factores reguladores, incluidos los miRNA, y los factores centrales, como eIF4F, pueden determinar la naturaleza y composición de cada mRNP, incluida la ocupación de PABP de sus mRNA constituyentes. Por ejemplo, eIF4G puede influir en la afinidad de PABP in vitro [78] y, por tanto, los eventos en el 5 'UTR podrían tener efectos correspondientes sobre la unión de PABP. Este modelo es coherente con las numerosas interacciones descritas entre la PABP y otros factores reguladores [22, 42, 66, 79]. Las características intrínsecas del ARNm también podrían modular la ocupación de PABP. Por ejemplo, debido a que PABP puede unirse a tramos ricos en AU con alta afinidad [80], la unión diferencial al extremo 3 'de la UTR 3', que puede ser bastante rica en AU, podría influir en la ocupación. Además, debido a que PABP interactúa con el factor de terminación eRF3, la velocidad de traducción o la eficiencia de terminación también podrían tener un impacto en la unión de PABP [81]. Los conocimientos futuros sobre la organización y remodelación de mRNP arrojarán luz adicional sobre las características y factores del mRNA que prevalecen sobre la longitud de la cola para determinar la ocupación de PABP.


Mecanismos de regulación génica mediada por miARN

La mayoría de los estudios hasta la fecha han demostrado que los miRNA se unen a una secuencia específica en la UTR 3 & # x02032 de sus mRNA diana para inducir la represión traduccional y la desadenilación y desencadenamiento del mRNA (40, 41). También se han detectado sitios de unión de miARN en otras regiones de ARNm, incluida la UTR 5 & # x02032 y la secuencia codificante, así como dentro de las regiones promotoras (42). La unión de miARN a 5 & # x02032 UTR y regiones codificantes tiene efectos silenciadores sobre la expresión génica (43, 44) mientras que se ha informado que la interacción de miARN con la región promotora induce la transcripción (45). Sin embargo, se requieren más estudios para comprender completamente la importancia funcional de tal modo de interacción.

Silenciamiento de genes mediado por microARN a través de miRISC

El complejo de silenciamiento mínimo inducido por miARN (miRISC) consiste en la hebra guía y AGO (46). La especificidad diana de miRISC se debe a su interacción con secuencias complementarias en el ARNm diana, llamados elementos de respuesta de miARN (MRE). El grado de complementariedad de MRE determina si hay un corte dependiente de AGO2 del ARNm diana o inhibición de la traducción mediada por miRISC y desintegración del ARNm diana (47). Una interacción miARN: MRE completamente complementaria induce la actividad de la endonucleasa AGO2 y se dirige a la escisión del ARNm (47). Sin embargo, esta interacción desestabiliza la asociación entre AGO y el extremo 3 & # x02032 del miARN promoviendo su degradación (48, 49).

En las células animales, la mayoría de las interacciones miARN: MRE no son completamente complementarias (50). La mayoría de los MRE contienen al menos desajustes centrales con su miARN guía, lo que evita la actividad de la endonucleasa AGO2. En consecuencia, AGO2 actúa como mediador de la interferencia de ARN, similar a los miembros de la familia de AGO no endonucleolíticos (AGO1, 3 y 4 en humanos). En muchos casos, se produce una interacción miARN funcional: MRE a través de la región semilla 5 & # x00027 (nucleótidos 2 & # x020138) (42, 51). Sin embargo, el emparejamiento adicional en el extremo 3 & # x02032 ayuda a la estabilidad y especificidad de la interacción miARN-objetivo (15).

La formación de un complejo miRISC silenciador comienza con el reclutamiento de la familia de proteínas GW182 por miRISC GW182 proporciona el andamiaje necesario para reclutar otras proteínas efectoras (52), como los complejos de poli (A) -deadenilasa PAN2-PAN3 y CCR4-NOT , siguiente miARN: interacción ARNm diana (50, 53). La poli (A) -desdedenilación del ARNm diana es iniciada por PAN2 / 3 y completada por el complejo CCR4-NOT. La interacción entre las repeticiones de triptófano (W) de GW182 y la proteína C de unión a poli (A) (PABPC) promueve la desadenilación eficiente (50). Posteriormente, el desencapsulado tiene lugar facilitado por el desencadenamiento de la proteína 2 (DCP2) y las proteínas asociadas (52), seguido de 5 & # x02032 & # x022123 & # x02032 degradación por exoribonucleasa 1 (XRN1) (54) (Figura 1).

Activación traslacional mediada por microARN

Aunque la mayoría de los estudios se centran en cómo los miARN inhiben la expresión génica, algunos también han informado sobre la regulación positiva de la expresión génica por parte de los miARN. En células hambrientas de suero, AGO2 y otra proteína relacionada con el complejo miARN-proteína (microRNP), la proteína 1 relacionada con el retraso mental frágil x (FXR1), se asociaron con elementos ricos en AU (ARE) en 3 & # x02032 UTR para activar traducción (55). Se encontró que varios miARN, incluido let-7, estaban asociados con AGO2 y FXR1 para activar la traducción durante la detención del ciclo celular, pero inhiben la traducción en células en proliferación (55). También se observó una regulación al alza de la expresión génica por los miARN en células inactivas, como los ovocitos (56, 57). La activación de la traducción mediada por miARN involucra AGO2 y FXR1 en lugar de GW182 (56). Otros ejemplos de activación génica por miARN incluyen la unión a la UTR 5 & # x02032 de los ARNm que codifican proteínas ribosomales durante la inanición de aminoácidos (58), lo que sugiere que la regulación positiva de la expresión génica mediada por miARN se produce en condiciones específicas.

Regulación génica transcripcional y postranscripcional mediada por microARN dentro del núcleo

A través de Importin-8 o Exportin-1, la AGO2 humana viaja entre el núcleo y el citoplasma a través de su interacción con TNRC6A (una proteína de la familia GW182) que contiene una señal de localización y exportación nuclear (59). Se descubrió que miRISC nuclear localizado regula tanto las tasas de transcripción como los niveles postranscripcionales de ARNm (59 & # x0201361) y se asocia con la eucromatina en los loci de genes con transcripción activa (62). Sin embargo, nuestra comprensión de cuándo y cómo los miARN ejercen sus funciones en el núcleo aún es limitada.

Se ha informado que miRISC de bajo peso molecular puede interactuar con los ARNm dentro del núcleo e inducir la degradación del ARNm nuclear, aunque el mecanismo detrás de esto no está claro (59, 61, 63). El enriquecimiento de miRNA en genes transcritos activamente puede sugerir que miRISC interactúa con el mRNA diana co- / post-transcripcionalmente. La participación de AGO y Drosha en el empalme de ARNm (64, 65) respalda aún más las interacciones co-transcripcionales de miRISC: ARNm. miRISC también puede regular la transcripción directamente. Un estudio mostró que AGO2 se concentraba en el núcleo de fibroblastos senescentes e interactuaba con miRISC y retinoblastoma (Rb) para suprimir la transcripción de genes promotores de la proliferación regulados por Rb / E2F. Se observó que let-7f estaba unido a los MRE encontrados en los promotores de dos genes diana E2F, CDCA8 y CDC2, de una manera dependiente de AGO2 (60). Además, un subconjunto de genes unidos al promotor de AGO se reguló positivamente después de la senescencia, y se encontró que AGO2 co-inmunoprecipita con eucromatina (60). Un estudio más reciente de Miao et al. (66) encontraron miR-522 nuclear interactuando con una estructura cruciforme de ADN (un tallo-bucle en cadenas de ADN sentido y antisentido) dentro del promotor de CYP2E1 y suprimiendo su transcripción (66). También se ha demostrado que los miARN interactúan en los loci genómicos, donde se transcribe el ARN derivado del potenciador (eARN), y aumentan los niveles de ARNm de genes adyacentes al promover un estado de cromatina transcripcionalmente activo (67) mientras se alteran los perfiles de empalme alternativos (64). Aún no se ha determinado el papel general de miRISC en la regulación del estado y la estructura de la cromatina y el control transcripcional, pero estos datos actuales sugieren un papel similar al factor de transcripción. También es posible que miRISC participe en el establecimiento de de novo metilación y, por extensión, compactificación de la cromatina en compartimentos nucleares y mediación de la remodelación genómica.


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ARN circulares: formación y función

Como "nuevos niños en el bloque" en la familia del ARN no codificante, los ARN circulares (circRNA) son un gran grupo de moléculas de ARN empalmadas alternativamente de forma única, que son ubicuas entre los eucariotas y están demostrando ser funcionales en una plétora de contextos. Históricamente muy difamado debido a su abundancia relativamente baja y alta diversidad, puede resultar sorprendente que las presentaciones de cinco individuos se centraran predominantemente o exclusivamente en aspectos discretos de la biogénesis, el reconocimiento y la regulación del circRNA. Algunos presentaron funciones de circRNA hasta ahora desconocidas para cualquier ncRNA.

Mariangela Morlando (Universita di Roma, Roma, Italia) demostró que, aunque no están muy extendidos, ciertos ARNcirc no son ARN estrictamente no codificantes en absoluto. Un ejemplo es circ-ZNF609, estos circRNAs retienen sitios de entrada de ribosomas internos endógenos del mRNA afín, lo que permite su traducción en proteína. También identificó un nuevo factor de biogénesis de circRNA, FUS, cuyas mutaciones patogénicas en la esclerosis lateral amiotrófica y el autismo están relacionadas con la formación de circRNA alterada. Gregory Goodall (Centro de Biología del Cáncer, Adelaide, Australia) informó sobre el papel de Quaking, una proteína de unión de ARN que regula la biogénesis de circRNA en la transición epitelio-mesenquimal, un modelo de metástasis del cáncer. Nikolaus Rajewsky (Centro Max Delbrück de Medicina Molecular, Berlín, Alemania) describió cómo la edición del genoma basada en CRISPR-Cas9 podría usarse para eliminar la expresión de un ARNcirc específico del cerebro, CDR1as. Se trata de una "esponja" para el microARN-7 humano (hsamiR-7), que produce ratones con un fenotipo normal pero con respuestas neurológicas levemente alteradas.

Simon Conn (Centro de Biología del Cáncer, Adelaide, Australia) informó de otro hallazgo fundamental al demostrar que los circRNAs se favorecen estequiométricamente para unirse a ciertos objetivos en la célula. Específicamente, las interacciones entre un circRNA de Arabidopsis y su locus de ADN afín a través del emparejamiento de bases complementarias para producir un híbrido de ARN: ADN, o bucle R, es suficiente para promover el corte y empalme alternativo de su ARNm afín, alterando la morfología floral. La capacidad de los circRNA para unirse al ADN fue apoyada por Ingrid Grummt, quien informó que los circRNA, así como otros ncRNA y RNA lineales, se asocian con el ADN sin apareamiento de bases complementarias en los triplex de ADN-ARN. Sin embargo, la hiperestabilidad de los circRNAs significa que son potentes mediadores en cualquier paisaje, particularmente en la cromatina dinámica.

Se ha reconocido desde hace mucho tiempo que los virus de ARN monocatenario, reconocidos como entidades extrañas, pueden impulsar las respuestas inmunitarias del huésped. Sin embargo, el hecho de que los circRNAs sean estructuralmente idénticos llevó al orador inicial Howard Chang (Universidad de Stanford, Stanford, EE. UU.) A pensar que los circRNAs podrían hacer lo mismo. Como lo muestra ChiRP-MS (identificación completa de proteínas de unión de ARN por espectrometría de masas), el reconocimiento de circRNAs propios frente a los no propios depende de su biogénesis y marcado por cofactores proteicos endógenos. Es importante destacar que el uso de circRNAs parece tan eficaz como los adyuvantes de iones metálicos actuales para promover las respuestas inmunitarias a la vacunación y bloquear la transducción viral.

Tomados en conjunto, hemos aprendido mucho sobre los circRNA desde su identificación sistemática por NGS en 2013. Cada vez está más claro que no son subproductos accidentales del empalme. Las charlas resumidas anteriormente brindan información sobre las formas en que los circRNA están involucrados en el neurodesarrollo y la degeneración, el desarrollo de las plantas y el cáncer. Los estudios sobre cómo se genera el circRNA y sus funciones a nivel del organismo seguramente avanzarán rápidamente en los próximos años.


Detección altamente específica de microARN

Para demostrar la especificidad de la cuantificación de miARN Mir-X, utilizamos una serie de 8 variantes de miARN Let7 sintéticas muy similares. Primero agregamos cada uno de los miARN Let7 en muestras separadas de ARN poliA + de levadura y generamos ADNc usando la reacción de un solo tubo Mir-X. Luego probamos un panel de cebadores específicos de variante con cada muestra de ADNc para determinar la capacidad de cada cebador y rsquos para cuantificar específica e individualmente los subtipos Let7 en la muestra de ADNc. A pesar de los altos grados de similitud entre las variantes y los cebadores, Mir-X qPCR fue muy específico en la detección de cada variante de Let7.


Métodos

Cultivo celular y transfecciones

Tanto las células Huh7 como las HEK293 se obtuvieron del laboratorio de Witold Filipowicz. Las células estaban libres de contaminación por micoplasma y se cultivaron en medio DMEM que contenía L ​​-glutamina 2 mM y FCS inactivado por calor al 10% como se describió anteriormente 25,31,33. Todos los reactivos de cultivo celular eran de Life Technologies. Todas las transfecciones de plásmidos se llevaron a cabo con Lipofectamine 2000 y ARNip con RNAiMax (Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante.

En las células HEK293, se transfectó 1 μg de plásmido que codifica el ARNm diana en formato de seis pocillos con 5 pmoles de plásmido que codifica pre-miR-122 (Life Technologies) o 500 ng de pre-miR-122. Cuatrocientos nanogramos de sintético in vitroLos ARNm diana transcritos se transfectaron en un formato de 24 pocillos, a menos que se describa lo contrario. El bloqueo de la transcripción se realizó con 10 μg ml -1 α-Amanitina (Calbiochem). Para los experimentos que utilizan construcciones IRE, se añadió 50 µM de Hemin (Sigma) o 100 µM de DFMO (Calbiochem) al medio de cultivo celular durante el tiempo deseado. Para los experimentos que utilizan construcciones inducibles por tetraciclina, se cultivaron células TET-ON HEK293 con las construcciones de expresión inducible en DMEM suplementado con FCS (Clontech) aprobado por TET al 10% y se llevó a cabo la inducción de la expresión del producto génico respectivo durante los períodos de tiempo indicados utilizando 300 ng ml −1 Doxiciclina (SIGMA) 47.

se transfectaron siDICER1 a una concentración de 30 nM en un formato de 24 pocillos y siCAT-1 a 50 nM en el mismo formato. Se adquirió ARNip de CAT-1 (5'-CCAGCCUUAUAGCUGUUCU-3 ') de Eurogentec. Los ARNip Dharmacon SMARTpool ON-TARGETplus contra DICER1 se adquirieron de Thermo Scientific. Todos los plásmidos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla complementaria 1.

Huh7 hambre y alimentación

Para los experimentos de inanición, las células Huh7 cultivadas en DMEM normal se incubaron en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) suplementada con FCS dializado al 10% durante 4 h, seguido de `` realimentación '' de células con HBSS suplementado con FCS normal al 10% durante 2 horas adicionales. h. Se utilizó HBSS suplementado con un 10% de FCS normal para el control "alimentado".

Ensayo de luciferasa

Las actividades de luciferasa de Renilla (RL) y luciferasa de luciérnaga (FF) se midieron usando un kit de ensayo de luciferasa dual (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante, en un lector de placas VICTOR X3 con inyectores (Perkin Elmer). La relación de los niveles de expresión de luciferasa de Renilla normalizados con luciferasa de luciérnaga para el control y el indicador se utilizó para calcular el número de veces de represión.

En el experimento en el que se utilizaron indicadores objetivo de GFP, se transfectaron células HEK293 en un formato de 24 pocillos con 250 ng de pmiR-122, 100 ng de luciferasa de luciérnaga, 500 ng de GFP-con o GFP-3 × bulge-miR-122 junto con 10 ng del reportero de luciferasa RL-con o RL-3 × bulge-miR-122, o RL-3 × bulge-let-7a (control adicional). Después de 24 h, las células se dividieron y a las 48 h se midió la actividad luciferasa. Se trazaron los valores RL normalizados de Firefly. Para el reportero GFP-3 × bulge-let-7a, se realizaron exactamente las mismas transfecciones con la excepción del reportero GFP-3 × bulge-miR-122.

Aislamiento de ARN y transferencia Northern

El ARN total se aisló usando reactivo TRIzol (Life Technologies). Se aisló ARN pequeño utilizando el kit de aislamiento de miARN mirVANA (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transferencia Northern del ARN celular total (5-10 μg) se realizó según lo descrito por Pillai et al. 48. En resumen, se sometió a electroforesis una cantidad igual de ARN total en Urea-PAGE al 15% seguido de transferencia electroforética a una membrana de nailon. Para la detección, se utilizaron sondas de LNA complementarias de 22 nt miRCURY marcadas con γ32P para miR-122 y let-7a (Exiqon) o sondas de ADN complementarias para miR-16, U6 snRNA. La formación de imágenes de fósforo de las transferencias se realizó en Cyclone Plus Storage Phosphor System (Perkin Elmer). Las versiones sin recortar de todas las transferencias se dan en la Fig.7 complementaria.

PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real (transcriptasa inversa) para ARNm se realizó con Mesa Green qPCR Mastermix Plus para SYBR Assay-Low ROX (Eurogentec) utilizando 100-200 ng del ARN total con los cebadores enumerados en la Tabla complementaria 2. Los endógenos el control utilizado fue ARN ribosómico 18S. Para la cuantificación de miARN se tomaron 30 ng de ARN total. Los siguientes cebadores se utilizaron para las amplificaciones de diferentes miARN. Por ejemplo, let-7a humano (ID de ensayo 000377), miR-122 humano (ID de ensayo 000445), miR-122 * humano (ID de ensayo 002130), miR-16 humano (ID de ensayo 000391), miR-21 humano (ID de ensayo ID 000397), miR-24 humano (ID de ensayo 000402), miR-125b humano (ID de ensayo 000449), snRNA U6 (ID de ensayo 001973) y el sistema de ensayo miARN basado en química Applied Biosystem Taqman se utilizaron para el experimento. Todas las reacciones se realizaron en 7500 Applied Biosystem Real Time System o BIO-RAD CFX96 Real-Time System. Los ciclos se establecieron según el protocolo del fabricante.

Determinación del número de copias

Para determinar el número de copias de miR-122, generamos una curva estándar usando miR-122 sintético purificado con PAGE. Se agregaron 10 6-10 10 moléculas de miR-122 sintético a cinco nanogramos de ARN total de células HEK293 (que no contienen miR-122) y se analizaron mediante PCR en tiempo real utilizando ensayos de miARN Taqman (Life Technologies). No se obtuvo Ct en un control en el que no se añadió miR-122 sintético. Los valores de Ct obtenidos se trazaron para obtener la curva estándar. Los valores de Ct obtenidos de muestras alimentadas, muertas de hambre o realimentadas usando 5 y 25 ng de ARN de Huh7 se convirtieron en número de copias de moléculas usando la curva estándar. Para calcular el número de copias de miR-122 por célula Huh7, determinamos la cantidad total de ARN obtenido por célula Huh7 en condiciones de alimentación, hambre y realimentación generando nuevamente una curva estándar de ARN total frente al número de células Huh7. Para ello, contamos las células usando un hemocitómetro y aislamos el ARN con el reactivo TRIzol y cuantificamos el ARN total usando NanoDrop. Los valores obtenidos fueron los siguientes: 34,69 pg (4 h de alimentación), 21,55 pg (4 h de hambre) y 23,19 pg (2 h de realimentación). Este valor fue bastante consistente con Chang et al. 24 que obtuvieron 25 pg de ARN por célula. El número de copias obtenido por nuestro método basado en tiempo real para Huh7 no hambrientos (alimentados) fue del orden de 10 4 (∼ 1,2 × 10 4). Este fue menor que el obtenido por Siegrist et al. 49, (3 × 10 4) utilizando tecnología de matriz de perlas.

De manera similar, para el ARNm de CAT-1 se generó una curva estándar usando 100 ng de ARN RAW264.7 (línea celular de ratón) enriquecido con 10 6-10 10 moléculas de in vitroARNm de RL-CatA transcrito que contiene Renilla-región codificadora fusionada con el 3′-UTR (bases 2.169-4.646) del ARNm de CAT-1 humano. Un control de RL-catA negativo no produjo amplificación. Se usaron cebadores específicos de 3'-UTR y se usó el mismo conjunto de cebadores para cuantificar CAT-1 a partir de 500 ng de ARN de células Huh7.

Inmunoprecipitación

La inmunoprecipitación de proteínas se realizó esencialmente según los protocolos publicados 25,50. Las células se lisaron en un tampón de lisis [Tris-HCl 20 mM pH 7,4, KCl 200 mM, MgCl 5 mM2, Ditiotreitol (DTT) 1 mM, 1 inhibidor de proteasa sin EDTA (Roche), compuestos de ribonucleósido de vanadilo 5 mM (Sigma), Triton X-100 al 0,5%, desoxicolato de sodio al 0,5%] a 4 ° C durante 15 min, seguido de aclarando el lisado a 3000 gramo durante 10 min. Se bloquearon perlas de agarosa de proteína G (Invitrogen) con BSA al 5% en tampón de lisis durante 1 hora y luego se incubaron con el anticuerpo primario requerido durante otras 3-4 horas antes de agregar el lisato. Se utilizó una dilución final de 1:50 (anticuerpo: lisado) para la inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación se llevó a cabo durante 16 ha 4ºC. Post-lavado con tampón IP (Tris-HCl 20 mM pH 7,4, KCl 150 mM, MgCl 5 mM2, DTT 1 mM, inhibidor de proteasa sin EDTA 1 x (Roche)), las perlas se dividieron en dos mitades: una sometida a aislamiento de ARN con TRIzol LS y otra para transferencia Western.

Inmunotransferencia

La transferencia Western de proteínas se realizó esencialmente como se describió anteriormente 48. Para la inmunotransferencia, los lisados ​​celulares o las proteínas inmunoprecipitadas se sometieron a SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sondaron con anticuerpos específicos. Los anticuerpos utilizados fueron los siguientes: anti-AGO2 (Novus Biologicals Cat # H00027161-M01 1: 1,000), anti-DICER (Bethyl Cat # A301-936A 1: 5,000), anti-HA (Roche Cat # 11867431001 1: 1,000), β-actina (Sigma Cat # A3854 1: 10,000) y fosfo-eIF2α (Cell Signaling Technology Cat # 9721 1: 500). La obtención de imágenes de todas las transferencias de Western se realizó en el sistema UVP BioImager 600 equipado con el software VisionWorks Life Science (UVP) V6.80 y la cuantificación de las bandas se realizó utilizando el mismo software. Las versiones sin recortar de todas las transferencias junto con las posiciones de los marcadores de peso molecular se incluyen en la Fig.7 complementaria.

Aislamiento polisómico

El aislamiento total de polisomas se llevó a cabo como se describe 51. Para el aislamiento total de polisomas, se lisaron alrededor de 6 × 10 6 células HEK293 en un tampón que contenía HEPES 10 mM pH 8.0, KCl 25 mM, MgCl 5 mM2, DTT 1 mM, complejo de ribonucleósido de vanadilo 5 mM, Triton X-100 al 1%, desoxicolato de sodio al 1% y 1 cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA (Roche) suplementado con cicloheximida (100 μg ml -1 Calbiochem). El lisado se aclaró a 3.000 gramo durante 10 minutos seguido de otra ronda de compensación previa a 20.000 gramo durante 10 min a 4 ° C. El lisado clarificado se cargó en un colchón de sacarosa al 30% y se ultracentrifugó a 100.000 gramo durante 1 ha 4 ° C. El sobrenadante no polisómico se recogió de la parte superior. La almohadilla de sacarosa se lavó con un tampón (HEPES 10 mM pH 8,0, KCl 25 mM, MgCl 5 mM2, DTT 1 mM), se ultracentrifugó durante 30 minutos adicionales y el sedimento polisómico se resuspendió finalmente en tampón polisoma (HEPES 10 mM pH 8.0, KCl 25 mM, MgCl 5 mM2, DTT 1 mM, complejo de ribonucleósido de vanadilo 5 mM, cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA 1 ×) para el aislamiento del ARN.

Ensayo de escisión RISC

El ensayo de escisión de RISC se realizó esencialmente como se describe en otra parte con modificaciones menores 50,51. Las células HEK293 que expresan de forma estable FH-AGO2 se transfectaron con pmiR-122 y plásmidos de expresión de ARNm diana. Para el aislamiento de miRISC, las células se lisaron, 48 h después de la transfección, en tampón de lisis [HEPES 10 mM pH 7,4, KCl 200 mM, MgCl 5 mM2, DTT 1 mM, 1 inhibidor de proteasa sin EDTA (Roche), compuestos de ribonucleósido de vanadilo 5 mM (Sigma), Triton X-100 al 1%] a 4 ° C durante 15 min, seguido de aclaramiento del lisado a 3000 gramo durante 10 min. El sobrenadante clarificado se sometió a inmunoprecipitación con gel de afinidad anti-FLAG M2 (Sigma) durante 16 ha 4ºC. Las perlas se lavaron en tampón IP [Tris-HCl 20 mM pH 7,4, KCl 150 mM, MgCl 5 mM2, DTT 1 mM, inhibidor de proteasa sin EDTA 1 × (Roche)] tres veces a 4 ° C. El miRISC purificado por afinidad se eluyó de las perlas usando 3 × péptido FLAG (Sigma) según las instrucciones del fabricante en un tampón de purificación RISC (HEPES 30 mM pH 7,4, KCl 100 mM, MgCl 5 mM2, DTT 0,5 mM, glicerol al 3%).

MiRISC-122 purificado por afinidad se ensayó para la escisión del ARN diana usando un ARN de 36 nt 5'-AAAUUCAAACACCAUUGUCACACUCCACCAGAUUAA-3 'que lleva la secuencia complementaria de miR-122 maduro. Los ensayos de escisión del ARN objetivo se llevaron a cabo en un volumen total de 30 μl con 10 fmol de ARN marcado con 32 P de 5 'en un tampón de ensayo (KCl 100 mM, MgCl 5,75 mM2, ATP 2,5 mM, GTP 0,5 mM) y cantidades equivalentes de proteína de RISC a 30ºC durante 30 min. El aislamiento del ARN se llevó a cabo a partir de la mezcla de reacción, los productos escindidos se analizaron en una Urea-PAGE 8 M desnaturalizante al 12% y se visualizaron por autorradiografía.

In vitro Ensayo de carga RISC

FH-AGO2 purificado por afinidad en perlas de agarosa de células HEK293 estables con FH-AGO2 se incubó con pre-miR-122 o pre-let-7a 5'-fosforilado sintético 10 nM y 500 ng in vitroARNm diana transcrito en una reacción de 20 μl en tampón de ensayo [Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, KCl 200 mM, MgCl 2 mM2, Glicerol al 5%, DTT 1 mM, inhibidor de ARNasa 40 U (Fermentas)] durante 1 ha 37ºC seguido de lavado de las perlas tres veces con tampón IP. A continuación, cada reacción se dividió en dos mitades: una para el aislamiento del ARN y la otra para la transferencia Western de AGO2.

Para los ensayos con proteínas recombinantes, se utilizaron 50 ng de rAGO2 (Sino Biologicals) con 0,1 U de rDICER1 (kit de enzima de dicer humano recombinante, Genlantis) manteniendo el resto de los parámetros de reacción iguales a los anteriores.

Para medir la asociación de AGO2 y DICER1 a lo largo de la 3'-UTR, se transfectaron células HEK293 que expresan establemente FH-AGO2 con NHA-DICER1 de forma transitoria y se inmunoprecipitó FH-AGO2 con perlas de agarosa anti-FLAG como se describió anteriormente. Se eluyó FH-AGO2 de perlas anti-FLAG con péptido FLAG 3 × (Sigma) y se incubó miRISC aislado con RL-3 × bulge-miR-122 a 37 ° C con pre-miR-122 10 nM durante 60 min. Después, la reacción se dividió en dos mitades y se inmunoprecipitó con anticuerpos anti-AGO2 y anti-DICER1 durante 3 ha 4 ° C. Las perlas se lavaron y se aisló el ARN utilizando TRIzolLS seguido de transcriptasa inversa cuantitativa-PCR utilizando un solo conjunto directo y dos conjuntos de cebadores inversos.

Para puntuar la procesividad de DICER1, las células HEK293 que expresan transitoriamente FH-AGO2 y pre-let-7a se lisaron y se inmunoprecipitaron FH-AGO2 como se describió anteriormente. Se eluyó FH-AGO2 de perlas anti-FLAG con 3 × péptido FLAG (Sigma) y miRISC aislado se incubó con RL-con o RL-3 × bulge-let-7a a 37 ° C con pre-miR-122 10 nM para 30 minutos. El ARN se aisló de la reacción y el miR-122 maduro formado se cuantificó mediante PCR en tiempo real.

In vitro transcripción

In vitro la transcripción se llevó a cabo utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE (Life Technologies) y la colas de poli A de las transcripciones realizadas con el kit de colas de Poly (A) (Life Technologies) según el protocolo del fabricante. Para la preparación de la plantilla de ADN plasmídico, RL-con, RL-1 × bulge-miR-122, RL-3 × bulge-miR-122, RL-3 × bulge-miR-122 (W5 ′), RL-3 × bulge -miR-122 (W3 ') y RL-CatA se digirieron durante 4 ha 37 ° C con DraI (New England Biolabs) y RL-3 × bulge-let-7a se digirió con HpaI (New England Biolabs) el resto de el protocolo fue según las instrucciones del fabricante. Todas las transcripciones obtenidas se analizaron y se verificó el tamaño mediante detección basada en bromuro de etidio y urea-PAGE al 6%.

Ensayo de protección de ARNasa

El ensayo de protección de ARNasa se realizó como se describió anteriormente 52. La sonda sintética de ARN miR-122 se marcó en el extremo 5 'con γ 32 P ATP utilizando polinucleótido quinasa T4 (Ferementas) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El miR-122 marcado (1,5 pmol 100 fmol radiomarcado y 1,4 pmol en el extremo 5 'marcado con ATP frío) se mezcló con 500 fmol de ARNm diana y se precipitó con 0,1 vol de acetato de sodio (pH 5,2) y 2,5 vol de etanol helado durante 1 ha -80 ° C. El ARN recuperado se disolvió en 30 μl de tampón de hibridación (PIPES 40 mM pH 6,8, EDTA 1 mM pH 8,0, NaCl 0,4 M, formamida desionizada al 80%), se desnaturalizó a 85 ° C durante 5 min y luego se recoció a 35 ° C durante la noche. A continuación, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y luego se llevó a cabo la digestión con ARNasa en 300 μl de mezcla de digestión con ARNasa (NaCl 300 mM, Tris 10 mM pH 7.4, EDTA 5 mM pH 7.5, 30 μg RNasa A (Fermentas)) a 30 ° C 1 h. Se realizó tratamiento con Proteinasa K (10% SDS y 20 mg ml -1 de Proteinasa K (Roche) a 37 ° C durante 30 min) seguido de extracción de ARN con fenol ácido: cloroformo pH 4.5 en presencia de 20 μg de ARN de transferencia portadora (Sigma) . Las muestras se procesaron en un 18% de urea-PAGE seguido de secado del gel y la imagen se obtuvo usando phosphorimager. Para la digestión parcial, la reacción se incubó en hielo en lugar de a 30 ° C.

Transcripción de ejecución nuclear

La transcripción de ejecución nuclear se realizó según lo descrito por Roberts et al. 53. Para el aislamiento del núcleo intacto de las células Huh7, se lisaron ∼ 4 × 10 6 células en tampón de lisis NP-40 [Tris-HCl 10 mM pH 7,4, NaCl 10 mM, MgCl 3 mM2 y 0,5% (vol / vol) NP-40]. Fraccionamiento verificado por Western Blot para marcadores nucleares y citosólicos. Los núcleos se resuspendieron en 30 μl de tampón de almacenamiento de núcleos [Tris-HCl 50 mM pH 8,3, EDTA 0,1 mM, MgCl 5 mM2, 40% (vol / vol) glicerol] y sometido a transcripción continua en tampón de transcripción (Tris-HCl 10 mM pH 8,3, MgCl 2,5 mM2, KCl 150 mM, DTT 2 mM, ATP 1 mM, CTP 1 mM, GTP 1 mM, GTP 1 mM, inhibidor de ARNasa 100 U) a 30ºC durante 30 min. Inmediatamente después de la reacción, se aisló el ARN usando TRIzolLS y se sometió a tratamiento con DNasaI (New England Biolabs) a 37ºC durante 15 min. La DNasaI se inactivó calentando a 75 ° C durante 5 min. Se utilizaron 600 nanogramos de ARN para la preparación de ADNc en una reacción de 10 μl. Se realizó un control de transcriptasa inversa negativa para verificar la ausencia de cualquier contaminación de ADN genómico.

Preparación SLA

El SLA se preparó utilizando el protocolo publicado 54. Brevemente, para la preparación de SLA, alrededor de 10 10 Leishmania donovani las células se lavaron tres veces con 1 x PBS seguido de cinco a seis ciclos de congelación y descongelación con nitrógeno líquido. A continuación, las células se sometieron a ultrasonidos en PBS con NP-40 al 0,04% seis veces. El lisado se aclaró en 12.000 gramo durante 10 min a 4 ° C y el sobrenadante recogido fue SLA. La estimación de proteínas de SLA se realizó utilizando el método de Bradford a 595 nm.

los in vitro El ensayo de escisión de DICER1 se llevó a cabo como se menciona en otra parte 32. Se prepararon lisados ​​de células HEK293 que expresan establemente FH-AGO2 como para la inmunoprecipitación. Para cada reacción de escisión, se incubaron 30 μg de lisado celular con 20 μg de SLA en tampón de ensayo (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, DTT 1 mM, KCl 100 mM, 1 inhibidor de proteasa sin EDTA (Roche)) y 1 mg ml -1 BSA durante 30 min a 37 ° C. Esto fue seguido por inmunoprecipitación de la mezcla con perlas de agarosa anti-FLAG M2. Después de la inmunoprecipitación, las perlas se sometieron a in vitro Ensayo de actividad DICER.

Análisis estadístico

Todos los gráficos y análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism 5.00 (GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.). Emparejado no paramétrico t-prueba se utilizaron para el análisis y PAG-se determinaron los valores. Las barras de error indican la media ± desviación estándar.

Disponibilidad de datos

Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y sus archivos de información complementaria o bajo pedido.


CONCLUSIONES

El servidor web miRvestigator proporciona a los biólogos un poderoso conjunto de algoritmos que juntos identifican los miARN que se unen y regulan los genes que se encuentran coexpresados ​​en estudios de perfiles de transcriptomas. El sitio web toma como entrada una lista de identificadores de genes (gen Entrez, gen Ensembl, transcripción RefSeq o símbolo genético oficial) para una de las seis especies diferentes ( C. elegans , D. melanogaster , G. gallus , H. sapiens , M. musculus o R. norvegicus ). Para un conjunto dado de genes, miRvestigator: (i) extrae sus secuencias 3′-UTR relevantes (ii) escanea estas secuencias 3′-UTR en busca de un motivo sobrerrepresentado utilizando el algoritmo de Weeder (iii) identifica sitios de unión putativos para el motivo sobrerrepresentado y (iv) aplica un HMM y el algoritmo de Viterbi para identificar el o los miARN que es más probable que se una al motivo sobrerrepresentado. La interfaz web fácil de usar facilita a los biólogos ajustar los parámetros y enviar trabajos a miRvestigator. El resultado de miRvestigator es una lista clasificada de miRNA presentados en formato tabular con enlaces a los registros correspondientes en miRBase, evaluación estadística de la calidad de complementariedad y una alineación del motivo con las secuencias de semillas de miRNA. La salida también incluye una segunda tabla con las supuestas ubicaciones de unión del miARN dentro de las 3'-UTR de los genes de consulta. El miRvestigator proporciona una herramienta valiosa para que los usuarios identifiquen los miARN que regulan los procesos biológicos de interés y la información necesaria para diseñar experimentos para probar estas predicciones.