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¿Por qué la inhibición de RTK no ayudará en un caso de EGF mutante?

¿Por qué la inhibición de RTK no ayudará en un caso de EGF mutante?


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Me dieron lo siguiente como ejemplo para una pregunta de prueba, pero no entiendo la respuesta. Cualquier ayuda será bienvenida:

Pregunta: Iressa es un inhibidor de la tirosina quinasa. Como joven oncólogo, a quién de los pacientes recomendará no para tomar este tratamiento:

una. La biopsia ha demostrado que el receptor de EGF es mutante

B. La biopsia ha demostrado que la proteína RAS es mutante.

C. La biopsia ha demostrado que la MAP quinasa permanece en el núcleo de forma permanente

D. El tratamiento puede ayudar a cada uno de los casos a, b, c.

La respuesta correcta debería ser a. ¿Alguien puede ver por qué y ayudar aquí?

Sé que el receptor de tirosina quinasa es la parte interior del receptor de EGF (donde los dos monómeros se convierten en un dímero y se fosforilan entre sí). Entonces, si el receptor de EGF es mutante, ¿no debería ayudar a inhibir su continuación dentro de la célula y así prevenir muchas cascadas de EGF?

¡Gracias!


Rescate impulsado por factores de crecimiento para inhibidores de la tirosina quinasa receptora (RTK) a través de la fosforilación de Akt y Erk en el astrocitoma y el ependimoma de grado bajo pediátrico

Hasta ahora, se han iniciado varios estudios clínicos que investigan la relevancia de los inhibidores del receptor de tirosina quinasa (RTK) sobre la supervivencia libre de progresión en varios tumores cerebrales pediátricos. Sin embargo, la inhibición de la quinasa de un solo objetivo fracasó, posiblemente debido a los mecanismos de resistencia tumoral. El presente estudio ampliará nuestras observaciones anteriores de que el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) -2, el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) β, Src, la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (ErbB) y el receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos (HGFR / cMet) son objetivos potencialmente farmacológicos en el astrocitoma y ependimoma de bajo grado pediátrico con investigaciones relacionadas con el rescate impulsado por el factor de crecimiento. Esto se investigó en líneas de células de ependimoma y astrocitoma de bajo grado pediátrico tratadas con inhibidores de la tirosina quinasa del receptor (RTK). mi.gramo. sorafenib, dasatinib, canertinib y crizotinib. Los análisis de citometría de flujo mostraron un alto porcentaje de células que expresan VEGFR-1, receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) -1, ErbB1 / EGFR, HGFR y receptor de origen nantais (RON) (respectivamente 52-77%, 34-51%, 63 -90%, 83-98%, 65-95%). Sus respectivos inhibidores indujeron la disminución de la viabilidad celular, medida con ensayos de viabilidad celular WST-1. Al menos esto se debió en parte al aumento de los niveles de apoptosis medidos por los ensayos de apoptosis de anexina V / yoduro de propidio. EGF, HGF y FGF, que normalmente se expresan en el tejido cerebral (tumor), demostraron ser factores de crecimiento inductores de rescate efectivos, lo que resultó en un aumento de la supervivencia celular, especialmente durante el tratamiento con dasatinib (rescate completo) o sorafenib (rescate parcial). El rescate impulsado por factores de crecimiento fue menos prominente cuando se usaron canertinib o crizotinib. El rescate se destacó mediante la activación significativa de la fosforilación de Akt y / o Erk aguas abajo y el aumento de la migración de células tumorales. El tratamiento combinado demostró ser capaz de superar el rescate impulsado por el factor de crecimiento. En conclusión, nuestro estudio destaca la gran importancia de los factores de crecimiento ambientalmente presentes en el desarrollo de un escape tumoral hacia los inhibidores de RTK en el astrocitoma y ependimoma pediátrico de bajo grado. Es de gran interés anticipar estos resultados para el diseño de nuevos ensayos terapéuticos con inhibidores de RTK en estos tumores cerebrales pediátricos.

Citación: Sie M, den Dunnen WFA, Lourens HJ, Meeuwsen-de Boer TGJ, Scherpen FJG, Zomerman WW, et al. (2015) Rescate impulsado por el factor de crecimiento para inhibidores de la tirosina quinasa del receptor (RTK) a través de la fosforilación de Akt y Erk en el astrocitoma y el ependimoma pediátricos de grado bajo. PLoS ONE 10 (3): e0122555. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0122555

Editor académico: Ilya Ulasov, Instituto Sueco de Neurociencia, ESTADOS UNIDOS

Recibió: 29 de diciembre de 2013 Aceptado: 23 de febrero de 2015 Publicado: 23 de marzo de 2015

Derechos de autor: © 2015 Sie et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia de atribución Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite el autor y la fuente originales.

Fondos: Este trabajo fue apoyado por una subvención de Jan Kornelis de Cock Stichting (código de proyecto 2013-75 para M. Sie). El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.


Introducción

Aproximadamente el 50% de los melanomas y el 10% de los cánceres colorrectales (CCR) albergan mutaciones puntuales V600E / K en la cinasa citosólica BRAF. Mientras que la activación de RAS-GTP mediada por receptor normalmente regula la actividad de la enzima catalizando la formación de dímeros BRAF, las mutaciones V600 dan como resultado una señalización constitutiva por parte del BRAF monómero y posterior fosforilación de MEK y ERK. 1 La efector quinasa ERK fosforila más de 100 sustratos citosólicos y nucleares, que regulan la actividad enzimática y la expresión génica, promoviendo la proliferación y supervivencia celular. 2

Vemurafenib (Zelboraf®) y dabrafenib (Tafinlar®) son inhibidores de BRAF competitivos con ATP (BRAFi) altamente selectivos para el mutante V600E, ambos aprobados para el tratamiento del melanoma metastásico. 3,4,5 Si bien aproximadamente la mitad de los pacientes con melanoma que albergan esta mutación responden a la terapia con un solo agente, la duración de la respuesta suele ser inferior a un año. Las respuestas iniciales se correlacionan con el grado de supresión de fosfo-ERK (pERK) 6 y la resistencia a menudo se asocia con la reactivación de la señalización de MAPK / ERK a través de una multitud de mecanismos genéticos y epigenéticos. 7,8,9,10 La combinación con los inhibidores de MEK (MEKi) cobimetinib (Cotellic®) o trametinib (Mekinst®) logra una supresión de pERK más robusta, aumentando las tasas de respuesta general (ORR) a más del 70% y extendiendo ambas sin progresión supervivencia y supervivencia global. 11,12,13

Tras las impresionantes respuestas en el melanoma, las terapias BRAFi y MEKi se han probado en BRAF Cánceres mutantes V600E de otros orígenes como el colorrectal. Sin embargo, la actividad clínica observada en pequeños ensayos iniciales ha sido bastante modesta en comparación con los pacientes con melanoma, con tasas de respuesta del 5% para la monoterapia con vemurafenib, del 15% y del 12% para las combinaciones de BRAFi + MEKi (dabrafenib y trametenib). 16 Dada la alta expresión y actividad del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en el CCR, se postuló que la señalización de "derivación" a través de EGFR / RAS / CRAF mediaría la resistencia a BRAFi en modelos preclínicos. 17, 18 La adición de anticuerpos bloqueadores de EGFR (EGFRi) como cetuximab o panitumumab a los regímenes BRAFi y MEKi ha producido un beneficio clínico adicional modesto (ORR = 26% para la combinación triple), 19 pero aún mucho menos de lo que se puede lograr en el melanoma. Como tal, sigue existiendo una necesidad médica insatisfecha de encontrar terapias más efectivas para el tratamiento de BRAF V600E -CRC.

Si tales cánceres dependen de la señalización de MAPK, razonamos que los inhibidores de ERK (ERKi), ya sea solos o como parte de regímenes de múltiples fármacos, podrían ser de beneficio clínico en BRAF V600E -CRC, dada la actividad preclínica observada en modelos de melanoma y CCR resistentes a inhibidores de BRAF y MEK. 20,21,22,23 Varios inhibidores de ERK, incluidos BVD-523, SCH772984 y GDC-0994 (ref.24) se encuentran actualmente en desarrollo clínico preclínico y temprano, pero no está claro si estos agentes mostrarán más actividad clínica favorable en comparación con los inhibidores de MEK.

Para la evaluación predictiva de estos nuevos agentes anticancerosos, los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) están emergiendo como una herramienta valiosa. 25 Sin embargo, la prueba sistemática de regímenes de dosificación alternativos y combinaciones en paneles de modelos tumorales clínicamente representativos y genéticamente diversos a través de “ensayos clínicos PDX” 26 es tediosa y poco práctica como plataforma de desarrollo de fármacos. Como alternativa, desarrollamos un modelo computacional predictivo de la vía MAPK y su regulación del crecimiento tumoral en BRAF V600E -CRC, utilizando un enfoque basado en la farmacología de sistemas cuantitativos, 27 que:

Reproduce cuantitativamente respuestas de señalización in vitro (línea celular) y mecanismos genéticos de resistencia a inhibidores dirigidos (vía MAPK)

Predice las respuestas de crecimiento tumoral in vivo (línea celular y xenoinjerto derivado del paciente) a los tratamientos farmacológicos basándose en estos mecanismos bioquímicos y celulares subyacentes

Reproduce los datos clínicos disponibles sobre los cambios en el tamaño del tumor en respuesta a los tratamientos con EGFRi, BRAFi y MEKi.

Predice las respuestas clínicas a un nuevo ERKi (GDC-0994) 28 monoterapia y regímenes combinados


Materiales y métodos

Cultivo de células

Las células iKRAS se derivaron de P48 CRE_TetO-LSL-KRAS G12D_Rosa-rtTA_p53 fl / +, ratones portadores de tumores (15). Los tumores se trituraron y se digirieron en colagenasa IV y dispasa (4 mg / ml) durante 1 hora a 37 ° C en un agitador orbital y posteriormente se filtraron a través de un colador de células de nailon de 40 μmol / L. Para el cultivo de tejidos convencional, las células se mantuvieron en RPMI-1640 suplementado con FBS al 10%, glutamina 2 mmol / L y penicilina-estreptomicina al 1%. Para el cultivo de tejidos en 3D, las células se mantuvieron en placas de baja adherencia en medio de células madre (MEBM Lonza) suplementado con 2 mmol / L de glutamina (Invitrogen), B27 (Invitrogen), 20 ng / mL de hEGF (PeproTech), 20 ng / mL hFGF (PeproTech), 5 μg / mL h-Insulina (Roche), 0.5 μmol / L de hidrocortisona (Sigma-Aldrich), 100 μmol / L de β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich), 4 μg / mL de heparina (Sigma-Aldrich) . Se añadió Methocult M3134 (STEMCELL Technologies) al medio de células madre (concentración final al 0,8%) para mantener el crecimiento de las células tumorales como esferas clonales (16). Las células MIA PaCa-2 y Panc1 se obtuvieron de la ATCC.

Viabilidad celular

Para determinar la viabilidad de las células cultivadas en condiciones 3D, las células incrustadas en medios semisólidos a base de metilcelulosa se expusieron a 1 μmol / L de calceína (Life Technologies), se incubaron durante 30 minutos y se cuantificaron mediante el aparato ImageXpress velos (Molecular Devices). Alternativamente, las células se recolectaron mediante centrifugación, se tripsinizaron, se tiñeron en tampón 1X Anexina V con Anexina V-ficoeritrina y 7AAD (BD Biosciences) durante 5 minutos a temperatura ambiente y se analizaron mediante citometría de flujo.

Estudios con animales

Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las pautas de IACUC. Para el establecimiento de aloinjertos y xenoinjertos, se suspendieron 5 x 104 células iKRAS o 2 x 106 células PATC en 200 μl de HBSS al 50%, Matrigel reducido con factor de crecimiento al 50% y se inyectaron s.c. en el flanco derecho de ratones desnudos. El volumen del tumor se evaluó utilizando medidas de calibre y se calculó de acuerdo con la fórmula estándar: longitud / 2 x ancho 2. AZD6244, BEZ235, lapatinib e imatinib se administraron por sonda oral, mientras que AXLi se administró por vía i.p. inyección. Los fármacos se disolvieron en los siguientes vehículos: (i) AZD6244 y lapatinib, metilcelulosa al 10%, Tween 20 al 2% (ii) BEZ235, metilpirrolidona 2 al 50%, PEG300 al 50% (iii) imatinib, PBS estéril y (iv) AXLi, DMSO al 10%, PEG300 al 90%.

Matriz de proteínas de fase inversa

Los perfiles de expresión de proteínas de matriz de proteínas de fase inversa (RPPA) fueron generados por la instalación central MD Anderson RPPA siguiendo protocolos estándar (17). Puede encontrar más información en http://www.mdanderson.org/education-and-research/resources-for-professionals/scientific-resources/core-facilities-and-services/functional-proteomics-rppa-core/index. html. Las curvas de dilución de RPPA se ajustaron con un modelo logístico del paquete SuperCurve R (18,19), y los datos de RPPA se normalizaron mediante la carga de proteínas. Registro normalizado2-Los datos transformados se utilizaron para análisis estadísticos adicionales. La expresión diferencial entre dos condiciones se calculó mediante el método de Student t prueba y múltiples condiciones con ANOVA unidireccional con scripts R personalizados. Crudo PAG los valores se corrigieron para pruebas de hipótesis múltiples utilizando la corrección de Benjamini-Hochberg (FDR), y los cambios en las proteínas se consideraron significativos cuando el FDR fue inferior al 10%.

Análisis de Western Blot

Los extractos de células completas se sometieron a electroforesis mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando un aparato de transferencia semiseco de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bio-Rad). Después de la incubación con leche descremada al 5% en TBST (Tris 10 mmol / L, pH 8,0, NaCl 150 mmol / L, Tween 20 al 0,5%) durante 60 minutos, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios (consulte el Material complementario para obtener una lista detallada de anticuerpos) a 4 ° C durante la noche. Las membranas se lavaron tres veces durante 10 minutos y se incubaron con una dilución 1: 5.000 de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP). Las transferencias se lavaron con TBST tres veces y se revelaron después de la reacción de quimioluminiscencia basada en ECL a través de la exposición de la película.

Inmunohistoquímica

Los tumores fijados con formalina se deshidrataron y se incluyeron en parafina de acuerdo con procedimientos estándar. Se cortaron rodajas (5 µm) usando un micrótomo, se rehidrataron y se sometieron a desenmascaramiento de antígenos mediante calentamiento a 95 ° C durante 30 minutos con una solución de desenmascaramiento de antígenos disponible comercialmente (Citra Plus-Biogenex). Posteriormente, las rodajas se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 minutos, se incubaron con anticuerpos primarios, se lavaron, se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP, se lavaron y se revelaron mediante incubación con DAB. Las rodajas se tiñeron por contraste con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron.

PCR en tiempo real

Los ADNc se sintetizaron a partir de ARN mediante transcripción inversa con un kit disponible comercialmente siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen). La PCR en tiempo real se realizó mediante una reacción basada en TAQMAN mediante el uso de los siguientes conjuntos de cebadores y sondas de Invitrogen: detención del crecimiento específico 6 (GAS6 mmol / L 00490378_m1), PDGFA (mmol / L 01205760_m1), PDGFB (mmol / L 00440677_m1 ) y PDGFC (mmol / L 00480205_m1). Las cantidades relativas de ARNm se calcularon utilizando el valor comparativo ΔΔCt método.

Producción de lentivirus

Se transfectó una placa semiconfluente de 15 cm de HEK293T con 30 μg de plásmido pHAGE y una mezcla de los vectores codificadores de empaquetamiento PMD2.G (9 μg) y pCMVΔR-8.74 (19.5 μg). Los medios que contenían virus se recogieron 72 horas después de la transfección y se filtraron, el virus se concentró mediante ultracentrifugación.


Resultados

La deleción de SOS1 inhibe la transformación en células de NSCLC mutadas en EGFR

Estudios anteriores demostraron que las líneas celulares de CPCNP mutadas en EGFR muestran una capacidad de respuesta mucho más robusta a los EGFR-TKI de primera generación en cultivo 3D (esferoides de línea celular cancerosa de monocultivo o monocultivo o organoides de cultivo mixto en ECM / Matrigel) en comparación con el cultivo adherente 2D, y más que las condiciones 3D reflejan más fácilmente las respuestas de EGFR-TKI vistas in vivo (Jacobi et al., 2017). Para confirmar estos hallazgos y extenderlos a los EGFR-TKI de tercera generación, evaluamos la supervivencia dependiente de la dosis de ambos sensibles al EGFR-TKI de primera generación (HCC827, deleción del exón 19 [Δex19]) o líneas celulares de CPCNP resistentes (NCI-H1975, L858R / T790M) al tratamiento con gefitinib u osimertinib en condiciones de cultivo adherente (2D) o esferoide (3D) (Figura 1A). Las células HCC827 y H1975 se sembraron en cultivos adherentes o esferoides, se dejaron reposar durante 48 horas y luego se trataron con dosis crecientes de gefitinib EGFR-TKI de primera generación o de osimertinib EGFR-TKI de tercera generación durante 4 días. Las células HCC827 mostraron capacidad de respuesta a ambos EGFR-TKI en condiciones de cultivo 2D y 3D, sin embargo, en ambos casos, los cultivos de esferoides 3D mostraron una mejora de & gt 1 log en la eficacia de EGFR-TKI y una mayor inhibición del crecimiento general. Si bien las células NCI-H1975 no fueron sensibles al gefitinib, el tratamiento con osimertinib de las células H1975 mostró una eficacia mejorada y una mayor inhibición del crecimiento general en los esferoides 3D sobre los cultivos adherentes 2D.

SOS1 la deleción inhibe la transformación dependiente de anclaje (3D) en líneas celulares de NSCLC mutadas en EGFR.

(A) Curvas de dosis-respuesta de células HCC827 (Δex19) (izquierda) o NCI-H1975 (L858R / T790M) (derecha) mutadas en EGFR tratadas con gefitinib u osimertinib en 2D dependiente del anclaje (diamantes grises) o esferoide 3D (cuadrados negros) condiciones de cultivo. (ANTES DE CRISTO) Proliferación 2D (izquierda) o crecimiento de esferoides 3D (derecha) en poblaciones agrupadas de (B) HCC827 o (C) Celdas NCI-H1975 donde SOS1 o SOS2 se ha eliminado utilizando los controles CRISPR / Cas9 vs NT. Se muestran imágenes de 10x de esferoides representativos en los días 0 y 21, barra de escala = 250 mm. (D) Transformación 3D en poblaciones combinadas de las líneas celulares de NSCLC mutadas en EGFR indicadas donde SOS1 o SOS2 se ha eliminado utilizando los controles CRISPR / Cas9 vs NT. (mi) Células de curva de respuesta a dosis de células NCI-H1975 tratadas con el inhibidor de SOS1 BAY-293 en condiciones de cultivo dependientes de anclaje 2D (diamantes grises) o esferoides 3D (cuadrados negros). Los datos se representan como número de celda frente a sin tratar para cada línea celular individual. (F) Curvas dosis-respuesta de células NCI-H1975 donde SOS1 (círculos rojos) o SOS2 (triángulos azules) se ha eliminado usando CRISPR / Cas9 frente a controles NT (cuadrados negros) tratados con BAY-293 en condiciones de cultivo de esferoides 3D. Para cada condición, la muestra sin tratar se estableció al 100% y las muestras tratadas con fármaco se compararon con las no tratadas para cada línea celular. Las curvas de dosis-respuesta y la proliferación 2D se presentan como media +/- DE. de al menos tres experimentos independientes. Para los estudios de transformación, los datos provienen de cuatro experimentos independientes. Cada experimento individual se realizó utilizando poblaciones (no clones) de células CRISPR'd independientemente. Para cada experimento, se evaluaron tres réplicas técnicas. La significación estadística se determinó mediante ANOVA utilizando el método de Tukey para comparaciones múltiples. * p & lt0.05, ** p & lt0.01, *** p & lt0.001 frente a células NT. # p & lt0.05, ## p & lt0.01 vs. SOS1 Células KO.

Figura 1: datos de origen 1

El inhibidor de SOS1 BAY-293 es específico para SOS1 y está mejorado porSOS2deleción en líneas celulares de NSCLC mutadas en EGFR (T790M).

SOS1 y SOS2 son RasGEF de expresión ubicua responsables de transmitir la señalización de EGFR a las vías efectoras aguas abajo. Para determinar si SOS1 o SOS2 eran necesarios para la proliferación dependiente del anclaje 2D o el crecimiento de esferoides 3D en células de CPCNP mutadas en EGFR, SOS1 (Figura 1 — figura del suplemento 1 y Muñoz et al., 2016) o SOS2 (31) se eliminaron en poblaciones agrupadas de células HCC827 y H1975 para evitar efectos clonales, y se evaluaron tanto la proliferación como el crecimiento de esferoides frente a los controles NT (Figura 1B y C). En cultura adherente, ni SOS1 ni SOS2 proliferación alterada deleción (Figura 1B). A diferencia de, SOS1 la deleción inhibió completamente el crecimiento de esferoides en las células HCC827 y H1975, lo que indica que se requería SOS1 para mantener el fenotipo transformado en ambas líneas celulares. Para determinar si SOS1 era generalmente necesario para la transformación impulsada por EGFR mutante, eliminamos adicionalmente SOS1 o SOS2 tanto en NCI-H3255 (L858R) como en PC9 (Δex19) y en subcultivos de estas líneas celulares que habían adquirido mutaciones T790M después del tratamiento continuo con EGFR-TKI (PC9-TM [de Bruin et al., 2014] y H3255-TM [Engelman et al., 2006]). En todos los casos, SOS1 deleción disminuyó significativamente la transformación oncogénica, mientras que SOS2 la deleción tuvo efectos variables sobre la transformación dependiendo de la línea celular mutada EGFR examinada (Figura 1D). Estos datos indican que SOS1 es el principal RasGEF responsable de la oncogénesis aguas abajo del EGFR mutado.

BAY-293 se describió recientemente como un inhibidor específico de SOS1 (Hillig et al., 2019). Para determinar si la inhibición de SOS1 fue igualmente más eficaz en esferoides 3D sobre cultivo adherente 2D, evaluamos la supervivencia dependiente de la dosis de células H1975 después del tratamiento con BAY-293 en condiciones de cultivo 2D y 3D (Figura 1E). Similar a lo que observamos después del tratamiento con EGFR-TKI (Figura 1A) o SOS1 deleción (Figura 1C y D), BAY-293 mostró una eficacia mejorada y una mayor inhibición del crecimiento general en esferoides 3D sobre cultivos adherentes 2D. Para confirmar la especificidad de BAY-293 para SOS1, tratamos adicionalmente células H1975, PC9-TM y H3255-TM cultivadas con esferoides 3D en las que SOS1 o SOS2 se habían eliminado frente a los controles NT con dosis crecientes de BAY-293 durante cuatro días, y se evaluó la viabilidad celular dentro de los esferoides usando Cell Titre Glo (Figura 1F y Figura 1 — figura suplemento 2). El tratamiento con BAY-293 no inhibió la supervivencia de los esferoides donde SOS1 había sido eliminado, lo que indica la especificidad de BAY-293 para SOS1. Además, las celdas donde SOS2 había sido eliminado mostró una mejora de aproximadamente 1 logaritmo en la eficacia de BAY-293 y una mayor inhibición del crecimiento general en comparación con los controles NT, lo que indica que SOS1 y SOS2 tienen algunas funciones superpuestas en el apoyo a la supervivencia de células de NSCLC mutadas en EGFR cultivadas con esferoides. Para estos experimentos, el número de células de la muestra sin tratar en el día cuatro de tratamiento para cada línea celular (NT, SOS1 KO, SOS2 KO) se estableció en 100%, por lo que no se apreciarán las diferencias en la transformación (consulte la Figura 1B-D). Además, para las células NCI-H1975 y NCI-H3255-TM, SOS1 la deleción no muestra diferencias de transformación después de cuatro días. En general, estos datos sugieren que las células NSCLC mutadas en EGFR son más sensibles a la inhibición de EGFR mutante o SOS1 en cultivo de esferoides 3D en comparación con las condiciones tradicionales de adherencia 2D.

La inhibición de SOS1 se sinergiza con EGFR-TKI para inhibir la supervivencia celular en condiciones de cultivo independientes del anclaje (3D)

Estudios anteriores informaron que la combinación de osimertinib con un inhibidor de RTK alternativo puede inhibir o tratar el desarrollo de resistencia impulsada por ese RTK específico (Mancini et al., 2018 Romaniello et al., 2018 La Monica et al., 2017), mientras que la inhibición simultánea de Es posible que se requieran múltiples RTK paralelos con osimertinib para potenciar eficazmente la acción de osimertinib (Romaniello et al., 2018). Además, aunque muchos estudios muestran una actividad farmacológica mejorada en las terapias de combinación frente al tratamiento con osimertinib solo, no evalúan si los efectos de las combinaciones de dos fármacos son interacciones sinérgicas verdaderamente sinérgicas entre las terapias que permiten maximizar el efecto terapéutico al tiempo que minimizan los eventos adversos y pueden ser necesario para combinaciones terapéuticas eficaces con agentes dirigidos (Roell et al., 2017).

SOS1 es un mediador corriente abajo común de la señalización RTK. Presumimos que SOS1 podría ser un objetivo farmacológico eficaz para sinergizar con la inhibición de EGFR-TKI para tratar el adenocarcinoma de pulmón con mutación de EGFR. Para evaluar directamente la sinergia entre osimertinib y la inhibición de SOS1, utilizamos dos métodos distintos basados ​​en los modelos de referencia más ampliamente establecidos de aditividad a fármacos. El primer método, el análisis de isobolograma, evalúa los cambios en las curvas de dosis-respuesta para mezclas de dos fármacos en comparación con las mezclas simuladas de cada fármaco individual consigo mismo. El segundo método, el análisis de independencia de Bliss, evalúa si una mezcla de dos dosis de fármacos individuales tiene un efecto mayor de lo que se esperaría si los dos fármacos actuaran de forma independiente. Primero describiremos y luego usaremos cada método por turno para determinar si la inhibición de SOS1 usando BAY-293 podría sinergizar con el osimertinib EGFR-TKI en EGFR-células de adenocarcinoma de pulmón mutadas.

El análisis de isobolograma es un análisis de dosis-efecto basado en el principio de aditividad de Loewe, que establece que un fármaco mezclado consigo mismo y, por extensión, una mezcla de dos o más fármacos similares, presentará efectos aditivos. Para dos fármacos (Fármaco A y Fármaco B) que tienen curvas de dosis-respuesta paralelas de modo que se mantenga una relación de potencia constante en todas las dosis de A y B (Figura 2A), el tratamiento con cualquier mezcla de dosis equivalente (DEQ) de Fármacos A y B mostrará un efecto similar al tratamiento con el fármaco A o el fármaco B solo si los efectos de los dos fármacos son aditivos. Por el contrario, si los dos fármacos muestran sinergismo, entonces el efecto observado por el tratamiento con mezclas DEQ de A y B será mayor que el efecto de cualquiera de los fármacos solos. Al generar curvas de respuesta a la dosis para diferentes mezclas DEQ de Fármacos A y B (Figura 2B), se puede comparar la CE50 de cada mezcla de DEQ a la CE50 del Fármaco A o del Fármaco B solo en un diagrama de isobolograma (Figura 2C). La CE50 de cada fármaco individual se representa como la intersección x o y, y la contribución calculada de cada fármaco a la CE general50 para cada mezcla DEQ se traza como un solo punto (EC50, A, EC50, B) en el gráfico. Si la CE50 Los valores para cada mezcla de DEQ caen a lo largo de la línea recta (isobole) que conecta la CE del fármaco individual50 valores, entonces la interacción fármaco-fármaco es aditiva. Por el contrario, los puntos que caen por encima o por debajo de la isobole indican antagonismo o sinergia. La medida en que interactúan dos fármacos puede cuantificarse más a partir de la CE.50 datos como un índice de combinación (CI) (Figura 2D). Un IC entre 0,8 y 1,2 indica que los dos fármacos tienen efectos aditivos cuando se combinan, un IC & lt0,8 indica sinergia y un IC & gt1,2 indica antagonismo.

La inhibición de SOS1 se sinergiza con el inhibidor de EGFR-TKI osimertinib para inhibir la supervivencia celular en condiciones de cultivo independientes del anclaje (3D).

(ANUNCIO) El análisis de isobolograma examina la sinergia fármaco-fármaco comparando mezclas de dosis equivalentes (DEQ) de dos fármacos en función de su CE50 valores para el tratamiento con cualquiera de los fármacos solos (A y B). A partir de las curvas de dosis-respuesta de las mezclas DEQ, graficando la CE fraccional50 para cada fármaco de la combinación (violeta) en relación con el fármaco individual EC50 valores (azul, rojo) en un diagrama de isobolograma (C) y cálculo del índice de combinación (CI, D y E) permite la evaluación de la sinergia fármaco-fármaco. Los efectos aditivos ocurren en las líneas punteadas del diagrama de isobolograma y tienen un CI 0,8-1,2 (cuadro gris), mientras que las interacciones sinérgicas caen por debajo de las líneas punteadas y tienen un CI & lt0,8. (mi) Gráficos de isobolograma e IC de tratamientos de dosis equivalentes de células de NSCLC mutadas en EGFR H1975 tratadas con combinaciones DEQ de osimertinib y BAY-293. Los datos de isobolograma e IC se presentan como media +/- s.d. a partir de tres experimentos independientes. (F) La aditividad de felicidad evalúa si el efecto general de una combinación de fármacos individual (EMezcla A + B) es mayor de lo esperado para dos fármacos con efectos independientes en la población general (EA + EB - EA * EB). (GRAMO) El Bliss Index compara la relación entre el efecto esperado y el efecto real. Las interacciones sinérgicas tienen un índice de felicidad & lt 0,85. (H) Excess over Bliss evalúa la magnitud de la diferencia entre los efectos reales y esperados. Las interacciones cada vez más sinérgicas muestran un exceso sobre Bliss Index & gt 0. (I) Mapa de calor de células H1975 tratadas con las dosis indicadas de osimertinib y / o BAY-293 cultivadas en condiciones de cultivo 2D (adherentes) o como esferoides 3D. El verde indica más celdas, el rojo indica menos celdas. CE50 los valores para cada fármaco individual se indican con un *. (J) Mapa de calor del Bliss Index que evalúa la sinergia fármaco-fármaco entre osimertinib y BAY-293 en cada combinación de dosis de D. (K) Mapa de calor del exceso sobre Bliss que evalúa la sinergia fármaco-fármaco entre osimertinib y BAY-293 en cada combinación de dosis de D. El índice de Bliss y el exceso de Bliss se presentan como la media de tres experimentos independientes. Para cada experimento, se evaluaron tres réplicas técnicas.

Figura 2: datos de origen 1

La inhibición de SOS1 se sinergiza con el inhibidor de EGFR-TKI osimertinib para inhibir la supervivencia celular en condiciones de cultivo independientes del anclaje (3D).

Para evaluar la sinergia fármaco-fármaco entre osimertinib y BAY-293 mediante análisis de isobolograma, se cultivaron células NCI-H1975 en condiciones de adherencia 2D o esferoide 3D durante 48 horas y se trataron con distintas combinaciones DEQ de osimertinib: BAY-293 (ver Figura 2B). ) por cuatro días. Los datos de viabilidad celular se evaluaron utilizando CellTiter-Glo y EC50 Los valores de cada mezcla DEQ se utilizaron para generar gráficos de isobolograma y calcular índices de combinación (Figura 2E). Cuando las células se cultivaron en condiciones 2D, osimertinib y BAY-293 mostraron efectos aditivos, como DEQ EC50 los valores cayeron sobre la isobole y los valores de CI estuvieron entre 0,8 y 1,2. Por el contrario, cuando las células se cultivaron como esferoides 3D, osimertinib y BAY-293 mostraron una sinergia significativa, como DEQ EC50 los valores estaban muy por debajo de la isóbol y CI & lt0,8.

El análisis de independencia de Bliss es un análisis basado en efectos basado en el principio de aditividad de Bliss, que asume que dos fármacos actuarán de forma independiente entre sí, de modo que su efecto combinado se pueda evaluar evaluando el efecto de cada fármaco secuencialmente (Figura 2F). A diferencia del análisis de isobologramas, este método no requiere que dos medicamentos que se evalúan tengan curvas de dosis-respuesta paralelas y se pueden calcular con tan solo tres tratamientos farmacológicos, el efecto que cada medicamento tiene por sí solo en la población celular y el efecto de combinar los dos tratamientos farmacológicos juntos. Al representar el efecto de cada tratamiento farmacológico como un resultado probabilístico entre 0 (sin efecto) y 1 (efecto del 100%), podemos comparar el efecto observado de la combinación fármaco-fármaco con el efecto esperado si cada fármaco actuara de forma independiente (Figura 2E ). La relación entre el efecto esperado y el efecto observado es el índice de felicidad (BI), donde un BI & lt1 indica sinergia (Figura 2G). Alternativamente, la magnitud de la diferencia entre el resultado observado y esperado se puede informar como el exceso sobre Bliss (Figura 2H). Si bien el exceso sobre Bliss es la métrica de sinergia más ampliamente informada, el índice de Bliss se puede comparar directamente con el índice de combinación en experimentos de isobolograma y debe usarse cuando se usan ambos métodos de sinergia para evaluar una interacción fármaco-fármaco determinada.

Para evaluar la sinergia fármaco-fármaco entre osimertinib y BAY-293 mediante el análisis Bliss Independence, se cultivaron células NCI-H1975 en condiciones de adherencia 2D o esferoide 3D durante 48 horas y se trataron con dosis crecientes de BAY-293, osimertinib o combinaciones de los dos fármacos en una escala logarítmica de 3 durante cuatro días. La viabilidad celular se determinó usando CellTiter-Glo y la viabilidad general (Figura 2I), el índice de Bliss (Figura 2J) y el exceso sobre Bliss (Figura 2K) se representaron como mapas de calor. De manera similar a lo que observamos para el análisis de isobolograma, osimertinib y BAY-293 no mostraron una sinergia significativa en las células cultivadas en condiciones de adherencia 2D. Por el contrario, observamos una sinergia significativa entre osimertinib y BAY-293, principalmente en combinaciones de dosis de osimertinib y BAY-293 que caen justo por debajo de la CE del fármaco individual.50 valores. En general, los datos presentados en la Figura 2 indican que osimertinib y BAY-293 muestran una sinergia fármaco-fármaco significativa en células H1975 mutadas en EGFR, pero solo en condiciones de cultivo de esferoides 3D.

Para determinar si el inhibidor de SOS1 BAY-293 generalmente podría sinergizar con EGFR-TKI en células de adenocarcinoma de pulmón mutadas en EGFR, ampliamos nuestra evaluación de la sinergia fármaco-fármaco al análisis de isobologramas (Figura 3) y al análisis de independencia de Bliss (Figura 4) en seis diferentes líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón mutadas en EGFR. En células que eran sensibles a EGFR-TKI de primera generación (HCC827, PC9, H3255 T790 de tipo salvaje), evaluamos la sinergia fármaco-fármaco entre BAY-293 y una primera generación (gefitinib) o tercera generación (osimertinib) EGFR-TKI. En células que eran resistentes a EGFR-TKI de primera generación (H1975 PC9-TM, H3255-TM T790M) limitamos nuestra evaluación a la sinergia entre BAY-293 y osimertinib. Para determinar primero la CE individual50 valores de gefitinib, osimertinib y BAY-293 en cada línea celular, las células se cultivaron como esferoides 3D durante 48 a 72 horas y luego se trataron con dosis crecientes de fármaco durante cuatro días, seguido de la evaluación de la viabilidad celular mediante CellTiter-Glo (Figura 3 — Suplemento de figura 1). En cinco de las seis líneas celulares, las curvas de dosis-respuesta individuales para BAY-293, osimertinib y gefitinib (cuando corresponda) mostraron efectos máximos y coeficientes de Hill similares y, por lo tanto, fueron apropiadas para el análisis de isobolograma lineal para cada combinación de dos fármacos de BAY. -293, osimertinib y gefitinib (Tallarida, 2011). Por el contrario, las células H3255-TM fueron solo moderadamente sensibles al osimertinib, mostrando como máximo una reducción del 50% en la viabilidad a dosis altas. Por lo tanto, limitamos nuestra evaluación de la sinergia fármaco-fármaco en las células H3255-TM al análisis de independencia de Bliss. Además, para simplificar nuestra evaluación de la independencia de Bliss en varios fármacos y líneas celulares, limitamos nuestros tratamientos farmacológicos a mezclas 1: 2, 1: 1 y 2: 1 de cada combinación de fármacos en función de la equivalencia de dosis (consulte la Figura 4A).

Análisis de isobolograma que muestra que la inhibición de SOS1 se sinergiza con el tratamiento con EGFR-TKI para inhibir la supervivencia en múltiples líneas celulares de NSCLC mutadas en EGFR.

Análisis de isobolograma e índice de combinación (IC) de tratamientos de dosis equivalente de las líneas celulares de CPNM sensibles a gefitinib (L858R o Δex19, arriba) o resistentes a gefitinib (T790M, abajo) con mutación EGFR indicadas con combinaciones de gefitinib, osimertinib y BAY -293. Los efectos aditivos ocurren en las líneas punteadas del diagrama de isobolograma y tienen un CI 0,8-1,2 (cuadro gris), mientras que las interacciones sinérgicas caen por debajo de las líneas punteadas y tienen un CI & lt0,8. Los datos se presentan como media +/- s.d. a partir de tres experimentos independientes. Para cada experimento, se evaluaron tres réplicas técnicas.

Figura 3: datos de origen 1

Las líneas celulares de NSCLC mutadas en EGFR responden a osimertinib, BAY-293 y gefitinib en cultivos de esferoides 3D.

Análisis de Bliss Independence que muestra que la inhibición de SOS1 se sinergiza con el tratamiento con EGFR-TKI para inhibir la supervivencia en múltiples líneas celulares de NSCLC mutadas en EGFR.

(A) Mapa de calor de Bliss Index de células NCI-H1975 cultivadas con esferoides 3D Figura 2A (izquierda) y proyecciones horizontales de los índices de Bliss de los tratamientos farmacológicos en proporciones 2: 1, 1: 1 y 1: 2 de osimertinib: BAY-293 basadas en equivalencias de dosis (Derecha). Las interacciones cada vez más sinérgicas (índice de felicidad & lt0,85) se indican mediante el mapa de calor correspondiente. Se proporciona la concentración de BAY-293 (mantenida constante, abajo) y de osimertinib (encima de cada proyección horizontal). El IC50 para cada fármaco individual se muestran (*). (B) Mapas de calor de Bliss Index basados ​​en A para las líneas celulares indicadas sensibles a gefitinib y resistentes a gefitinib en proporciones 2: 1, 1: 1 y 1: 2 de osimertinib, gefitinib y BAY-293 basadas en equivalencias de dosis. Los datos para las células NCI-H1975 son los mismos que en A. Los datos se presentan como la media de tres experimentos independientes. Para cada experimento, se evaluaron tres réplicas técnicas.

Figura 4: datos de origen 1

Análisis de Bliss Independence que muestra que la inhibición de SOS1 se sinergiza con el tratamiento con EGFR-TKI para inhibir la supervivencia en múltiples líneas celulares de NSCLC mutadas en EGFR.

Para cada línea celular sensible a EGFR-TKI de primera generación (HCC827, PC9, H3255), gefitinib y osimertinib no mostraron ninguna sinergia entre sí mediante el análisis de isobolograma (Figura 3) o el análisis de independencia de Bliss (Figura 4), en lugar de mostrar aditivo efectos (CI y BI

1) como se esperaría para dos fármacos con la misma diana molecular. Por el contrario, BAY-293 mostró una sinergia significativa con gefitinib y osimertinib mediante el análisis de isobolograma (Figura 3) y el análisis de Bliss Independence (Figura 4), lo que sugiere que la inhibición de SOS1 puede actuar como un tratamiento secundario para todos los EGFR-TKI. Además, en las tres líneas celulares mutadas T790M (H1975, PC9-TM, H3255-TM), BAY-293 nuevamente mostró sinergia con osimertinib. Estos datos sugieren que la inhibición combinada de SOS1 y EGFR es una sólida combinación terapéutica que actúa sinérgicamente para inhibir el crecimiento de células de adenocarcinoma de pulmón con mutación de EGFR.

La sinergia entre BAY-293 y osimertinib es independiente de SOS2

Demostramos que SOS2 células NCI-H1975 sensibilizadas por deleción al inhibidor de SOS1 BAY-293 (Figura 1F). Queríamos determinar si la sinergia que observamos entre la inhibición de EGFR y SOS1 (Figuras 3 y 4) fue mejorada por SOS2 deleción en líneas celulares de NSCLC mutadas en EGFR. Para examinar si la deleción de SOS2 altera la sinergia entre osimertinib y BAY-293 en células mutadas EGFR (T790M), se eliminó SOS2 en células H1975, PC9-TM y H3255-TM. Para celdas H1975 y PC9-TM, SOS2 Las células KO frente a los controles NT se cultivaron en condiciones de esferoide 3D durante 48 a 72 horas, y luego se trataron con diversas combinaciones DEQ de osimertinib: BAY-293 durante 4 días. Los datos de viabilidad celular se evaluaron utilizando CellTiter-Glo y EC50 Los valores de cada mezcla DEQ se utilizaron para generar gráficos de isobolograma y calcular los intervalos de confianza (Figura 5A y B). Para ambas líneas celulares, SOS2 deleción de células sensibilizadas a BAY-293, disminuyendo la CE50 de 5 a 10 veces en comparación con los controles NT sin alterar la CE50 al tratamiento con osimertinib solo. Sin embargo, a diferencia de lo que observamos en las células de control NT, osimertinib y BAY-293 mostraron solo una sinergia leve en las células mutadas en EGFR donde SOS2 se eliminó según lo evaluado por la distancia de los puntos de interacción a la isobole y el índice de combinación aumentado frente a los controles NT. Además, cuando superponemos el NT y SOS2 Gráficos de isobolograma KO a dos escalas diferentes de BAY-293, los puntos de datos de combinación de fármacos se superpusieron entre NT y SOS2 Células KO, lo que sugiere que SOS2 la deleción no mejoró la sinergia entre osimertinib y BAY-293.

SOS2 la deleción no mejora la interacción sinérgica entre la inhibición de SOS1 y el tratamiento con EGFR-TKI.

(A-B) Análisis de isobolograma (izquierda) e índice de combinación (derecha) de tratamientos de dosis equivalente de osimertinib y BAY-293 en H1975 (A) o PC9-TM (B) celdas donde SOS2 se ha eliminado (azul) frente a los controles NT (negro). Los gráficos superpuestos en dos escalas de dosificación BAY-293 diferentes se muestran debajo de los gráficos de isobologramas individuales. Los efectos aditivos ocurren en las líneas punteadas del diagrama de isobolograma y tienen un CI 0,8-1,2 (cuadro gris), mientras que las interacciones sinérgicas caen por debajo de las líneas punteadas y tienen un CI & lt0,8. (C) Mapas de calor de Bliss Index para celdas H3255-TM donde SOS2 se ha eliminado frente a los controles NT tratados en proporciones 1: 2, 1: 1 y 2: 1 de osimertinib y BAY-293 según las equivalencias de dosis. Los datos se presentan como media +/- s.d.a partir de tres experimentos independientes. Para cada experimento, se evaluaron tres réplicas técnicas.

Figura 5: datos de origen 1

SOS2 la deleción no mejora la interacción sinérgica entre la inhibición de SOS1 y el tratamiento con EGFR-TKI.

Dado que las células H3255-TM no son apropiadas para el análisis de isobolograma lineal entre BAY-293 y osimertinib, en su lugar realizamos un análisis de independencia de Bliss para evaluar la sinergia potencial entre osimertinib y BAY-293 en presencia o ausencia de SOS2. Celdas H3255-TM donde SOS2 Los controles se habían eliminado frente a NT se cultivaron en condiciones de esferoide 3D durante 48 a 72 horas y luego se trataron con dosis crecientes de osimertinib solo, BAY-293 solo o mezclas de cada dosis de fármaco a 1: 2, 1: 1 y Mezclas 2: 1 de osimertinib y BAY-293 basadas en la equivalencia de dosis durante cuatro días. Los datos de viabilidad celular se evaluaron utilizando CellTiter-Glo, y el índice de Bliss se calculó para cada mezcla de fármacos como se muestra en la Figura 2C y la Figura 4. Como fue el caso en las células H1975 y PC9-TM, mientras que SOS2 células H3255-TM sensibilizadas por deleción a BAY-293 observamos una menor sinergia general entre osimertinib y células BAY-293 H3255-TM donde habíamos eliminado SOS2 vs controles NT. Estos datos sugieren que aunque osimertinib y BAY-293 se sinergizan para limitar la viabilidad de las células de adenocarcinoma de pulmón mutadas en EGFR, la sinergia entre osimertinib y BAY-293 es independiente de SOS2.

BAY-293 y osimertinib se sinergizan para inhibir la señalización del efector RAS

Señales EGFR mutadas a través de las vías efectoras RAF / MEK / ERK y PI3K / AKT descendentes para promover la proliferación, transformación y supervivencia. Ya que SOS2 la deleción no mejoró aún más la sinergia entre BAY-293 y osimertinib, planteamos la hipótesis de que la inhibición de SOS1 mejoraba específicamente la inhibición dependiente de EGFR-TKI de la señalización aguas abajo en cultivo 3D. Para realizar experimentos de señalización en esferoides cultivados en 3D, las células se sembraron en placas de cultivo de baja adherencia con micropatrones de 24 pocillos (Aggrewell, StemCell) que contenían

1200 esferoides individuales por condición. Para determinar en qué medida la inhibición y / o la inhibición de SOS1 SOS2 deleción alterada inhibición dependiente de osimertinib de la señalización efectora aguas abajo en cultivo 3D, células H1975 o PC9-TM donde SOS2 se eliminó vs. NT los controles se cultivaron como esferoides durante 48-72 horas y luego se trataron con dosis crecientes de osimertinib +/- BAY-293 antes de la recolección de esferoides, lisis y transferencia de Western para ERK fosforilada y AKT (Figura 6). Tanto en NT como SOS2 células knockout, BAY-293 redujo la dosis de osimertinib necesaria para inhibir la fosforilación de ERK y AKT (Figura 6). Para la señalización Raf / MEK / ERK, el análisis de Bliss Independence de la cuantificación de pERK reveló que la inhibición de SOS1 o SOS2 la deleción sinérgica independientemente con osimertinib para inhibir la señalización de Raf / MEK / ERK, y la combinación de inhibición de la señalización de SOS1 / 2 mejoró aún más esta sinergia. Por el contrario, para la señalización PI3K / AKT SOS2 la deleción no mejoró la sinergia entre osimertinib y BAY-293. Si bien el tratamiento con osimertinib o SOS2 deleción sinérgica independientemente con BAY-293 para inhibir la fosforilación de AKT, SOS2 la deleción no mejoró más la capacidad de osimertinib para inhibir la señalización de PI3K / AKT en presencia o ausencia de BAY-293. Estos datos sugieren fuertemente que la inhibición vertical de EGFR y SOS1 limita la viabilidad de la llamada al inhibir la activación de las vías efectoras RAF / MEK / ERK y PI3K / AKT.

La inhibición de SOS1 se sinergiza con la inhibición de EGFR mutante para inhibir la señalización del efector corriente abajo.

Western blots (A, D), cuantificación de pERK y pAKT (SER) e Índices de felicidad (C, F) de WCL de células NCI-H1975 (C.A, arriba) o celdas PC9-TM (D-F, abajo) cultivados en condiciones de esferoide 3D durante 48 horas y luego tratados con las concentraciones indicadas de EGFR-TKI osimertinib y / o el inhibidor de SOS1 BAY-293 durante 6 horas. Las transferencias de Western son para pEGFR, EGFR, pAKT, AKT, pERK1 / 2, ERK1 / 2, HSP90 y β-actina. Las cuantificaciones de pERK y pAKT se calcularon usando un promedio ponderado de transferencias de Western de proteína total. Los índices de combinación se basan en las cuantificaciones de pERK / proteína total y pAKT / proteína total. Las combinaciones cada vez más sinérgicas se indican en amarillo, naranja, rojo o violeta. Las cuantificaciones de fosfoproteínas se presentan como media +/- s.d. a partir de tres experimentos independientes. Los índices de felicidad se presentan como la media de tres experimentos independientes. Para cada experimento, se evaluaron tres réplicas técnicas.

Figura 6: datos de origen 1

La inhibición de SOS1 se sinergiza con la inhibición de EGFR mutante para inhibir la señalización del efector corriente abajo.

La evaluación del panorama de inhibidores en líneas celulares mutadas en EGFR muestra sinergia tras la inhibición de los efectores de la vía aguas arriba

Dado que los mecanismos de resistencia independientes de EGFR más comunes implican la reactivación de vías RTK / RAS / efectoras (Mancini et al., 2018 Romaniello et al., 2018 La Monica et al., 2017 Eberlein et al., 2015), queríamos evaluar si la inhibición de diferentes proteínas dentro de la vía de señalización EGFR / RAS podría sinergizar para inhibir la supervivencia en 3D de las células cancerosas mutadas en EGFR (T790M). Para determinar las sinergias fármaco-fármaco después de la inhibición de la señalización de la vía EGFR-RAS a diferentes niveles, evaluamos la sinergia entre osimertinib, los inhibidores de los intermediarios de señalización EGFR aguas arriba de RAS (BAY-293 para SOS1 y RMC-4450 para SHP2) e inhibidores de la Vías Raf / MEK / ERK (trametinib) y PI3K / AKT (buparlisib) (Figura 7A). Las células H1975 y PC9-TM se trataron con cada inhibidor individual o mezclas DEQ 1: 1 de cada combinación de fármaco-fármaco, y se calculó el índice de combinación para evaluar la sinergia fármaco-fármaco. Dado que las células H3255-TM no son adecuadas para el análisis de isobolograma, estas células se trataron con mezclas de dosis completas basadas en la equivalencia de dosis y se calculó el índice de felicidad para cada combinación de fármaco-fármaco (Figura 7B). Curiosamente, las tres líneas celulares mostraron sinergia fármaco-fármaco con cualquier combinación de inhibición de EGFR, SOS1 y SHP2. Por el contrario, la inhibición de las vías descendentes Raf / MEK / ERK o PI3K / AKT no logró sinergizar de manera constante ni con osimertinib ni con ningún otro inhibidor (Figura 7B, arriba). Estos datos apoyan la premisa de que la inhibición vertical combinada de la señalización de EGFR proximal puede constituir una estrategia eficaz para tratar los adenocarcinomas de pulmón con mutación de EGFR.

La evaluación del "panorama de inhibidores" de la vía EGFR / RAS sugiere que las terapias de combinación que inhiben EGFR mutado, SOS1 y SHP2 tienen potencial terapéutico en el CPCNP mutado en EGFR.

(A) Diagrama de señalización que muestra los inhibidores de la vía EGFR / RAS cuya sinergia por pares se evaluó mediante análisis de isobolograma utilizando mezclas de dosis equivalentes 50:50 de cada par de fármacos. (B) Mapa de calor de índices de combinación de análisis de isobolograma de las combinaciones de fármaco-fármaco indicadas en NT y SOS2 Líneas celulares KO NSCLC. Las combinaciones sinérgicas se indican en amarillo, naranja o rojo. Los datos se presentan como la media de tres experimentos independientes. (CD) Análisis de isobolograma e índice de combinación (IC) de tratamientos de dosis equivalentes de células NCI-H1975 cultivadas con esferoides 3D tratadas con los dos fármacos (C) o tres fármacos indicados (D) combinaciones de osimertinib (negro), RMC-4550 (violeta) y BAY-293 (rojo). Para la combinación de tres fármacos, los dos fármacos indicados en el eje y se mantuvieron en una proporción de 1: 1 y luego se mezclaron en una proporción de dosis equivalente con el tercer fármaco. Los valores de CI indican una sinergia mejorada más allá de la combinación de dos fármacos en el eje y del gráfico de isobolograma y se calculan en base a la combinación de fármacos del eje y calculada como tratamiento con un solo fármaco. Los efectos aditivos ocurren en las líneas punteadas del diagrama de isobolograma y tienen un CI 0,8-1,2 (cuadro gris), mientras que las interacciones sinérgicas caen por debajo de las líneas punteadas y tienen un CI & lt0,8. (mi) Índices de combinación de combinaciones de dos fármacos de osimertinib (negro), RMC-4550 (violeta) y BAY-293 (rojo) mezclados en proporciones 2: 1, 1: 1 o 1: 2 o la combinación de tres fármacos en una Relación 1: 1: 1 (gris). Los CI se calculan sobre la base de tres tratamientos farmacológicos individuales. (F) Modelo de señalización basado en los datos de las Figuras 1 a 7 que muestran que el direccionamiento combinado de EGFR mutado y SOS1 proporciona una inhibición vertical suficiente de la señalización aguas arriba para inhibir la señalización del efector RAS y bloquear la transformación oncogénica. Esta inhibición sinérgica se puede mejorar aún más mediante la inhibición de SHP2, lo que proporciona múltiples combinaciones de fármacos potenciales para la intervención terapéutica en el NSCLC con mutación de EGFR. Los datos de isobolograma e IC se presentan como media +/- s.d. a partir de tres experimentos independientes. Para cada experimento, se evaluaron tres réplicas técnicas.

Figura 7: datos de origen 1

La evaluación del "panorama de inhibidores" de la vía EGFR / RAS sugiere que las terapias de combinación que inhiben EGFR mutado, SOS1 y SHP2 tienen potencial terapéutico en el CPCNP mutado en EGFR.

SHP2 es importante para la estabilización de los complejos GRB2: SOS1 / 2 en EGFR (Dance et al., 2008), y el mecanismo de los inhibidores alostéricos de SHP2 depende de SOS1 (Nichols et al., 2018), aunque la contribución de SOS2 a No se evaluaron los inhibidores de SHP2. Para determinar si SOS2 deleción alteró el espectro de sinergias fármaco-fármaco en células mutadas en EGFR, se realizaron estudios paralelos en células mutadas en EGFR donde SOS2 fue eliminado (Figura 7B, parte inferior). A diferencia de lo que observamos para la sinergia entre la inhibición de EGFR y SOS1, la sinergia entre la inhibición de SOS1 y SHP2 se vio reforzada por SOS2 supresión. Estos datos sugieren que SOS2 juega un papel en la señalización dependiente de SHP2. La inhibición de SOS1 también se sinergizó con la inhibición de MEK en SOS2 Células KO. Dada la fuerte sinergia entre la inhibición de SOS1 y SOS2 deleción en la inhibición de la señalización de Raf / MEK / ERK (Figura 6), estos datos sugieren que la inhibición profunda de la señalización de MEK es suficiente para inhibir la supervivencia en células mutadas en EGFR.

Para evaluar más a fondo la sinergia entre los inhibidores de la señalización proximal de EGFR, examinamos combinaciones de inhibición de EGFR-SOS1- y SHP2 mediante la evaluación ampliada de cada combinación de dos fármacos y evaluando si la inhibición combinada de EGFR, SOS1 y SHP2 sería más eficaz que dos combinaciones de fármacos de estos inhibidores. Para evaluar cada combinación de dos fármacos, las células H1975 cultivadas en condiciones de esferoide 3D se trataron con combinaciones de dosis equivalentes de osimertinib, BAY-293 y RMC-4550, se evaluaron la viabilidad celular y se sometieron a análisis de isobolograma para evaluar la sinergia fármaco-fármaco . Cada combinación de dos fármacos mostró sinergia en tres proporciones de DEQ diferentes (Figura 7C), lo que sugiere que la inhibición de dos proteínas de señalización proximales cualesquiera puede ser un régimen terapéutico eficaz para tratar el cáncer mutado en EGFR. Para evaluar si la adición de un tercer inhibidor proximal a cada combinación de dos fármacos mejoraría aún más la inhibición sinérgica de la supervivencia del esferoide, cada combinación de dos fármacos se mezcló en una proporción de 1: 1 y luego se añadió un tercer inhibidor de la vía proximal para obtener los tres inhibidores indicados. -mezclas de fármacos (Figura 7D). El análisis de isobolograma de estas tres mezclas de fármacos reveló que la adición de un tercer inhibidor de la vía proximal a cualquier combinación de dos fármacos de osimertinib, BAY-293 y RMC-4550 mejoró aún más la sinergia por encima de lo observado para cada combinación de dos fármacos (Figura 7D) . Finalmente, comparar el índice de combinación para la combinación de tres fármacos en una proporción de 1: 1: 1 cuando cada fármaco se trata de forma independiente versus las combinaciones de dos fármacos mostró una sinergia marcada para la combinación de tres fármacos, pero que esta sinergia no mejoró significativamente en comparación a la combinación de osimertinib y BAY-293 (Figura 7E). Estos datos indican que la inhibición vertical de la señalización proximal de EGFR con la combinación de osimertinib y un inhibidor de SOS1 puede ser la combinación terapéutica más eficaz para tratar EGFRNSCLC mutado.


Discusión

Cbl-c es un miembro de la familia Cbl Ring Finger E3 [14, 17]. Al igual que otros miembros de la familia Cbl, Cbl-c puede regular negativamente la señalización de RTK ubiquitinando y regulando negativamente las RTK activadas como EGFR y RET [18, 21, 24, 36, 37]. Cbl-c se expresa predominantemente en células epiteliales, mientras que Cbl y Cbl-b se expresan de forma más ubicua [13, 14, 38]. Las mutaciones en Cbl que anulan la actividad de E3 y crean una proteína Cbl negativa dominante que puede bloquear la interacción entre otras proteínas Cbl y las RTK diana se han descrito en

5% de las neoplasias mieloides [12]. En este trabajo, identificamos mutaciones en E3 Cbl-c en un cáncer de mama murino y en tumores sólidos humanos que inactivarían la actividad E3 de Cbl-c y, en algunos casos, crearían proteínas negativas dominantes que podrían interferir con la actividad de las células silvestres endógenas. proteínas de tipo Cbl.

La mutación murina (Cbl-c Δex7) se produjo en un tumor mamario que surgió en un modelo de ratón modificado genéticamente: el modelo de ratón transgénico C3 (1) SV40 con antígeno T grande de cáncer de mama [28, 29]. El cDNA de Cbl-c que se clonó a partir de este tumor expresa una forma de Cbl-c que carece del exón 7, lo que resulta en una deleción en marco de la parte distal de la región del enlazador y la parte proximal del dominio de RF (Fig. 1). En linfomas murinos y neoplasias mieloides humanas se observan deleciones en marco similares de parte o de la totalidad de los RF en Cbl (revisado en [12]). Se han descrito varios mecanismos para la generación de estas deleciones en marco en el ARNm, incluidas mutaciones puntuales, inserciones o deleciones en los sitios donantes y aceptores de empalme que rodean los exones del enlazador y RF y deleciones más grandes que abarcan uno o más exones [12]. El ADNc mutante de Cbl-c se secuenció como parte de un proyecto de secuenciación de ADNc a gran escala y se envió a GenBank en 2005 [39]. Dado que el tumor, el ARNm, la biblioteca de ADNc o el ADNg derivado del tumor ya no están disponibles, no podemos identificar definitivamente el mecanismo por el cual se produjo esta deleción en marco del exón 7.

La mutación en Cbl-c probablemente surgió como un segundo golpe en un tumor de mama impulsado por Tag [28, 29]. De acuerdo con esto, no hay evidencia de deleción por análisis de Southern (Fig. 1C) o INDEL pequeños o mutaciones por análisis de secuencia en el ADNg de las cepas de ratón parentales o transgénicas. Además, el mutante Cbl-c Δex7 no transformó las células NIH 3T3 en un ensayo de focos por sí mismo, sino que aumentó la frecuencia de células transformadas cuando se cotransfectaron con Tag (Fig. 2). No identificamos otras mutaciones en Cbl-c en 21 tumores adicionales, lo que indica que tales mutaciones de Cbl-c son raras en este entorno. En un modelo animal de síndrome mielodisplásico se han observado raras mutaciones de segundo efecto en Cbl [40].

La deleción en el ADNc de Cbl-c Δex7 codifica una proteína que carece del enlazador crítico tirosina que se fosforila para activar la actividad E3 de las proteínas Cbl [35, 41, 42] y los primeros 4 aminoácidos coordinadores de zinc de la RF (Fig. 1). Como se esperaba, la proteína Cbl-c Δex7 carece de actividad E3 como se demuestra por la falta de aumento en la ubiquitinación del EGFR activado cuando se cotransfecta con Cbl-c Δex7 en comparación con la proteína Cbl-c de tipo salvaje (Fig. 3A). Las proteínas Cbl interactúan con el EGFR activado a través de su dominio TKB N-terminal [1] que está intacto en la proteína Cbl-c Δex7. El mutante puede interactuar con el EGFR a través del dominio TKB pero no puede ubiquitinar el EGFR. El mutante Cbl-c Δex7 evita la ubiquitinación del EGFR activado por WT Cbl-c (Fig. 3B). Por tanto, la Cbl-c Δex7 actúa como una proteína negativa dominante e inhibe la ubiquitinación del EGFR por la Cbl-c de tipo salvaje (Fig. 3B).

Se ha demostrado que las proteínas Cbl interactúan y regulan negativamente muchas vías de señalización RTK y no RTK [1, 17], de modo que la función negativa dominante de Cbl-c Δex7 podría tener amplios efectos al inhibir la función de otras proteínas Cbl. Para probar si Cbl-c Δex7 podría inhibir de manera similar otras proteínas Cbl, sobreexpresamos WT Cbl en presencia y ausencia de Cbl-c Δex7 y medimos la ubiquitinación y la regulación negativa de EGFR estimulado por EGF y la asociación de Cbl con EGFR activado. Nuestros datos muestran que Cbl-c Δex7 fue capaz de inhibir el reclutamiento de WT Cbl a EGFR y, como resultado, inhibir la ubiquitinación de EGFR (Fig. 4B-4D). También demostramos que Cbl-c Δex7 previene la regulación a la baja de EGFR activado, que podría estimular la proliferación en células cancerosas epiteliales dependientes de EGFR. Nuestros hallazgos también son consistentes con otras mutaciones Cbl negativas dominantes y sus efectos inhibidores sobre la función de la proteína endógena.

Exploramos el espectro de mutaciones de Cbl-c en tumores humanos en la base de datos cBioPortal for Cancer Genomics (Tabla 1, Fig. 5) [25, 26, 31]. La mayoría de las mutaciones ocurren en tumores sólidos, pero el número de neoplasias hematológicas en esta base de datos es relativamente bajo (Tabla 1). En general, las mutaciones en Cbl-c son poco frecuentes (112 o & lt0,5%) y fueron más frecuentes en melanoma, cáncer colorrectal y cáncer de endometrio (2,9, 0,96 y 0,95%, respectivamente) (tabla 1). Todos estos tipos de tumores tienen cargas mutacionales relativamente altas, siendo el melanoma el más alto de todos los tumores, por lo que esta alta frecuencia puede reflejar una alta tasa de mutación general y no indicar un papel específico para Cbl-c [43]. A modo de comparación, las mutaciones de Cbl y Cbl-b en la misma base de datos fueron más frecuentes (199 y 210 para Cbl y Cbl-b, respectivamente) (Figura S1, Tabla S1 y Tabla S2). Esto puede reflejar el mayor tamaño de los exones y los loci genómicos para Cbl y Cbl-b en comparación con Cbl-c. Las regiones codificantes de Cbl y Cbl-b son

2 veces más grande que el de Cbl-c (3081, 3971, frente a 1574 pb, respectivamente) y los loci genómicos para Cbl y Cbl-b son considerablemente más grandes que los de Cbl-c (

20 kb, respectivamente) [30]. Al igual que en Cbl-c, los tumores con las mutaciones más frecuentes en Cbl y Cbl-b fueron nuevamente melanoma, cáncer de endometrio, cáncer colorrectal y cáncer de pulmón de células no pequeñas (Tabla S1 y Tabla S2). Las mutaciones de Cbl se han descrito previamente en el cáncer de pulmón de células no pequeñas [44]. A diferencia de Cbl-c (o Cbl-b), se han encontrado mutaciones de Cbl en

5% de las neoplasias mieloides que incluyen síndrome mielodisplásico, mielofibrosis, anemia refractaria con exceso de blastos, leucemia mieloide aguda de novo y secundaria, leucemia mielógena crónica atípica, LMC en crisis blástica, leucemia mielomonocítica crónica y leucemia mielomonocítica juvenil (revisado en [1, 12 ]). La base de datos de cBioPortal for Cancer Genomics tiene pocas de estas neoplasias, por lo que esto no se vio en nuestra evaluación. Sin embargo, la evaluación de las neoplasias mieloides & gt2000 ha encontrado mutaciones de Cbl en aproximadamente el 5% de estas neoplasias [1, 12]. Las mutaciones de Cbl-c y Cbl-b en neoplasias mieloides son mucho menos comunes (

5 mutaciones en cada uno informado) y su importancia en las neoplasias mieloides no está clara [1, 12].

Es probable que muchas de las mutaciones sin sentido de Cbl-c observadas en tumores sólidos sean mutaciones pasajeras. Sin embargo, 11 de las 97 mutaciones sin sentido se producen en la región del enlazador o en la RF y podrían potencialmente interrumpir la función de E3 (Fig. 5).Varias de estas mutaciones ocurren en aminoácidos que se sabe que son importantes para la función E3, incluida una mutación en la tirosina enlazadora conservada (Y341C), dos mutaciones puntuales en un triptófano en el RF (W378C) y una mutación en la arginina que se encuentra inmediatamente después la última cisteína coordinadora de zinc (R390H). Las mutaciones de cada uno de los residuos de aminoácidos correspondientes en Cbl anulan la actividad de E3 [32, 34, 35, 41, 42]. Hay 7 mutaciones de truncamiento que interrumpirían la proteína Cbl-c antes o dentro de la RF y, por lo tanto, se predeciría que anularían la función E3 (Fig. 5). Finalmente, hay dos mutaciones en el sitio de empalme que podrían potencialmente conducir a deleciones o cambios de marco que podrían interrumpir la actividad de E3 (Fig. 5). En total, 20 de las 112 mutaciones pueden provocar una alteración funcional de la proteína. El análisis de las mutaciones Cbl y Cbl-b encontradas en la base de datos cBioPortal for Cancer Genomics encontró que había una fracción similar de las mutaciones generales que podrían alterar la función E3 (33 y 15 para Cbl y Cbl-b, respectivamente).

Probamos la capacidad de una mutación de truncamiento Cbl-c (A232Gfs * 14) y una mutación puntual Cbl-c (Y341C) para ubiquitinar el EGFR activado en las células y, como se predijo, ambas mutaciones anulan la actividad de E3 (Fig. 5). Sin embargo, las mutaciones se comportaron de manera diferente en su capacidad para actuar de manera dominante negativa. Sólo Cbl-c Y341C actuó como una proteína negativa dominante, mientras que Cbl-c A232Gfs * 14 no interrumpió la ubiquitinación por las proteínas WT Cbl (Figuras 5B, 6 y 7). La mutación Cbl-c Y341C deja intacto el dominio TKB, por lo que esta proteína puede interactuar con el EGFR activado (Fig. 5C). Si bien Cbl-c Y341C no logra ubiquitinar el EGFR, también evita la ubiquitinación bloqueando el reclutamiento de la proteína WT Cbl hacia su sustrato diana (Fig. 6D). Esta inhibición de la función de E3 por la mutación puntual bloquea posteriormente la regulación a la baja del EGFR estimulado (figura 6C). Por el contrario, la mutación de truncamiento altera la proteína Cbl-c dentro del TKB y, por tanto, el mutante Cbl-c A232Gfs * 14 no puede interactuar con el EGFR (Fig. 5C). Como resultado, la expresión de Cbl-c A232Gfs * 14 no interrumpe el reclutamiento de WT Cbl al EGFR activado, no bloquea la ubiquitinación por WT Cbl y no inhibe la regulación a la baja del EGFR activado por WT Cbl. (Figura 7). Estos datos sugieren que las mutaciones o truncamientos que alteran la RF pero dejan intacto el dominio TKB tienen más probabilidades de tener efectos significativos debido a su capacidad para interferir con las proteínas Cbl de tipo salvaje en la célula.

En general, estos datos identifican mutaciones de Cbl-c que ocurren en tumores sólidos humanos y alteran la actividad de E3. Hasta donde sabemos, esta es la primera descripción de mutaciones de Cbl-c que pueden contribuir al desarrollo de tumores sólidos humanos. Además, se encuentran mutaciones similares en Cbl y Cbl-b de tumores sólidos, lo que sugiere que Cbl-c y las proteínas Cbl en general pueden contribuir a la patogénesis de los tumores sólidos humanos.


Fondo

El cáncer de mama es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad entre la población femenina de todo el mundo. La incidencia del cáncer de mama difiere considerablemente en todo el mundo. Se espera que afecte a 0,2 millones y provocaría unas 41 070 muertes en 2017 en EE. UU. [1]. El cáncer de mama surge como consecuencia de la desregulación de diferentes vías de señalización en las células epiteliales mamarias. Los factores de crecimiento y las quimiocinas activan varias cascadas de señalización que se entrecruzan en el microambiente del tumor y conducen a la progresión del cáncer. Se unen a diferentes familias de receptores. Receptor Tyrosina Kinasas (RTK) comprenden una de esas familias. Las RTK son proteínas transmembrana de un solo paso, expresadas en varios tipos de células, incluidas las del microambiente tumoral. Sobreexpresión de varios tipos de RTK, como los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), los receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), los receptores del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFR) y los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) se encuentra en diferentes tipos de cáncer, incluido el de mama [2, 3, 4]. Los niveles elevados de RTK se asocian con una mayor agresividad del cáncer de mama y una menor supervivencia global y libre de enfermedad [5]. La unión de ligandos conduce a cambios conformacionales en las RTK que dan como resultado la activación de moléculas de señalización aguas abajo. Las vías importantes que se sabe que son activadas por RTK incluyen proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), Janus quinasa (JAK) / transductor de señal y activador de la transcripción (STAT) y fosfoinositido 3-quinasa (PI3K) / Akt [6,7 , 8,9,10]. Las vías reguladas por RTK juegan un papel clave en varias facetas de la progresión del cáncer. La señalización activada por RTK también induce el fenotipo de células madre cancerosas (CSC) que presentan resistencia a los regímenes terapéuticos [6, 9]. La progresión del cáncer no solo está regulada por redes de señalización autónomas, sino también por señales moleculares dependientes del contexto recibidas del estroma tumoral. El estroma tumoral consta de varios tipos de células no cancerosas, como fibroblastos, células endoteliales, macrófagos y otras células inmunitarias [11]. La interacción regulada por la señalización RTK entre el tumor y las células estromales contribuye a la remodelación tisular, el reclutamiento y la activación de las células estromales. La supervivencia de las células cancerosas diseminadas en los sitios metastásicos requiere la formación del nicho premetastásico por las células estromales. Se sabe que las células estromales que expresan RTK se reclutan en sitios metastásicos y se ha descubierto que forman un nicho premetastásico a través de la señalización regulada por RTK [8]. Las RTK también regulan la diferenciación trans de las células cancerosas a células endoteliales para formar nuevos vasos sanguíneos en un proceso conocido como mimetismo vasculogénico [12, 13]. Dado que las RTK desempeñan un papel importante en diferentes aspectos de la progresión del cáncer de mama, las RTK dirigidas podrían ser útiles en el tratamiento del cáncer. A lo largo de los años, se han examinado y probado varios inhibidores de RTK en ensayos clínicos. Algunos de ellos, como el lapatinib, trastuzumab y bevacizumab, han sido aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de EE. UU. Para el tratamiento clínico del cáncer de mama. Curiosamente, los inhibidores de RTK revierten la resistencia a múltiples fármacos inducida por la terapia convencional y mejoran la supervivencia libre de enfermedad en pacientes con cáncer de mama metastásico [14]. Aunque la terapia anti-RTK muestra beneficios clínicos en pacientes con cáncer de mama, desafortunadamente, se desarrollan células cancerosas de novo o resistencia adquirida que limita el éxito de la terapia dirigida a RTK [15]. En esta revisión, nos ocupamos de la señalización de EGFR, VEGFR, PDGFR y FGFR en la progresión del cáncer de mama, el mantenimiento del fenotipo de las células madre del cáncer, la interacción tumor-estroma y la resistencia a los fármacos. Además, esta revisión también analiza los principales desafíos en la selección de los RTK para el tratamiento exitoso del cáncer de mama.

Estructura y clasificación de RTK

Se han caracterizado cincuenta y ocho RTK diferentes en humanos y se han clasificado en 20 subfamilias diferentes sobre la base de características estructurales. Cada subfamilia RTK exhibe un prototipo de organización estructural junto con características específicas de clase. Un prototipo de RTK tiene un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio de tirosina quinasa intracelular separados por un dominio transmembrana. Las subfamilias de RTK son (1) EGFR, (2) InsR, (3) PDGFR, (4) VEGFR, (5) FGFR, (6) PTK7 / CCK4, (7) Trk, (8) Ror, (9) MuSK, (10) Met, (11) Axl, (12) Tie, (13) EphA / B, (14) Ret, (15) Ryk, (16) DDR1 / 2, (17) Ros, (18) LMR , (19) ALK y (20) SuRTK106 / STYK1. El dominio intracelular de las RTK tiene actividad tirosina quinasa (dominio tirosina quinasa TKD). Este dominio de tirosina quinasa puede fosforilar residuos de tirosina en cis (dentro de la misma molécula) o en trans (que reside en una molécula diferente) (Fig. 1). Se ha descubierto que este diseño de consenso de RTK se conserva a lo largo de la evolución. Se ha descubierto que las mutaciones en los RTK que dan lugar a anomalías estructurales provocan diversos trastornos.

Estructura del prototipo del receptor tirosina quinasa y mecanismo de activación. Las tirosina quinasas receptoras (RTK) tienen los siguientes segmentos estructurales desde el extremo N al C terminal: pliegues de inmunoglobulina, región transmembrana, región yuxtamembrana, lóbulo N, bucle de activación, lóbulo C y cola citoplasmática. Los RTK residen en la membrana plasmática como monómero. La unión de ligandos reticula las moléculas receptoras e induce cambios conformacionales que conducen a la autofosforilación y activación del receptor. RTK fosforilado sirve como un sitio de acoplamiento para proteínas adaptadoras (B) o puede fosforilar directamente moléculas de señalización (A). Las proteínas adaptadoras o moléculas de señalización se unen al receptor fosforilado a través de la homología Src 2 (SH2) o el dominio de unión a fosfotirosina (PTB). Las proteínas adaptadoras acopladas transducen aún más la señal mediante la fosforilación de otras moléculas aguas abajo (C, D)

Las RTK se activan mediante la unión de ligandos solubles. Algunas de las RTK (DDR1, DDR2) no son activadas por ligandos solubles sino por fibras de colágeno de la matriz extracelular [16]. Dos eventos obligatorios en la activación de RTK son la unión del ligando y la dimerización del receptor. Aunque la idea anterior era que la unión del ligando afín da como resultado en última instancia la dimerización del receptor, se ha descubierto que pocas RTK son oligoméricas incluso en ausencia de ligandos [17]. El EGFR está presente principalmente como monómero, mientras que el receptor de insulina está presente como dímero en la membrana celular [18]. No obstante, la activación del receptor requiere la unión del ligando y la consiguiente dimerización u oligomerización del primero en un estado activo. Diferentes grupos de investigación han explicado diferentes mecanismos para la dimerización del receptor inducida por la unión de ligandos para diferentes clases de RTK. Los mecanismos incluyen dos extremos en los que la interfaz del dímero está formada en su totalidad por el ligando o las moléculas receptoras. Los otros dos mecanismos incluyen la participación tanto del ligando como del receptor para la formación de la interfaz del dímero y, en otro caso, la participación de una molécula accesoria. Un ejemplo del primer mecanismo es la activación del receptor del factor de crecimiento nervioso (NGF), TrkA, donde sólo dos moléculas de NGF forman la interfaz del dímero y ninguno de los dominios extracelulares del receptor hace contacto físico con la molécula vecina [19, 20]. Los ligandos que activan a los miembros de la familia EGFR no forman por sí mismos dímeros, sino que se unen a dos dominios diferentes de la misma molécula e inducen cambios conformacionales favorables que conducen a la formación de la interfaz del dímero por las moléculas receptoras [21]. El factor de células madre (SCF) se une a su receptor, KIT, e induce la dimerización del receptor, donde la interfase del dímero está formada por moléculas tanto del ligando como del receptor [22]. En el caso de FGFR, la molécula de heparina estabiliza la configuración del dímero de FGFR después de la unión del ligando (factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)) [23].

En ausencia de ligandos afines, los RTK se mantienen en un estado inactivo por mecanismos autoinhibidores. Se han descrito dos mecanismos autoinhibidores diferentes para diferentes familias de RTK. El TKD de los RTK contiene tres elementos esenciales, el lóbulo N, el lóbulo C y el bucle de activación [24]. En el mecanismo autoinhibidor mediado por el bucle de activación, el bucle de activación hace contacto físico con el sitio activo de la TKD. Un residuo de tirosina crítico en el circuito de activación se fosforila y la actividad de tirosina quinasa se autoinhibe en cis [25]. En el otro mecanismo, las secuencias de yuxtamembrana hacen un contacto extenso con el sitio activo del TKD y este último se detiene en una conformación inactiva autoinhibida [26, 27, 28]. La unión del ligando induce cambios conformacionales favorables que eliminan las autoinhibiciones que siguen a la dimerización del receptor. Los RTK activados pueden reclutar muchas moléculas efectoras aguas abajo. Estas moléculas contienen dominios SH2 o PTB que se unen a residuos de fosfotirosina en RTK [29]. Estas proteínas pueden interactuar directamente con las RTK activadas o pueden interactuar con otras proteínas de acoplamiento que son tirosina fosforiladas por las RTK. Algunas de las proteínas de acoplamiento bien conocidas que orquestan la formación de grandes complejos de proteínas aguas abajo de la activación de RTK son el sustrato 2 del receptor de FGF (FRS2), el sustrato del receptor de insulina 1 (IRS1) y el aglutinante 1 asociado a Grb2 (Gab1). Algunas de las proteínas de acoplamiento tienen especificidad en términos de las clases de RTK a las que se unen, mientras que otras proteínas de acoplamiento se unen a miembros de RTK de diferentes familias. Un solo RTK puede unirse a diferentes ligandos. EGFR se une a siete ligandos diferentes [30]. La fuerza de interacción con RTK varía para estas diferentes moléculas de ligando. Los atributos de la conformación activa del receptor dimerizado difieren mucho para diferentes ligandos. Diferentes conformaciones de dímeros activos de RTK activan diferentes cascadas de señalización aguas abajo [31]. Los reordenamientos y mutaciones genéticas confieren ciertas características estructurales a las RTK que dan como resultado la dimerización y activación del receptor independiente del ligando. La activación aberrante de RTK por tales medios puede conducir a una fisiopatología diferente. Los reordenamientos de genes pueden conducir a una espiral enrollada anormal y conformaciones de cremallera de leucina del dominio extracelular que inducen la asociación de RTK independiente del ligando. Las mutaciones que dan lugar a residuos de cisteína en el dominio extracelular también pueden inducir la asociación permanente de dos monómeros RTK [32]. Las mutaciones del dominio transmembrana también pueden dar lugar a una dimerización constitutiva de las RTK que conducen a determinadas fisiopatologías [33]. Además de la clasificación descrita anteriormente, los RTK también se han categorizado en función de la similitud del patrón de señalización y expresión aguas abajo en los tejidos. Tres de estas clases son (1) EGFR / FGFR1 / c-Met, (2) IGF-1R / NTRK2 y (3) PDGFRβ [34].

Células madre del cáncer de mama y resistencia a los medicamentos

A pesar del advenimiento de nuevas vías terapéuticas, la recaída del tumor sigue siendo un desafío mayor en el tratamiento del cáncer de mama. Hay varias razones para la recurrencia del tumor, incluidas las células madre del cáncer de mama (BCSC) que residen en el tumor primario y en los sitios metastásicos. Las CSC son una subpoblación de células tumorales que tienen el potencial de autorrenovarse e impulsar la tumorigénesis. Las BCSC se caracterizan por la expresión de marcadores específicos de la superficie celular, incluidos EpCAM + / CD24 - / CD44 + [35]. Además, se ha informado de que las CSC también expresan un alto nivel de aldehído deshidrogenasa (ALDH) y se asocia con un resultado clínico deficiente [36]. Sin embargo, un estudio reciente sugiere que las CSC de EpCAM + / CD24 - / CD44 + son anatómicamente distintas de las CSC de ALDH + ve. El perfil molecular de las CSC de EpCAM + / CD24 - / CD44 + y ALDH + ve reveló que las subpoblaciones anteriores exhiben un fenotipo de transición epitelial a mesenquimal (EMT) inactivo, mientras que las CSC de ALDH + ve muestran un fenotipo epitelial con capacidad de autorrenovación [37] . El microambiente tumoral está formado por fibroblastos asociados al cáncer (CAF), macrófagos asociados al tumor (TAM), células madre mesenquimales (MSC) y otras células inmunes y vasculares que participan en el mantenimiento de las CSC en el cáncer de mama [11, 38]. La señalización de RTK en células tumorales y estromales desempeña un papel fundamental en la regulación de los fenotipos de CSC tanto CD24 - como CD44 + y ALDH + ve. Las CSC exhiben un gran impacto en la terapia del cáncer, ya que muestran resistencia a las quimioterapias convencionales al expresar genes de resistencia a múltiples fármacos (MDR). La fracción de células tumorales CD44 + / CD24 - aumenta en pacientes con cáncer de mama tras la administración de quimioterapia neoadyuvante [39]. Además, la quimioterapia basada en paclitaxel y epirrubicina se asocia con el enriquecimiento de células ALDH + ve en los tumores de mama [40]. La expresión alterada / desregulación de RTK se asocia con el fenotipo BCSC y la resistencia a los fármacos. Varios informes sugieren que el tratamiento del cáncer de mama con terapias basadas en RTK revierte la resistencia a múltiples fármacos [41,42,43]. El papel de la señalización de RTK en la regulación del fenotipo de CSC y la resistencia a los fármacos se ha discutido más a fondo.

Papel de la señalización del receptor de tirosina quinasa (RTK) en la progresión del cáncer de mama

EGFR: un regulador clave del fenotipo de las células madre del cáncer y la metástasis en el cáncer de mama inflamatorio

El EGFR se sobreexpresa en los tejidos del cáncer de mama y se asocia con una mayor agresividad y malos resultados clínicos [44, 45]. El EGFR es un RTK clásico y sufre homo o heterodimerización y trans-autofosforilación al unirse al ligando. Los EGFR poseen siete ligandos afines diferentes que incluyen EGF, TGFα, betacelulina (BTC), EGF de unión a heparina, anfirregulina (AREG), epirregulina y epigen. La familia EGFR consta de EGFR1 (EGFR, HER1, c-erbB1), HER2 (EGFR2, c-erbB2), EGFR3 (c-erbB3, HER3) y EGFR4 (c-erbB4, HER4) [46, 47]. Witton y col. han examinado la expresión de EGFR1, HER2, EGFR3 y EGFR4 usando inmunohistoquímica en 220 pacientes con cáncer de mama y han encontrado sobreexpresión de EGFR1 en 16,4%, HER2 en 22,8%, EGFR3 en 17,5% y EGFR4 en 11,9% de los tejidos de cáncer de mama. Las expresiones aumentadas de EGFR1, HER2 o EGFR3 se asociaron con una supervivencia reducida, mientras que el nivel elevado de EGFR4 se relacionó con una mejor supervivencia de los pacientes con cáncer de mama. También se ha informado de que el aumento de la expresión de EGFR1, HER2 y EGFR3 se combinó con una expresión reducida del receptor de estrógeno (RE) [48]. Al unirse al ligando, EGFR activa varias moléculas de señalización aguas abajo, incluidas Ras, PI3K, fosfolipasa C-γ (PLC-γ) y JAK, lo que conduce a la supervivencia celular, el crecimiento celular y la progresión del tumor (Fig. 2) [6, 49, 50]. Varios estudios encontraron que la expresión de ER se correlaciona inversamente con EGFR o el fenotipo de células madre cancerosas y eso está bien respaldado por los datos que indican una mayor expresión de EGFR y presencia de población de células madre en TNBC que carecen de expresión de ER [51]. Para investigar si EGFR regula el tallo en el cáncer de mama, Wise et al. han estudiado el enriquecimiento de células madre cancerosas bajo activación de EGFR. Encontraron que la activación de EGFR dependiente de metaloproteinasas enriquece las células madre CD44 + / CD24 - en TNBC a través de la vía MAPK / ERK (Fig. 2) [6]. El cáncer de mama inflamatorio (CMI) (especialmente el cáncer de mama inflamatorio) es una forma más letal y agresiva de cáncer de mama que se caracteriza por el enriquecimiento de células madre cancerosas quimio-resistentes y radio-resistentes [52, 53]. Varios informes sugieren que la señalización de EGFR es importante para la patogénesis y progresión de IBC [54, 55]. La activación de NF-κB en IBC conduce a la regulación a la baja del ER y la sobreexpresión de EGFR y / o ErbB2 y la hiperactivación de MAPK. La firma MAPK distingue mejor el IBC de los tumores no IBC que la estratificación basada en ER (54). Wang y col. han identificado que la señalización nodal regulada por el eje EGFR / ciclooxigenasa-2 (COX-2) promueve el fenotipo CSC y aumenta la capacidad de invasión de las células IBC a través de la inducción de EMT (Fig. 2) [55]. El programa de EMT inducido por TGF-β aumenta la expresión de RTK como EGFR e IGF-1R que forman complejos citoplasmáticos con ER-α y Src que conducen a la resistencia a los antiestrógenos en el cáncer de mama [56]. Syndecan-1 (CD138) se sobreexpresa y se asocia con la proliferación e invasión celular, y surgió como un importante objetivo farmacológico en IBC. Ibrahim y col. han establecido la relación entre Syndecan-1 y EGFR en la regulación del fenotipo de células madre cancerosas en TNBC inflamatorio.Sus estudios revelaron que Syndecan-1 regula la expresión de EGFR a través de la activación de la señalización Notch. La diafonía Syndecan-1 / Notch / EGFR modula la interleucina-6 (IL-6), gp130 y otras expresiones de citocinas inflamatorias, por lo que promueve la formación de colonias y la expresión de marcadores de células madre a través de la activación de NFκB mediada por Akt (Fig. 2) [9].

Señalización regulada por RTK en la progresión del cáncer de mama. VEGFR activa la vía de señalización JAK / STAT para inducir el fenotipo de células madre cancerosas a través de la expresión de Myc y Sox2. La p53 mutante induce la expresión de VEGFR a través de la interacción con el complejo SWI / SNF. La señalización regulada por EGFR también juega un papel fundamental en la angiogénesis y la metástasis. EGFR regula la activación de la vía de señalización JAK / STAT y MAPK para inducir la expresión de Sox2 y otros marcadores de células madre que conducen al enriquecimiento de las células madre cancerosas. EGFR induce la fosforilación de Akt para promover la inflamación. El PDGFR se expresa en células estromales como los fibroblastos y es un marcador de la activación de los fibroblastos. La activación de STAT regulada por PDGFR participa en la regulación de la diferenciación mediada por miR-9 de células cancerosas a células endoteliales que conducen a la angiogénesis. La vía MAPK activada por FGFR induce el fenotipo EMT y CSC. La cooperación entre el FGFR y HER2 regula la translocación nuclear de la ciclina D1, lo que conduce a una mayor proliferación de células cancerosas.

La autofagia exhibe un papel de doble filo en la progresión del tumor según el contexto de un tumor. Un estudio reciente ha revelado que la autofagia regula el enriquecimiento de células madre cancerosas ALDH + ve a través de la señalización EGFR / Stat3 en el cáncer mamario murino PyMT (Fig. 2) [57]. El estroma tumoral también induce el fenotipo de las células madre cancerosas al interactuar con el EGFR que está presente en las células cancerosas a través de diferentes agentes moleculares posteriores [58]. En una línea similar de evidencia, Yang et al. han informado que la activación de EGFR en células cancerosas por TAM conduce a la expresión de Sox2 mediada por Stat3 que resultó en un aumento de la población de células madre cancerosas y metástasis en modelos murinos de cáncer de mama (Fig. 2) [59].

VEGFR: ganglios maestros en metástasis regulada por VEGF, angiogénesis tumoral y linfangiogénesis

Varios estudios establecieron que la angiogénesis es indispensable para la progresión del tumor de mama. Los VEGF son potentes factores proangiogénicos que se unen a tres tipos diferentes de VEGFR, VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (KDR u homólogo murino, Flk1). Los VEGFR se expresan en células cancerosas, endoteliales y otras células estromales. Los VEGFR son RTK típicos que contienen un dominio extracelular para la unión del ligando, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático que incluye un dominio tirosina quinasa (TKD) [38]. VEGF-A se une a VEGFR1 y VEGFR2 para inducir la angiogénesis tumoral, mientras que VEGF-C y D interactúan con VEGFR3 para promover la linfangiogénesis en diferentes tipos de cáncer [38, 60]. Sin embargo, Laakkonen et al. han informado de que la señalización de VEGFR3 regulada por VEGF-C y VEGF-D induce la angiogénesis tumoral [61]. Chakraborty y col. han demostrado que la osteopontina (OPN) aumenta la expresión de VEGF-A en células de cáncer de mama e induce el crecimiento tumoral y la angiogénesis mediante la regulación de la señalización de VEGF / VEGFR autocrina, paracrina y yuxtacrina en células cancerosas y endoteliales [62]. Srabovic y col. han informado de que la expresión de VEGFR1 aumenta significativamente en los tejidos tumorales de mama en comparación con los tumores benignos o los tejidos circundantes sanos, independientemente del estado de metástasis en los ganglios linfáticos [63]. Kosaka y col. han identificado niveles elevados de ARNm de VEGFR1 en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama y que se asocia con metástasis y recurrencia del cáncer y podría utilizarse para el pronóstico del cáncer de mama con enfermedades de tipo basal y luminal [64]. En un estudio reciente, Kapahi et al. han revelado que el polimorfismo VEGFR1-710C / T se asocia con un mayor riesgo de cáncer de mama en la población del norte de la India [65]. Ning y col. han revelado que la activación de VEGFR1 induce la EMT de las células cancerosas promoviendo así la invasión y la metástasis en modelos de cáncer de mama [66]. La evidencia acumulada sugiere que los macrófagos infiltrados en el microambiente tumoral promueven la progresión maligna y mejoran la metástasis [11, 67]. Un informe reciente ha sugerido que la señalización de VEGFR1 regula la tumorigénesis inducida por obesidad. La ablación de VEGF1 en animales obesos redujo el crecimiento del cáncer de mama y la metástasis pulmonar al disminuir la polarización de los macrófagos M2 y afectar el metabolismo de la glucosa (Fig. 2) [67]. Una evidencia reciente sugiere que los macrófagos asociados a metástasis (MAM) de Flt1 + ve, un subconjunto de TAM, están enriquecidos en el cáncer de mama metastásico en comparación con los tumores primarios. La señalización de Flt1 en MAM regula un conjunto de genes inflamatorios imprescindibles para la supervivencia de las células cancerosas después de la siembra metastásica. Además, las células mieloides VEGFR1 + ve circulantes participan en la formación de nichos premetastásicos [8, 68]. Los TAM polarizados CYP4A estimulan la formación de nichos premetastásicos y la metástasis en los pulmones mediante la movilización y el reclutamiento de células mieloides VEGFR1 + ve (fig. 2) [68]. VEGR-2 es un regulador clave de la angiogénesis y se sobreexpresa en los tejidos del cáncer de mama [69]. Pfister y col. han estudiado la activación de la expresión del gen VEGFR2 por p53 mutante en cáncer de mama triple negativo. En este estudio, han demostrado que p53 mutante interactúa con SWI / SNF y recluta al promotor de VEGFR2 donde este complejo remodela el promotor de VEGFR2 e induce la transcripción que conduce a la progresión del tumor de mama mediada por VEGFR. Estos resultados indican que la ganancia de función de la p53 mutante está mediada por la activación de la expresión de VEGFR2 (Fig. 2) [70]. Las evidencias colectivas sugieren que VEGFR2 exhibe un papel destacado en la metástasis del cáncer de mama. Sin embargo, el papel de VEGFR2 en la invasión y migración de células cancerosas depende del contexto. En el microambiente del tumor de mama, la hipoxia induce la formación del complejo de integrina c-Met / β1 que da como resultado un mayor potencial de invasión y migración de las células cancerosas. Sin embargo, VEGFR2 activado por VEGF se une directamente con c-Met y la integrina β1 para prevenir la formación de complejos, lo que conduce al secuestro de la integrina c-Met y β1 [71]. Zhao et al. han descubierto que VEGF impulsa la expresión de VEGFR2 y posteriormente activa la expresión de Myc y Sox2 mediada por señalización de JAK2 / STAT3. VEGF / VEGFR2 bucle autocrino establecido en el eje que consta de STAT3, Myc y Sox2 que implican en la mejora del fenotipo de células madre cancerosas en TNBC (Fig. 2) [10]. sin embargo, Las CSC son responsables de la metástasis de las células cancerosas, la resistencia a los medicamentos y la recaída del tumor; la perturbación del eje VEGFR2 / STAT3 / Myc / Sox2 podría ser útil para superar la quimioresistencia en el cáncer de mama triple negativo.

La linfangiogénesis, la formación de un nuevo vaso linfático, juega un papel importante en la diseminación de las células cancerosas y la metástasis a distancia. Por tanto, se ha demostrado que la linfangiogénesis es un objetivo prometedor para el tratamiento del cáncer de mama. Sin embargo, la falta de disponibilidad de marcadores específicos para estudiar los vasos linfáticos y la metástasis linfógena retrasa el desarrollo de la terapia anti-linfangiogénica para el tratamiento de diferentes tipos de cáncer [72]. VEGFR3 es un RTK expresado en células endoteliales linfáticas (LEC) y juega un papel clave en la linfangiogénesis [20]. Un estudio reciente sugirió que el eje de quimiocinas CCL21 / CCR7 expresado en las células de cáncer de mama interactúa con el VEGFR3 presente en las LEC para inducir el reclutamiento vascular linfático dependiente del tumor y, por lo tanto, la linfangiogénesis en el cáncer de mama [73]. La linfangiogénesis también es imprescindible para la metástasis en el cáncer de mama posparto. Informes recientes sugieren que COX-2 induce la expresión de VEGFR3 y la linfangiogénesis a través del eje VEGF-C / VEGFR3 para promover la metástasis ganglionar del cáncer de mama posparto [74, 75]. VEGFR3 es indispensable para la diafonía mediada por galectina-8 que implica las vías de VEGF-C, podoplanina e integrina que conducen a la linfangiogénesis en el cáncer de mama [76]. Con base en los hallazgos anteriores, la focalización en la linfangiogénesis mediante la terapia anti-VEGFR3 podría ser útil para prevenir la metástasis de células tumorales y aumentar la supervivencia de los pacientes con cáncer de mama.

PDGFR: papel prometedor en la interacción tumor-estroma en el carcinoma de mama

Los PDGFR son RTK de tipo III que se expresan en gran medida en el tumor de mama y en las células del estroma. La familia PDGFR consta de PDGFR-α y β y ambos muestran funciones similares. PDGFR-α y β son estructuralmente similares y contienen un dominio extracelular que consta de cinco pliegues similares a inmunoglobulina (Ig) y dominios intracelulares que exhiben actividad quinasa y consta de 100 residuos de aminoácidos diferentes a otros RTK. Los PDGF se unen principalmente a los dominios 2 y 3 de tipo Ig e inducen la homo o heterodimerización de los receptores. Además, estos receptores se estabilizan aún más mediante interacciones directas receptor-receptor a través del dominio 4 similar a Ig después de la dimerización [77]. La actividad aberrante de los PDGFR en diferentes tipos de cáncer, incluida la mama, impulsa la tumorigénesis. Varios estudios informaron que la expresión de PDGFR se asocia con un mal pronóstico de los pacientes con cáncer de mama y tiene potencial pronóstico y predictivo [78,79,80]. Se sabe que el PDGFR regula varias redes de señalización descendentes, incluido Stat3, para apoyar el inicio y la progresión del tumor de mama [72]. Park y col. han informado de que la activación de STAT3 inducida por AF1q mejora la proliferación de células de cáncer de mama, la angiogénesis y la metástasis a través de la cascada de señalización de PDGFR / Src [7]. Además de regular directamente las células cancerosas, los PDGFR también se expresan en el estroma desmoplásico reactivo que muestra su posible papel en la interacción tumor-estroma. Bhardwaj y col. han descubierto que el PDGFR se expresa mediante miofibroblastos positivos para α-SMA (fibroblastos asociados al cáncer, CAF) y células endoteliales en el estroma periepitelial de los tejidos del cáncer de mama (Fig. 2) [79]. Paulsson y col. han examinado el papel pronóstico de la expresión de PDGFR-β estromal utilizando microarrays de tejido (TMA) de cáncer de mama. Sus hallazgos sugirieron que el estroma PDGFR-β exhibe una importancia pronóstica más prominente en el subconjunto de tumores de mama. También encontraron que una mayor expresión de PDGFR se asocia con una reducción de ER y PR y una mayor expresión de HER2, así como una mayor tasa de proliferación y tamaño del tumor [80]. En una línea similar de evidencia, Pinto et al. han demostrado que el estroma maligno induce la proliferación de células de cáncer de mama luminal y la angiogénesis en condiciones libres de estrógenos a través de la cascada de señalización de PDGFR [81]. Estos resultados indican el papel principal de PDGFR en la progresión del cáncer de mama en ausencia de señalización ER. Esta noción está respaldada por el hecho de que el PDGFR induce la diferenciación endotelial de las células TNBC utilizando in vitro formación de tubos y en vivo modelos de xenoinjerto. Además, D'Ippolito et al. han delineado el mecanismo molecular por el cual PDGFR regula la diferenciación endotelial de células tumorales en TNBC. La expresión de miR-9 inducida por PDGFR promueve las propiedades vasculogénicas al dirigirse a STARD13 y regular a la baja miR-200 en TNBC (Fig. 2) [13]. Estos resultados indican que dirigirse a PDGF / PDGFR en el microambiente tumoral podrían ser los enfoques terapéuticos prometedores para el tratamiento de TNBC.

FGFR: expresado de forma aberrante en el cáncer de mama e implicaciones en la terapia dirigida

Los miembros de la familia FGFR (FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4) están compuestos por un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de tirosina quinasa (TK) intracelular. El dominio extracelular tiene tres dominios similares a Ig (IgI-III). La unión de FGF a FGFR conduce a la dimerización y la activación subsiguiente del dominio quinasa intracelular, lo que da como resultado la fosforilación cruzada de residuos de tirosina presentes en la cola citoplasmática del receptor [82]. Las rutas Ras / MAPK y PI3K / Akt se activan corriente abajo de estos receptores tras la estimulación del ligando. Se sabe que estas vías se activan de forma aberrante en el cáncer de mama y están implicadas en la supervivencia, proliferación, apoptosis y migración celular [83, 84]. Los FGFR albergan aberraciones genéticas tales como amplificaciones de FGFR1, FGFR2 y FGFR4 y mutaciones en los genes FGFR2 y FGFR4 en el cáncer de mama [84,85,86,87]. El carcinoma de mama lobulillar metastásico que muestra una respuesta deficiente a la quimioterapia demuestra una amplificación del gen FGFR1 con implicaciones en la terapia dirigida [86]. Formisano y col. han demostrado que el cáncer de mama ER + muestra amplificación de FGFR1. Descubrieron que FGFR se asocia con ERα en núcleos de células de cáncer de mama y regula genes dependientes de ER en presencia de privación de estrógenos. Además del cáncer de mama ER +, la amplificación del gen FGFR1 se correlacionó con un mal pronóstico en el cáncer de mama HER2- [88]. Además, la elevación de FGFR regula la remodelación del estroma tumoral y la recidiva tumoral en el cáncer de mama impulsado por FGFR1 [2]. Por lo tanto, los estudios con terapias combinacionales dirigidas a FGFR1 y otros RTK mostraron mejores resultados en el tratamiento del cáncer en comparación con el objetivo de un único RTK. Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en FGFR2 se han asociado con un mayor riesgo de cáncer de mama ER + y PR + [89]. Cerliani y col. han observado que la interacción de FGFR2 con progesterona y STAT5 en el tumor de mama resultó en un aumento de la transcripción de genes regulados por PR / STAT5 [90]. Se observó una asociación de la expresión de FGFR2 y FGFR3 con ER + progresión del cáncer de mama [91]. Aunque no se ha estudiado bien el papel del FGFR3 en la progresión del cáncer de mama, se sabe que las variantes de empalme de FGFR3 se localizan en el núcleo de las células cancerosas del epitelio de mama [92]. Koziczak y col. han demostrado que FGFR4 y ErbB2 regulan cooperativamente la expresión de ciclina D1 para promover la proliferación celular en el cáncer de mama [93]. El bucle de retroalimentación positiva Twist1 mediado por ERK1 / 2- regulado por señalización de FGFR estabiliza un fenotipo CD44 de alta resistencia a fármacos después de la inhibición de ErbB (figura 2) [94]. Con base en los hallazgos anteriores, está claro que los FGFR están vinculados mecánicamente a las funciones de otros RTK y la resistencia a los medicamentos y pueden ser un objetivo potencial para el tratamiento del cáncer de mama.

Papel de los miRNA y lncRNA en la regulación de la señalización RTK

En los últimos años, varios estudios han informado del papel de los microARN (miARN) y los ARN largos no codificantes (lncRNA) en la regulación de la expresión de componentes de diferentes vías de señalización de RTK. Tan y col. han demostrado que el nivel de ErbB2 en el cáncer de mama ER + resistente al tamoxifeno está estrechamente regulado por la interacción entre miR-26a / by el antígeno humano R (HuR) (Fig. 2) [95]. miR-34a y miR-155 también regulan la expresión de ErbB2 en el nivel postranscripcional (Fig. 2) [96, 97]. miR-24 se dirige a dos reguladores (no receptor de tirosina-proteína fosfatasa tipo 9 (PTPN9) y receptor tipo tirosina proteína fosfatasa F (PTPRF)) de la activación del EGFR, promoviendo así la metástasis del cáncer de mama [98]. El EGFR es un objetivo directo del miR-206 en el cáncer de mama y este último se induce en el cáncer de mama con deficiencia de factor nuclear (derivado de eritroide 2) similar a 2 (NRF2) [99]. En el cáncer de mama humano, el miR675 derivado de lncRNA de H19 se dirige a c-Cbl y Cbl-b, ubiquitina ligasas E3 que se sabe que degradan el EGFR y c-MET, por lo que aumenta la estabilidad de este último [100]. lncRNA CYTOR regula la progresión del cáncer de mama a través de la vía dependiente de EGFR [101]. Otro lncRNA, BCAR4, mejora la actividad de los receptores ErbB2 / 3 [102]. El papel de diferentes miARN e lnRNA en la regulación de los componentes de señalización de RTK se enumeran en la Tabla 1.

Papel de la señalización RTK en la resistencia a los fármacos

La terapia endocrina es el tratamiento que bloquea específicamente la función de la señalización del RE utilizando antagonistas (tamoxifeno, fulvestrant) o privación de estrógenos [103]. Casi el 20% de los pacientes adquiere resistencia a la terapia dirigida a RE mediante la activación de vías de señalización de escape para superar la dependencia de estrógenos [104]. La sobreexpresión o activación de RTK como EGFR, HER2 e IGF1R conduce a la regulación a la baja de ER y resistencia al tamoxifeno a través de la activación de las vías PI3K / Akt y MAPK (Fig. 3) [105, 106]. El eje EGFR / MAPK promueve la fosforilación del dominio AF-1 del RE para mejorar la activación de la señalización del RE independiente del ligando [106, 107]. La activación de la señalización EGFR / ErbB2 en células de cáncer de mama ER + resistentes al tamoxifeno induce un fenotipo de células madre altamente agresivo en estas células [108,109,110]. La inhibición de la señalización de EGFR utilizando erlotinib reduce considerablemente la raíz del cáncer e invierte la resistencia endocrina al inducir la expresión de ER [111]. Además, la amplificación de HER2 en el cáncer de mama resistente al RE se correlaciona con la población de células madre ALDH + [108]. La población de CSC expresa un nivel muy alto de ARNm y proteína de HER2 en comparación con la población sin CSC en pacientes con resistencia endocrina. Una mayor activación de EGFR / HER2 podría ser la fuerza impulsora en el enriquecimiento de la población de CSC en el cáncer de mama resistente al tamoxifeno [36, 108]. La asociación de la expresión de HER2 con la resistencia a ER se ha explicado en varios informes. Los estudios de secuenciación del exoma completo revelaron 13 mutaciones en diferentes dominios de HER2 en pacientes con cáncer de mama metastásico endócrino resistente ER + [112]. Estas mutaciones producen diferentes niveles de resistencia al tamoxifeno y al fulvestrant en las líneas celulares de cáncer de mama ER +. Además, los cofactores ER, HOXB3 y HOXB7 se sobreexpresan en células de cáncer de mama resistentes al tamoxifeno y mejoran el fenotipo de CSC. La represión transcripcional mediada por Myc de miR-375 y miR-196a mejora la expresión de HOXB3 y HOXB7 respectivamente [113, 114]. La proteína de unión al retinoblastoma 2 (RBP2), un corregulador de ER se sobreexpresa en pacientes con cáncer de mama resistente al tamoxifeno y aumenta la estabilidad de RTK como EGFR y HER2. Además, el complejo RBP2-ER-NRIP1-HDAC1 activa IGF1R a través de la represión transcripcional de IGFBP4 y 5 [115]. Otro coactivador transcripcional ER, la subunidad mediadora 1 (MED1) se sobreexpresa en las células tumorales circulantes y los tejidos del tumor de mama primario después del tratamiento con tamoxifeno que conduce a la resistencia al ER mediada por HER2. La fosforilación de MED1 mediada por HER2 recluta los correpresores transcripcionales como HDAC1, N-CoR y SMART en el promotor de los genes regulados por ER en células resistentes al tamoxifeno HER + [116, 117].

Señalización RTK en farmacorresistencia. a Los agentes quimioterapéuticos convencionales reducen la progresión del cáncer mediante la inhibición del eje de señalización MAPK / PI3K / Akt. La amplificación y sobreexpresión de RTK, incluidos EGFR, HER2 y PDGFR, refuerzan la activación del eje PI3K / Akt / YB-1 / RTK para mantener la resistencia a los medicamentos, aumenta la actividad de la quinasa y, por lo tanto, conduce a la progresión del cáncer, la salida de los medicamentos y la raíz del cáncer. B Las células cancerosas exhiben resistencia a la terapia RTK debido a la interrupción de la interacción entre el fármaco y el receptor o la activación de la señalización RTK alternativa

Además de la terapia endocrina, también se encuentran disponibles otros tipos de tratamiento como cirugía, radioterapia y fármacos citotóxicos para el cáncer de mama. Principalmente, las antraciclinas (agentes que dañan el ADN) y los taxanos (agentes estabilizadores de microtúbulos) se utilizan ampliamente para el cáncer de mama como terapias adyuvantes o neoadyuvantes [118].Sin embargo, la resistencia a los fármacos citotóxicos contra el cáncer es el principal inconveniente del tratamiento del cáncer. La resistencia a múltiples fármacos se asocia principalmente con la raíz del cáncer y la salida del fármaco impulsada por diversas señales de supervivencia [119]. Es importante destacar que los RTK son reguladores clave de la madre del cáncer y están asociados con la resistencia a los medicamentos en las células del cáncer de mama. En general, varios RTK activan la señalización de PI3K / Akt para inducir la expresión de factores de origen del cáncer, proteínas asociadas a la resistencia a múltiples fármacos y transportadores de membrana en las células cancerosas. La evidencia acumulada sugiere claramente que la regulación al alza de los RTK, incluidos EGFR, HER2, VEGFR e IGF-1R en el curso de la quimioterapia, se asocia con la sobreexpresión / activación de los transportadores de eflujo del fármaco [41, 42]. Jin y col. han demostrado la fuerte correlación positiva entre la expresión de p-glicoproteína y EGFR con la supervivencia global y libre de enfermedad [43]. Además, se detectan mayores expresiones de EGFR y HER2 en células MCF7 resistentes a doxorrubicina en comparación con las células MCF7 sensibles a doxorrubicina. La sobreexpresión de HER2 también induce resistencia a diversos agentes quimioterapéuticos como taxano, ciclofosfamida, metotrexato, epirrubicina en el cáncer de mama [120]. Además, las células tumorales circulantes (CTC) que expresan HER2 muestran menos sensibilidad a los diversos agentes quimioterapéuticos, incluidos la doxorrubicina, el docetaxel y el 5-fluorouracilo, en comparación con las CTC negativas para HER [121]. La sobreexpresión de RTK se correlaciona con la expresión de factores de transcripción relacionados con la resistencia a los fármacos en el cáncer de mama. YB-1 es un regulador transcripcional / traduccional y se sobreexpresa en células madre cancerosas. La localización nuclear de YB-1 se informa en pacientes con recaída del cáncer y resistentes a fármacos independientemente del estado de ER y HER2. PI3K / Akt regulado por RTK fosforila YB-1 en Ser-102 para facilitar la localización nuclear. Además, el YB-1 nuclear se une a la región promotora específica y activa transcripcionalmente la expresión de RTK, incluidos EGFR, HER2 y VEGFR. La alteración en el bucle de autorrefuerzo de YB-1 / RTK reduce significativamente el tallo del cáncer y la salida del fármaco en las células del cáncer de mama [122]. Además, YB-1 aumenta transcripcionalmente la expresión de p-glicoproteínas (MDR-1 y MDR-3) y provoca la multirresistencia en el cáncer de mama (Fig. 3) [123, 124]. Se sabe que los TAM influyen en el mantenimiento de un microambiente adecuado para las células madre del cáncer y en la resistencia sostenida a los fármacos en el cáncer de mama. Los TAM producen el nivel más alto de citocinas, TGFα, EGF, FGF y VEGF en el microambiente tumoral. Los niveles más altos de estos ligandos activan la señalización de RTK en el cáncer de mama, así como en los macrófagos [125]. Se encontró una fuerte correlación entre la expresión de EGFR y los macrófagos CD163 + en pacientes con cáncer de mama resistentes al tamoxifeno [126]. Además, los TAM regulan positivamente los genes asociados con la madre del cáncer junto con un aumento de la salida de fármacos y la quimiorresistencia en el modelo de cáncer de mama preclínico [127].

Terapias contra el cáncer dirigidas al receptor de tirosina quinasa (RTK)

El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea que se ha caracterizado molecularmente en cinco subtipos según la expresión de ER, PR y HER2. Estos subtipos consisten en Luminal A (grado bajo, ER + / PR +, HER2-, Ki67 bajo), Luminal B (ER + / PR +, HER2 + o HER2-, Ki67 alto), TNBC o de tipo basal (ER- / PR- y HER2 -), cáncer de mama de tipo normal y enriquecido con HER2 [128]. Para el cáncer de mama con receptor hormonal positivo (luminal A y B), la terapia hormonal consiste en moduladores selectivos del receptor de estrógeno (tamoxifeno y raloxifeno) que se utiliza de forma rutinaria como terapia adyuvante [129]. Dado que el cáncer de mama TNBC o basal y enriquecido con HER no expresa receptores hormonales, la terapia hormonal no es eficaz en estos subtipos. Sin embargo, debido a la expresión prominente de RTK en subtipos enriquecidos con TNBC y HER2, el bloqueo de las funciones de RTK es uno de los enfoques prometedores para el tratamiento del cáncer de mama enriquecido con TNBC y HER2. Hasta ahora, se han adoptado varias estrategias para la inhibición de la señalización dependiente de RTK. Las mutaciones o la sobreexpresión de los genes EGFR conducen a la progresión del tumor y la resistencia a los fármacos en varios tipos de cáncer, incluido el de mama [127]. Por lo tanto, EGFR tiene el potencial de ser un objetivo farmacológico atractivo en el cáncer de mama, y ​​los inhibidores de EGFR, incluidos los inhibidores de moléculas pequeñas y los anticuerpos monoclonales (mAb), se han desarrollado y algunos se utilizan actualmente en las clínicas. La sobreexpresión de HER2 se encuentra con frecuencia en el cáncer de mama. Se desarrollaron varios fármacos dirigidos a HER2 y actualmente se utilizan para el tratamiento del cáncer de mama.

Trastuzumab (Herceptin) es un mAb humanizado que se dirige al dominio extracelular de HER2 en el cáncer de mama HER2 + y se ha informado que mejora la supervivencia de los pacientes en las etapas iniciales y tardías del cáncer de mama [130]. Sin embargo, no se conoce bien el mecanismo exacto a través del cual trastuzumab exhibe su efecto terapéutico. De et al. han informado de que trastuzumab inhibe la heterodimerización de HER2-HER3, que se sabe que ocurre de manera independiente del ligando en el cáncer de mama HER2 +. Varios informes también sugirieron que trastuzumab podría inducir la degradación de HER2, pero el mecanismo subyacente está inexplorado [131]. Aunque el tratamiento con trastuzumab mejora significativamente el resultado de la enfermedad, la resistencia al trastuzumab es una barrera importante para tratar el cáncer de mama HER2 positivo. Aproximadamente el 65% de las pacientes con cáncer de mama HER2 positivas no responden al tratamiento primario con trastuzumab. Además, la mayoría de los pacientes que originalmente responden bien a la terapia con trastuzumab muestran una recidiva tumoral más tarde [132, 133]. En 2013, la FDA aprobó un conjugado anticuerpo-fármaco T-DM1 o trastuzumab emtansina o ado trastuzumab emtansina (nombre comercial Kadcyla) para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico HER positivo que han sido previamente tratadas con trastuzumab y un taxano. T-DM1 consiste en trastuzumab y el agente citotóxico emtansina (DM1) que destruye las células cancerosas al unirse a la tubulina [134]. Un ensayo aleatorio en 991 pacientes con cáncer de mama avanzado HER2 positivo mostró una mediana de supervivencia libre de progresión más alta en las pacientes tratadas con T-DM1 en comparación con las tratadas con lapatinib más capecitabina [135]. Sin embargo, un ensayo de fase III completado recientemente que utilizó trastuzumab más taxano, T-DM1 más placebo, T-DM1 o T-DM1 más regímenes de pertuzumab en dosis estándar en 1095 pacientes con cáncer de mama avanzado HER2 positivo. No se observó un aumento significativo en la supervivencia libre de progresión en los grupos de T-DM1 y T-DM1 más pertuzumab en comparación con trastuzumab más taxano, aunque los brazos que contenían T-DM1 mostraron una mejor tolerabilidad [136]. Pertuzumab (nombre comercial perjeta) es otro anticuerpo monoclonal contra HER2 que ha sido aprobado para terapia neoadyuvante o adyuvante del cáncer de mama avanzado HER2 positivo en combinación con trastuzumab y docetaxel. Los ensayos clínicos han demostrado que las pacientes con cáncer de mama administradas con una combinación de pertuzumab, trastuzumab y docetaxel tuvieron una supervivencia libre de progresión mejorada en comparación con el grupo de control [137, 138].

Se sabe que el cáncer de mama de tipo basal o TNBC es negativo para HER2, y se ha demostrado que expresa EGFR en el 40% de los pacientes, de los cuales se informa que el 18% de los pacientes tiene el gen EGFR amplificado. Por lo tanto, EGFR es uno de los objetivos importantes para el cáncer de mama HER2 negativo, incluidos los TNBC. El lapatinib (Tykerb), un inhibidor de tirosina quinasa dual, se une al bolsillo de unión de ATP del dominio de quinasa EGFR y HER2 y bloquea la unión de ATP, lo que conduce a la inhibición de la actividad de quinasa EGFR y HER2. Se sabe que los inhibidores de la tirosina quinasa (TKI) se utilizan como un régimen terapéutico alternativo en pacientes con cáncer de mama HER2 + con resistencia a trastuzumab [139, 140]. Además, lapatinib se ha utilizado en combinación con otros fármacos contra el cáncer, capecitabina o letrozol. Estas terapias combinadas mostraron una mayor supervivencia libre de enfermedad en pacientes con cáncer de mama metastásico HER2 + [141, 142]. Se han realizado múltiples ensayos clínicos para evaluar la eficacia y toxicidad de los inhibidores de la tirosina quinasa solos o en combinación con otros fármacos en el cáncer de mama. Desafortunadamente, los resultados de estos ensayos hasta ahora han sido decepcionados. En la Tabla 2 se incluyen pocos ensayos y sus resultados. Los ensayos clínicos de fase II de gefitinib o erlotinib han mostrado una tasa de respuesta general (TRO) deficiente, mientras que los ensayos clínicos con gefitinib en combinación con epirubicina y ciclofosfamida no mostraron diferencias significativas en la respuesta patológica completa en RE- cáncer de mama negativo [142,143,144,145,146]. Además, afatinib, un EGFR TKI irreversible de segunda generación, no ha mostrado respuestas objetivas en un ensayo de fase II en pacientes con TNBC metastásico [147].

Se han realizado seis ensayos clínicos con mAb anti-EGFR para explorar su eficacia y seguridad en pacientes con TNBC como se indica en la Tabla 2. Carey et al. han realizado un ensayo clínico en cáncer de mama recurrente avanzado metastásico para examinar la eficacia de cetuximab o cetuximab en combinación con carboplatino. Cetuximab en combinación con carboplatino demostró una mayor tasa de respuesta en comparación con carboplatino solo. Sin embargo, 13 de los 18 pacientes tratados mostraron una señalización EGFR activa que indica que cetuximab no pudo inhibir la vía EGFR [148]. Se ha informado una tasa de respuesta más alta en pacientes tratados con cisplatino-cetuximab (20%) en comparación con el grupo tratado con cisplatino (10%) en TNBC avanzado. Sin embargo, los resultados no fueron estadísticamente significativos [149]. De manera similar, Tredan realizó un ensayo de fase II de ixabepilona sola e ixabepilona más cetuximab en pacientes con TNBC avanzado / metastásico. et al. Este estudio no ha mostrado ninguna mejora en la tasa de respuesta [150]. Mientras tanto, el irinotecán y el cetuximab mostraron una mayor tasa de respuesta en los pacientes con TNBC en comparación con otros subtipos, sin embargo, los resultados no fueron estadísticamente significativos [151]. Se observó una respuesta modesta cuando los pacientes con TNBC operables fueron tratados con FEC estándar (5-fluorouracilo, epidoxorrubicina y ciclofosfamida) después de la quimioterapia preoperatoria consistente en panitumumab o cetuximab combinado con docetaxel [152, 153]. Se detectaron linfocitos de infiltración de tumores (TIL) más altos de CD8 + en el microambiente del tumor en respuesta a la terapia neoadyuvante de EGFR mAb. En general, el resultado de los ensayos clínicos de EGFR mAb en TNBC parece ser ligeramente mejor que el de EGFR TKI. En la Tabla 2 se enumeran varios ensayos que utilizan terapia anti-RTK y sus resultados [146, 154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174].

Desafíos en la focalización de los RTK en el cáncer de mama: énfasis en los elementos compensatorios

Se sabe que los fármacos terapéuticos dirigidos a RTK reducen la resistencia a múltiples fármacos y el fenotipo de CSC en las células de cáncer de mama. Sin embargo, las células cancerosas exhiben resistencia a los inhibidores de RTK en modelos clínicos y preclínicos. Por ejemplo, se sabe que las terapias dirigidas a HER2 (trastuzumab, pertuzumab, TDM1 y lapatinib) impiden la progresión del tumor primario y la recaída del cáncer, pero aún se observa resistencia a los medicamentos en aproximadamente el 80% de las pacientes con cáncer de mama metastásico con HER2 + [142]. De manera similar, muchos tipos de cáncer, incluido el de mama, a menudo adquieren resistencia a varios inhibidores de RTK, como los inhibidores de VEGFR (bevacizumab) [175], los inhibidores de EGFR (gefitinib) [176], los inhibidores de FGFR (AZD4547) [177]. Se han derivado varios mecanismos para describir la aparición de resistencia a los inhibidores de RTK. Varias mutaciones en RTK y sus objetivos posteriores y la activación de otros múltiples RTK son los principales elementos compensatorios que instigaron las vías de supervivencia y la resistencia a las terapias anti-RTK en el cáncer de mama. IGF1R, EGFR, AXL, VEGFR son otros miembros de RTK que comparten moléculas de señalización aguas abajo comunes como PI3K / Akt / mTOR y MAPK con HER2 en el cáncer de mama [178]. Además, IGF1R se sobreexpresa en el cáncer de mama HER2 + y forma un complejo heteromérico con HER2 y HER3 para activar la vía de señalización de PI3K. La formación de este complejo heteromérico con las proteínas de la familia HER se ha asociado con la resistencia a trastuzumab en pacientes con cáncer de mama metastásico HER2 + [179]. Se ha informado que la combinación de fármacos anti-HER2 con mAbs anti-IGF1R (metformina y figitumumab) produce efectos sinérgicos en las células del cáncer de mama. C-Met es el RTK, que se expresa con frecuencia en pacientes con cáncer de mama HER2 + y contribuye a la resistencia a trastuzumab. La regulación al alza de c-Met protege a las células cancerosas del trastuzumab mediante la anulación de la inducción de p27, mientras que la inhibición de c-Met sensibiliza a las células cancerosas al tratamiento con trastuzumab [180]. La fosforilación de EGFR mediada por c-Src en Tyr845, Tyr992 y Tyr1086 se asocia con resistencia a la terapia anti-EGFR en el cáncer de mama. La activación de c-Met durante el tratamiento con EGFR facilita la fosforilación asociada a c-Src quinasa y el crecimiento celular en células de cáncer de mama. Además, una combinación de inhibidores de moléculas pequeñas dirigidas a c-Met junto con un inhibidor de EGFR disminuye la fosforilación de EGFR y la actividad de la cinasa mediante la inhibición de la c-Src cinasa, por lo que reduce la resistencia a EGFR [181]. Se ha informado un aumento en el número de copias de FGF3 / 4/19 en tumores resistentes a lapatinib y trastuzamab. Una mayor expresión y fosforilación de FGFR se correlaciona con una reducción de la supervivencia libre de enfermedad y la resistencia a la terapia anti-HER2 en pacientes con cáncer de mama. La activación de FGFR estimula además la fosforilación de quinasas no receptoras como MAPK y PI3K / Akt mediante la activación de la fosfolipasa Cγ en el cáncer de mama resistente al tamoxifeno [182]. Las amplificaciones y mutaciones en genes diana descendentes dependientes de RTK (PI3KCA o Akt) evitan el papel de los RTK en su activación, de modo que producen una activación ininterrumpida de la señalización del crecimiento en las células de cáncer de mama. La mutación en PI3CA está fuertemente asociada con la sobreexpresión de ErbB2 y la metástasis en los ganglios linfáticos [183].

El bevacizumab es el primer fármaco anti-VEGFR aprobado por la FDA de los EE. UU. Para el tratamiento del cáncer de mama, pero finalmente se suspende debido a la aparición de resistencia al mismo. La terapia anti-VEGFR induce hipoxia en el microambiente tumoral y conduce a un aumento de la agresividad del cáncer de mama. Bajo estímulos hipóxicos, las células del estroma secretan niveles muy altos de citocinas que activan vías angiogénicas alternas y aumentan la autofagia y el tallo del cáncer [175]. La efrina-A1 y B2 son factores proangiogénicos, importantes para la remodelación y maduración de nuevos vasos sanguíneos. La hipoxia media la regulación positiva de efrina y la expresión de efrinas está fuertemente asociada con la resistencia a la terapia con VEGFR. Varios factores proangiogénicos como angiopoyetina 2 (ANG-2), EGF, bFGF, factor de crecimiento de queratinocitos, IGF-1, TGF-β, TNF-α e interleucinas (IL-1, IL-8, IL-12 e IL-17 ) han sido implicados en la refractariedad tumoral asociada a hipoxia a la terapia anti-VEGFR [184]. La secreción de IL-17, G-CSF, IL-6 y SDF1 en el microambiente tumoral recluta células mieloides CD11b + Gr1 + al tumor y la angiogénesis independiente de VEGFR asociada a Bv8 confiere resistencia a la terapia anti-VEGFR. El agotamiento de la infiltración de células mieloides CD11b + Gr1 + por anticuerpos neutralizantes de Bv8 sensibiliza a las células cancerosas a la terapia dirigida a VEGFR [185].

La interacción deficiente entre los agentes anti-RTK y su receptor respectivo es otra razón detrás del desarrollo de resistencia. Esto podría deberse a la mayor existencia de proteínas de enmascaramiento en las proximidades de los receptores, cambios estructurales en el receptor y falta de expresión del dominio objetivo. Mucina-4 y CD44 son las proteínas de la superficie celular sobreexpresadas en pacientes con cáncer de mama resistente a trastuzumab. La expresión de estas proteínas en las proximidades del epítopo HER2 enmascara la interacción entre trastuzumab y HER2 y aumenta el crecimiento del cáncer de mama [186, 187]. Por otro lado, la expresión de una versión truncada de HER2 anula la sensibilidad al trastuzumab en el cáncer de mama. p95 HER2 forma heterodímero con la proteína HER3 y activa la señalización aguas abajo de una manera independiente del ligando (Fig. 3) [188]. Eliyatkin et al. han demostrado que el 28% de los pacientes que desarrollan resistencia a trastuzumab tienen una mayor expresión de p95 HER2. Sin embargo, también se encuentra un bajo nivel de expresión de p95 HER2 en pacientes sensibles a trastuzumab [189]. Además, las mutaciones en HER2 podrían perturbar el reconocimiento de anticuerpos o la interacción física entre el fármaco y el receptor. La mutación T798M en HER2 mostró un aumento de la actividad autocatalítica y la expresión de ligandos de EGFR condujo a cambios de 10 veces en la CI50 de lapatinib en células de cáncer de mama humano. Además, el anticuerpo dirigido a EGFR, cetuximab o lapatinib revierte la resistencia a trastuzumab en estas células específicas de T798M [190]. Hanker y col. han demostrado que los pacientes con la mutación HER2 L869R adquieren una mutación secundaria en HER2 T798I como respuesta posterior al tratamiento con neratinib. Los estudios de modelos moleculares sugirieron que HER2 T798I ha aumentado el contenido de isoleucina en su estructura proteica y eso reduce la unión entre neratinib y HER2 [191].


Anatomía de la función y regulación de Ras desde el punto de vista biológico estructural

Estructuras terciarias de Ras

El análisis comparativo de las secuencias de aminoácidos entre Ras y proteínas G heterotriméricas, seguido de estudios de mutagénesis dirigida al sitio, en la década de 1980 identificaron dominios funcionales denominados dominios G que comprenden cinco motivos G (G1 a G5), que se conservan entre las subunidades Gα de la proteína G heterotrimérica y pequeñas GTPasas. En 1988, de Vos et al. (8) informó la primera estructura terciaria de Ras, I.mi. H-Ras • PIB, por enfoque cristalográfico. Al año siguiente, se determinó la estructura cristalina de H-Ras • guanosina 5 ′ - (β, γ-imido) trifosfato (H-Ras • GppNHp), donde un análogo de GTP no hidrolizable, GppNHp, reemplazó al GTP unido. por Pai et al. (9). La estructura general de H-Ras mostró un pliegue de Rossmann que consta de un núcleo hidrófobo de 6 láminas β trenzadas y 5 hélices α, que están conectadas por 10 bucles (Fig. 2). Cinco de estos bucles desempeñan funciones esenciales para la unión de GDP / GTP y la hidrólisis del GTP unido. La comparación estructural entre H-Ras • GDP y H-Ras • GTP reveló que el intercambio de nucleótidos de guanina induce predominantemente cambios conformacionales en las dos regiones flexibles, denominadas Switch I (residuos 32-38), incluido el motivo G2 y Switch II (residuos 60– 75) incluyendo el motivo G3 (10). En Ras • GTP, la red de enlaces de hidrógeno a través del γ-fosfato del nucleótido de guanina, Thr35 en Switch I y Gly60 y Gln61 en Switch II, estabiliza la conformación, mientras que las interacciones correspondientes faltan por completo en Ras • GDP debido a la ausencia del grupo γ-fosfato (Fig. 2).

Estructuras terciarias de H-Ras • GDP y H-Ras • GppNHp y la dinámica conformacional de Ras • GppNHp. Ras funciona como un interruptor molecular al ciclar entre las formas activas unidas a GTP e inactivas unidas a GDP en varias vías de señales intracelulares.La interconversión entre las dos formas es catalizada recíprocamente por los FMAM y las BPA. Ras • GTP exhibe equilibrio conformacional entre dos estados, el estado 1 y el estado 2. El estado 1, correspondiente a una forma inactiva, posee un bolsillo superficial, invisible en el estado 2, que puede acomodar compuestos de moléculas pequeñas. El interruptor I y el interruptor II están coloreados en amarillo y verde, respectivamente. Los nucleótidos Thr35, Gly60, Gln61 y guanina se muestran en representaciones de barras. Los códigos del banco de datos de proteínas para H-Ras • GDP, H-Ras • GppNHp estado 2 y M-RasP40D • GppNHp estado 1 son 4Q21, 5P21 y 3KKP, respectivamente. #3 representa el número de categoría del inhibidor de Ras en la Tabla I.

Estructuras terciarias de H-Ras • GDP y H-Ras • GppNHp y la dinámica conformacional de Ras • GppNHp. Ras funciona como un interruptor molecular al ciclar entre las formas activas unidas a GTP e inactivas unidas a GDP en varias vías de señales intracelulares. La interconversión entre las dos formas es catalizada recíprocamente por los FMAM y las BPA. Ras • GTP exhibe equilibrio conformacional entre dos estados, el estado 1 y el estado 2. El estado 1, correspondiente a una forma inactiva, posee un bolsillo superficial, invisible en el estado 2, que puede acomodar compuestos de moléculas pequeñas. El interruptor I y el interruptor II están coloreados en amarillo y verde, respectivamente. Los nucleótidos Thr35, Gly60, Gln61 y guanina se muestran en representaciones de barras. Los códigos del banco de datos de proteínas para H-Ras • GDP, H-Ras • GppNHp estado 2 y M-RasP40D • GppNHp estado 1 son 4Q21, 5P21 y 3KKP, respectivamente. #3 representa el número de categoría del inhibidor de Ras en la Tabla I.

Regulación de la actividad Ras por GEF y GAP

La base estructural para la regulación de la actividad Ras mediada por GEF y GAP fue descubierta por Wittinghofer, Kuryan y sus colaboradores a fines de la década de 1990 mediante la determinación de las estructuras cristalinas de H-Ras en complejo con el catalítico (ciclo de división celular 25 homólogo) dominio de Sos y p120GAP, respectivamente (11, 12). Durante el intercambio de nucleótidos mediado por Sos de Ras • GDP a Ras • GTP, la estrecha interacción de GDP con Ras es interrumpida por el dominio catalítico de Sos de las dos formas siguientes. Primero, la horquilla α-helicoidal de Sos se inserta en el interruptor I de Ras, desplazando así el interruptor I y posteriormente abriendo el sitio de unión de nucleótidos. Luego, las cadenas laterales de los residuos en la horquilla y las del Switch II, que asume una conformación desordenada resultante de los cambios estructurales ocurridos en el primer paso, alteran los ambientes químicos que rodean el sitio de unión de los grupos fosfato del nucleótido y Mg. 2+. En consecuencia, la consolidación del PIB ya no se ve favorecida y el PIB se libera de Ras. La forma libre de nucleótidos resultante se convierte preferentemente en Ras • GTP en lugar de Ras • GDP porque la concentración celular de GTP es mucho mayor que la de GDP.

La hidrólisis intrínseca de GTP de Ras depende de las ubicaciones y orientaciones de la cadena lateral de Gln61 en el conmutador II y de una molécula de agua catalítica activada por la cadena lateral de Gln61 para ejercer un ataque nucleófilo sobre el γ-fosfato de GTP. Se cree que la voluminosa cadena lateral Val12 del mutante G12V reduce la actividad GTPasa a través de una interferencia estérica sobre este proceso catalítico. La estimulación de la hidrólisis de GTP por GAP se logra de las siguientes formas. En primer lugar, la unión del bucle α7 variable de GAP al conmutador I de Ras • GTP establece la especificidad de emparejamiento entre las dos proteínas. Luego, se establece una interacción de alta afinidad de Ras con el motivo Phe-Leu-Arg (FLA) de GAP, que estabiliza las dos regiones de cambio. El bucle de dedo Arg de GAP, que está altamente conservado entre GAP para varias GTPasas pequeñas, se inserta en un sitio activo para neutralizar las cargas en desarrollo en el estado de transición, lo que facilita la hidrólisis de GTP mediada por agua catalítica de Gln61.

Reconocimiento de efectores y dinámica conformacional de Ras

Los análisis de la estructura cristalina de H-Ras • GppNHp en complejo con los efectores posteriores, como Raf, PI3K y RalGDS (13-16), demostraron que las estructuras de la columna vertebral de H-Ras • GppNHp en los complejos eran similares a las de H- Ras • GppNHp solo. Switch I y Switch II, que contienen bucles flexibles, constituyen una interfaz de enlace principal para el reconocimiento del efector. Además, la propiedad flexible de estas regiones es presumiblemente fundamental para reconocer una variedad de efectores con una diversidad de secuencia sustancial en sus dominios de unión a Ras.

Paralelamente a los estudios cristalográficos anteriores, en 1996, Geyer et al. (17) demostraron que H-Ras • GppNHp adopta dos estados conformacionales en solución, llamados estado 1 y estado 2 (Fig. 2) y que los dos estados exhiben un equilibrio al interconvertirse en una escala de tiempo de milisegundos a través de análisis de 31 P NMR de la átomos de fósforo de nucleótidos. Los dos estados se caracterizaron por señales con diferentes valores de desplazamiento químico en el espectro de 31P NMR adquiridos a baja temperatura. También se observaron las señales correspondientes para H-Ras en complejo con GTP u otros análogos de GTP no hidrolizables, como guanosina 5′-3-O- (tio) trifosfato (18, 19). Esta característica estructural dinámica se comparte entre las pequeñas GTPasas de la familia Ras, incluidas Rap, Ral y M-Ras, aunque las distribuciones estatales exhiben grandes variaciones (20). El estado 2 representa una conformación activa porque la unión del efector indujo un cambio de equilibrio hacia el estado 2 (8), lo que indica que las estructuras cristalinas previamente resueltas de Ras • GppNHp solo o en complejo con los efectores correspondían al estado 2. El estado 1 se considera inactivo conformación con una capacidad muy deteriorada para unirse a los efectores (21). En contraste con la extensa información estructural acumulada en el estado 2, la del estado 1 es muy limitada, lo que presumiblemente se explica por la dificultad de determinar una única conformación estabilizada debido a su propiedad estructural flexible. Los análisis estructurales del estado 1 se realizaron principalmente utilizando mutantes artificiales H-Ras, como T35S, T35A y G60A, y un homólogo de Ras, M-Ras, todos los cuales adoptan predominantemente el estado 1 en solución (21-23). La primera estructura cristalina de estado 1 de H-RasT35S • GppNHp resuelta en 2001 no pudo mostrar su figura completa porque faltaba por completo la información estructural de las dos regiones de conmutación (21). En 2005, informamos la estructura cristalina del estado 1 de M-Ras • GppNHp, sin embargo, faltaba información estructural sobre cinco residuos en Switch II (23). En 2010, finalmente se dio a conocer la estructura completa del estado 1 utilizando M-Ras que lleva una sustitución de aminoácidos de tipo H-Ras P40D a una alta resolución de 1,35 Å (24). El próximo año, abordamos el mecanismo para la transición de estado a través de los análisis cristalográficos y de RMN de M-RasD41E y H-RasT35S (25, 26). Como se infiere de los estudios anteriores (27), el estado 1 exhibe una conformación abierta acompañada por la pérdida de las redes de enlaces de hidrógeno a través de las dos regiones de cambio y el nucleótido de guanina que se encuentra en las estructuras del estado 2, lo que resulta en la formación de una bolsa de superficie adecuada. para aceptar compuestos de moléculas pequeñas (Fig. 2). Debido a que la ausencia de un bolsillo de este tipo en las estructuras del estado 2 había hecho que Ras fuera 'indisponible', nuestro descubrimiento del bolsillo 'drogable' arrojó una luz sobre el diseño de fármaco basado en la estructura (SBDD) de inhibidores específicos que bloquean alostéricamente la activación de Ras estabilizando la conformación del estado inactivo 1 (28, 29).

Modificaciones postraduccionales de Ras esenciales para la focalización en la membrana plasmática

Las modificaciones lipídicas postraduccionales de Ras son necesarias no solo para que se dirijan a la membrana plasmática (Fig. 1B) sino también para la activación completa de los efectores como c-Raf-1 (30). Aunque las secuencias de los 25 residuos C-terminales, denominada región hipervariable, de las tres isoformas Ras son muy divergentes, terminan con la secuencia del motivo CAAX (C: cisteína, A: aminoácidos alifáticos, X: cualquier aminoácido) ( 31). Un resto farnesilo se une covalentemente a los polipéptidos Ras citoplasmáticos recién sintetizados por la enzima farnesiltransferasa (FTasa). Esta reacción de prenilación es seguida por la escisión proteolítica de la secuencia AAX, catalizada por la enzima convertidora de Ras-1 (RCE1), y además por la carboximetilación de la Cys186 C-terminal recién formada por la isoprenilcisteína carboximetiltransferasa-1 (ICMT1). Además, una etapa de modificación adicional, en la que un resto de palmitoilo se une a los residuos de Cys inmediatamente aguas arriba del motivo CAAX por la enzima palmitoiltransferasa (PTasa), juega un papel crucial en el anclaje a la membrana de la H-Ras prenilada, N-Ras. y K-Ras4A. En el caso de K-Ras4B, la región polibásica aguas arriba del motivo CAAX sustituye a la palmitoilación por el anclaje de la membrana. Las enzimas para una serie de modificaciones postraduccionales y sus sustratos son objetivos prometedores para el desarrollo de inhibidores de Ras.

Estado actual del desarrollo de inhibidores de Ras

En esta sección, resumimos los intentos recientes de desarrollar inhibidores de Ras en la academia y la industria, que se clasifican en tres categorías según los conceptos de trabajo (Tabla I). En primer lugar, nos centramos en las estrategias que tienen como objetivo bloquear la dirección de Ras en la membrana, incluida la última dirigida a las proteínas de unión a prenilo que escoltan a Ras a la membrana plasmática. En segundo lugar, discutimos las estrategias destinadas a prevenir la formación de Ras • GTP bloqueando la interacción Ras-GEF. En tercer lugar, discutimos las estrategias que apuntan a bloquear la interacción Ras-efector, incluidas aquellas para el desarrollo de inhibidores alostéricos de Ras dirigiéndose a la dinámica conformacional de Ras • GTP como la nuestra.

Clasificación de los inhibidores de Ras según los conceptos de trabajo.

. Referencias.
.
# 1: localización de la membrana plasmática.
FTase TLN-4601 ( 49)
Galectina Salirasib ( 37, 38)
APT-1/2 Palmostatina B, Palmostatina M ( 36, 50)
PDEδ Deltarasin ( 39)
ICMT Cysmethynil ( 51)
# 2: intercambio PIB-GTP
Ras • PIB SCH53239 ( 52, 53)
HBS ( 44)
Andrografólido ( 54)
DCAI ( 42)
13 ( 55)
El bisfenol A ( 56)
K-RasG12C • PIB SML-8-73-1, SML-10-70-1 ( 43)
VSA9, AA12 ( 44)
# 3: interacciones efectores aguas abajo
Ras • GTP Complejo metal-ciclon, Complejo metal-bis (2-picolil) amina ( 57–59)
Fragmento de anticuerpo ( 60)
Sulfuro de sulindaco ( 61)
Compuestos MCP ( 48)
Compuestos de la familia Kobe ( 62)
. Referencias.
.
# 1: localización de la membrana plasmática.
FTase TLN-4601 ( 49)
Galectina Salirasib ( 37, 38)
APT-1/2 Palmostatina B, Palmostatina M ( 36, 50)
PDEδ Deltarasin ( 39)
ICMT Cysmethynil ( 51)
# 2: intercambio PIB-GTP
Ras • PIB SCH53239 ( 52, 53)
HBS ( 44)
Andrografólido ( 54)
DCAI ( 42)
13 ( 55)
El bisfenol A ( 56)
K-RasG12C • PIB SML-8-73-1, SML-10-70-1 ( 43)
VSA9, AA12 ( 44)
# 3: Interacciones de efectores descendentes
Ras • GTP Complejo metal-ciclon, Complejo metal-bis (2-picolil) amina ( 57–59)
Fragmento de anticuerpo ( 60)
Sulfuro de sulindaco ( 61)
Compuestos MCP ( 48)
Compuestos de la familia Kobe ( 62)

Clasificación de los inhibidores de Ras según los conceptos de trabajo.

. Referencias.
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# 1: localización de la membrana plasmática.
FTase TLN-4601 ( 49)
Galectina Salirasib ( 37, 38)
APT-1/2 Palmostatina B, Palmostatina M ( 36, 50)
PDEδ Deltarasin ( 39)
ICMT Cysmethynil ( 51)
# 2: intercambio PIB-GTP
Ras • PIB SCH53239 ( 52, 53)
HBS ( 44)
Andrografólido ( 54)
DCAI ( 42)
13 ( 55)
El bisfenol A ( 56)
K-RasG12C • PIB SML-8-73-1, SML-10-70-1 ( 43)
VSA9, AA12 ( 44)
# 3: Interacciones de efectores descendentes
Ras • GTP Complejo metal-ciclon, Complejo metal-bis (2-picolil) amina ( 57–59)
Fragmento de anticuerpo ( 60)
Sulfuro de sulindaco ( 61)
Compuestos MCP ( 48)
Compuestos de la familia Kobe ( 62)
. Referencias.
.
# 1: localización de la membrana plasmática.
FTase TLN-4601 ( 49)
Galectina Salirasib ( 37, 38)
APT-1/2 Palmostatina B, Palmostatina M ( 36, 50)
PDEδ Deltarasin ( 39)
ICMT Cysmethynil ( 51)
# 2: intercambio PIB-GTP
Ras • PIB SCH53239 ( 52, 53)
HBS ( 44)
Andrografólido ( 54)
DCAI ( 42)
13 ( 55)
El bisfenol A ( 56)
K-RasG12C • PIB SML-8-73-1, SML-10-70-1 ( 43)
VSA9, AA12 ( 44)
# 3: Interacciones de efectores descendentes
Ras • GTP Complejo metal-ciclon, Complejo metal-bis (2-picolil) amina ( 57–59)
Fragmento de anticuerpo ( 60)
Sulfuro de sulindaco ( 61)
Compuestos MCP ( 48)
Compuestos de la familia Kobe ( 62)

Inhibición de la focalización de Ras en la membrana

La correcta localización intracelular que depende de una serie de modificaciones postraduccionales es esencial para la señalización eficiente de Ras. Por tanto, se espera que la inhibición farmacológica de las enzimas que catalizan varios procesos de modificación exhiba un efecto antitumoral hacia las células cancerosas que portan las mutaciones oncogénicas de Ras bloqueando la señalización de Ras activada. Se han desarrollado varios inhibidores de FTasa (FTI) y algunos de ellos han llegado a la etapa avanzada de los ensayos clínicos. Sin embargo, finalmente se concluyó que la monoterapia con FTI no mostró ninguna eficacia clínica en tumores sólidos avanzados (32) presumiblemente porque una prenilación alternativa, geranilgeranilación, de K-Ras4B y N-Ras catalizada por geranilgeranil transferasa I, eludió el efecto inhibidor de FTI sustituyendo funcionalmente la farnesilación. Sin embargo, estudios recientes informaron de una eficacia prometedora de las FTI utilizadas como monoterapia o en combinación con otros agentes citotóxicos convencionales (33), mientras que los inhibidores de la geranilgeraniltransferasa no demostraron ninguna eficacia clínica (34). Básicamente, los ensayos clínicos de FTI se centrarán en el tratamiento de las neoplasias malignas dependientes de H-Ras porque solo H-Ras es totalmente dependiente de la farnesilación para su orientación a la membrana. Se informó que los inhibidores de RCE1 e ICMT mostraron un efecto no tan profundo en comparación con los FTI, lo que presumiblemente se explica por sus actividades no específicas hacia otras pequeñas GTPasas (35). Se demostró que los inhibidores dirigidos a la palmitoilación de H-Ras y N-Ras causan una reversión fenotípica parcial en una línea celular de fibroblastos transformada con H-RasG12V; sin embargo, su efecto antitumoral en xenoinjertos de líneas celulares de cáncer humano aún no se ha demostrado (36 ). En conjunto, los inhibidores que se dirigen a las enzimas para la farnesilación y la palmitoilación después de todo fracasaron en prevenir eficazmente la orientación a la membrana de K-Ras4B, que se activa mutacionalmente con mayor frecuencia en los cánceres humanos. Recientemente, el bloqueo de las interacciones entre Ras y las proteínas de unión a prenilo, que escoltan a Ras a las membranas plasmáticas, ha atraído la atención para el desarrollo de inhibidores de K-Ras4B. Se informó que salirasib, un mimético de farnesilcisteína que interfiere con la unión de K-Ras4B farnesilado a la proteína Ras-escort Galectina, mostró eficacia en la etapa inicial de los ensayos clínicos (37, 38). Muy recientemente, se informó que la deltarasina, descubierta mediante el uso de la tecnología de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima alfa en combinación con SBDD, inhibe la interacción de K-Ras4B con la proteína escolta fosfodiesterasa 6 delta (PDEδ) que lleva una cavidad superficial que aloja el resto farnesilo de las proteínas de la familia Ras (39). Aunque la deltarasina mostró una actividad para inhibir la señalización dependiente de Ras tanto in vitro y en vivo, Se necesitaría una mayor optimización estructural considerando su actividad inhibidora no específica hacia otras GTPasas pequeñas, como Rheb (40) (Tabla I, # 1).

Inhibición de la formación de Ras • GTP al bloquear la interacción Ras • GDP-GEF

No está claro si apuntar a la interacción Ras • GDP-GEF es una estrategia efectiva para la inhibición de los mutantes Ras activados constitutivamente porque es probable que escapen de la regulación de los GEF considerando la gran reducción de su actividad GTPasa y un gran exceso de la concentración de GTP libre sobre la de GDP en células. Sin embargo, podría ser eficaz para algunos tipos de cáncer, teniendo en cuenta que se informa que la función de Ras de tipo salvaje es necesaria para el crecimiento de tumores que portan el oncogénico. ras mutaciones (41). Se aplicó el cribado de ligandos basado en fragmentos mediante RMN dirigido a K-RasG12D unido a GDP o GppNHp para identificar armazones de ligandos, lo que dio como resultado el aislamiento de 25 compuestos afectados. El análisis de la estructura cristalina del complejo entre K-RasG12D • GDP y los compuestos reveló una bolsa de superficie capaz de acomodar los compuestos de moléculas pequeñas (42). Entre ellos, dos compuestos, llamados DCAI y DCIE, inhibieron el intercambio de nucleótidos mediado por Sos en K-Ras • GDP in vitro. Sin embargo, no hubo evidencia de su efecto inhibidor sobre Ras a nivel celular. Dos grupos, el de Gray y el de Shockat, aplicaron una estrategia alternativa, la fijación oncogénica específica de mutantes de la forma unida al PIB (43, 44). Seleccionaron K-RasG12C, un mutante oncogénico que a menudo se observa en los adenocarcinomas de pulmón, como diana porque el grupo tiol de Cys12 era muy útil para la captura covalente de inhibidores mediante la formación de enlaces disulfuro. Gray y sus colaboradores seleccionaron análogos derivados de GDP e identificaron SML-10-70-1, que era capaz de imitar funcionalmente a GDP cuando se unía a Ras y mostraba actividad antiproliferativa hacia las células portadoras de K-RasG12C (43). Sin embargo, una eficacia similar de este compuesto hacia las células portadoras de K-RasG12S sugiere la naturaleza no específica de su actividad celular. Shockat y sus colaboradores realizaron un cribado basado en fragmentos de compuestos de moléculas pequeñas que son capaces de formar enlaces disulfuro con Cys12 sin depender de análogos de nucleótidos. La determinación de la estructura de los cocristales de los compuestos de impacto resultantes con K-RasG12C • GDP condujo a la identificación de un nuevo sitio de unión al fármaco. La optimización posterior basada en la estructura de sus derivados dio como resultado la identificación de la acrilamida AA12 más potente (44). Este compuesto modificó K-RasG12C pero no de tipo salvaje in vitro y apoptosis inducida de células de cáncer de pulmón que llevan K-RasG12C. Sin embargo, la disociación sustancial del CI50 Los valores entre ensayos bioquímicos y basados ​​en células sugieren su modo de acción no selectivo en las células. Los péptidos sustitutos del enlace de hidrógeno sintético (HBS) fueron diseñados por Bar-Sagi y colaboradores como inhibidores ortostéricos que imitan el dominio α-helicoidal de Sos. Entre ellos, HBS3 interrumpió la interacción Sos-Ras y reguló negativamente la señalización Ras-Raf-MEK-ERK en respuesta a la estimulación de EGF a pesar de su afinidad de unión 10 veces más débil para Ras • GDP en comparación con Sos parental (45) (Tabla I , # 2).

Inhibición de las interacciones Ras-efector

El bloqueo de las interacciones de Ras • GTP con los efectores posteriores es la estrategia más prometedora para la inhibición de la acción dominante de los mutantes Ras activados constitutivamente en las células cancerosas. Se informó que el sulindac, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, inhibe fuertemente la transformación maligna inducida por H-Ras de las células MDCK-F3 y la activación de Raf dependiente de Ras (46, 47). Aunque un estudio de RMN reveló su sitio de unión directa en la vecindad de Switch I en H-Ras (47), la falta de evidencia experimental de la eficacia en líneas celulares de cáncer humano y del efecto antitumoral sugiere que una mejora adicional de su potencia , la selectividad y la similitud con las drogas sería una tarea difícil.Los compuestos de MCP fueron identificados usando el sistema de dos híbridos de levadura por Khazak, Tamanoi y colaboradores. Descubrieron varios compuestos de impacto que inhiben la unión de Ras-Raf y el intercambio de nucleótidos mediado por GEF en Ras (48). El compuesto más potente MCP110 inhibió la señalización de Ras / Raf / MEK / ERK en ensayos basados ​​en células y mostró en vivo eficacia. Por todo eso, es algo desconcertante que el objetivo de la acción de este compuesto, ya sea Ras o Raf, no haya sido asignado de manera inequívoca (Tabla I, # 3).

La inhibición alostérica de Ras • GTP, en particular la dirigida a su dinámica conformacional, es otra estrategia prometedora para la inhibición de las interacciones Ras-efector. Como ya se mencionó, Ras • GTP existe en equilibrio dinámico entre al menos dos estados conformacionales distintos, estado 1 y estado 2, que corresponden a conformaciones inactiva y activa, respectivamente, independientemente de la presencia o ausencia de las mutaciones oncogénicas (17). Kalbitzer y colaboradores descubrieron derivados del ciclo metálico, que eran capaces de cambiar el equilibrio conformacional de H-Ras • GTP hacia el estado 1 (57-59). Los estudios de RMN y cristalográficos revelaron dos sitios de unión para ellos, que se encuentran en la parte superior del α-fosfato y el Loop7. Sin embargo, la falta de pruebas de la eficacia celular, la baja afinidad de unión por Ras • GTP en un orden milimolar y el efecto inhibidor débil sobre la unión de Ras-Raf pueden desalentar su optimización adicional. Como ya se mencionó, la estructura del estado 1 de Ras • GTP posee un bolsillo de superficie rodeado por Switch I, Switch II y GTP (Fig. 2). Basándonos en la hipótesis de que los compuestos que caben en este bolsillo y mantienen Ras en el estado 1 pueden bloquear las funciones de Ras, llevamos a cabo en silico cribado para descubrir dichos compuestos. Con base en la información sobre la estructura cristalina del estado 1 de M-RasP40D • GppNHp (24), se llevó a cabo una simulación de acoplamiento por computadora utilizando el método de área superficial de Poisson-Boltzman de Mecánica Molecular para seleccionar compuestos candidatos de una biblioteca virtual que contiene más de 40.000 compuestos. Se examinaron los 97 compuestos seleccionados in vitro por su efecto inhibidor sobre la unión de Ras-Raf, que resultó en el descubrimiento de un compuesto exitoso, Kobe0065 (62). Búsqueda de similitud posterior basada en la estructura central de Kobe0065, seguida de la in vitro ensayo, produjo dos derivados de Kobe0065, Kobe2601 y Kobe2602 (62). Los compuestos de la familia Kobe0065 inhibieron la asociación Ras-Raf en las células y redujeron los niveles de fosforilación de las moléculas aguas abajo, como MEK y ERK. Además del efecto inhibidor sobre la vía Ras-Raf-MEK-ERK, inhibieron las vías Ras-PI3K-Akt y Ras-RalGDS-RalA y, además, la actividad de intercambio de nucleótidos dependiente de Ras • GTP de Sos (62). Además, los compuestos inhibieron la proliferación de varias líneas de células cancerosas, como los carcinomas colorrectales y pancreáticos, que portaban el oncogénico ras mutaciones y mostró inhibición del crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto (62). La estructura de RMN de un complejo de Kobe2601 con H-RasT35 • GppNHp, que adopta predominantemente el estado 1, reveló un bolsillo de unión al compuesto en la vecindad del sitio de unión a DCAI de K-RasG12D • GDP (62).


Mecanismos emergentes para activar RTK de forma aberrante

MicroARN

Los microARN pueden modular directamente la expresión de RTK y funcionar como supresores de tumores y oncogenes [158]. Por ejemplo, el microARN-10a promueve la metástasis regulando directamente la transición epitelio-mesenquimatosa mediada por EPH4A y la adhesión en el carcinoma hepatocelular [159]. MicroRNA-145 suprime el desarrollo de adenocarcinoma de pulmón mediante modulación directa EGFR Expresiones tanto a nivel de ARNm como de proteína [160]. MicroRNA-219-5p suprime el desarrollo de GBM mediante la represión EGFR expresión uniéndose directamente a su 3'-UTR [161]. Además, también se ha demostrado que los microARN participan en la señalización de RTK y en la regulación de la formación de tumores. Datos recientes han demostrado que los RTK, como MET, EGFR y PDGFR, regulan el microRNA-134 en GBM, mientras que el microRNA-134 actúa como un centro supresor de tumores y controla los niveles de expresión de KRAS y STAT5B [162]. Los conocimientos sobre los microARN oncogénicos y la señalización RTK permitirán explotar y mejorar las terapias contra el cáncer. Por ejemplo, la combinación de un anticuerpo monoclonal contra EGFR y un inhibidor de microARN-21 mejora el resultado del tratamiento en GBM [163]. Además, los microARN podrían funcionar como posibles marcadores de pronóstico y ayudar en la estratificación del paciente. La firma de microARN (MiR-99a / Let-7c / miR-125b) puede servir como biomarcador para el pronóstico de pacientes con cáncer colorrectal tratados con anticuerpos anti-EGFR [164]. Una mejor comprensión de los microARN involucrados en la señalización de RTK puede tener implicaciones futuras en la detección, la terapia y el pronóstico del cáncer.

Alteraciones en el microambiente tumoral

Se han realizado varios avances notables durante la última década en el reconocimiento de la importancia del microambiente tumoral, especialmente la vasculatura tumoral y el estroma tumoral [165]. Los miembros de la familia de receptores Eph median la interacción célula-célula en el estroma tumoral y la vasculatura tumoral [166]. Los macrófagos funcionan como componentes celulares clave del microambiente tumoral. AXL se expresa en gran medida en los macrófagos asociados a tumores, donde AXL puede promover fenotipos inmunosupresores y preneoplasicos [167]. Se ha demostrado que RET y GFRA1 se expresan en células estromales del microambiente de la médula ósea y están implicados en el desarrollo de leucemias mieloides agudas [168]. Se ha demostrado que muchos otros RTK son importantes en el microambiente tumoral, incluidos VEGFR [169, 170] y PDGFR [171]. Como tales, estos RTK representan objetivos potenciales atractivos para el diseño de fármacos. Se han detectado muchos inhibidores de AXL y son eficaces en estudios preclínicos contra el cáncer [167].

Atenuación de la señal por reguladores negativos

La actividad de las RTK debe estar estrictamente regulada y adecuadamente equilibrada para mediar en sus actividades celulares normales y procesos fisiológicos. La atenuación de la señal y la regulación a la baja de las vías RTK proporcionan importantes implicaciones en la terapéutica del cáncer y varios reguladores negativos bien caracterizados en la señalización RTK (como PTEN, LRIG1 y ERRFI1) son supresores de tumores auténticos [172,173,174].

ERRFI1 (Inhibidor de retroalimentación del receptor ErbB 1) que codifica la proteína MIG6 - se encuentra dentro del cromosoma 1p36.1-3, una región de hotspot frecuentemente eliminada en una amplia gama de cánceres humanos, incluidos los cánceres de mama, hígado y riñón [175]. Se ha descrito que MIG6 está mutado en diferentes cánceres humanos [176, 177]. La expresión de MIG6 también está regulada a la baja o silenciada en los carcinomas de piel, mama, páncreas y ovario [178, 179]. Pérdida de Errfi1 en ratones conduce a una activación anormal de la señalización de EGFR y se asocia con una alta incidencia de lesiones neoplásicas [178]. Estos hallazgos sugirieron que MIG6 desempeñaba papeles supresores de tumores posiblemente implicados en la señalización de EGFR. MIG6 contiene dos regiones funcionales, denominadas segmentos 1 y 2, que son 77 aminoácidos en total [174]. Los estudios estructurales indican que MIG6 (segmento 1) es capaz de inhibir la actividad quinasa EGFR en presencia del dímero asimétrico. MIG6 (segmento 1) se une a la quinasa 'activadora' y previene la activación de EGFR, mientras que el segmento 2 es necesario para la inhibición de la actividad quinasa de EGFR activado, y ambos segmentos 1 y 2 son esenciales para la potente inhibición de la actividad de EGFR [174]. Los residuos en la interfaz de unión entre EGFR y MIG6 (segmento 1) se conservan en todos los miembros de la familia ErbB en lugar de otras proteínas quinasas [9]. Sin embargo, en otro estudio estructural, MIG6 no pudo inhibir eficazmente los mutantes oncogénicos de EGFR (por ejemplo, L858R) , presumiblemente porque los mutantes de EGFR pueden formar dímeros asimétricos a un coste energético menor que el EGFR de tipo salvaje [36]. El lóbulo C es menos accesible por MIG6 en configuraciones que favorecen más fuertemente la formación de dímeros asimétricos [32]. Estos dos estudios nos dan pistas de que MIG6 puede inhibir potencialmente EGFR-KDD, EGFR-RAD51 y EGFR-PURB, porque estas proteínas mutantes de EGFR tienen TKD de tipo salvaje intacta que podría actuar como quinasa 'activadora' en forma de activación de dimerización asimétrica .


Métodos

Animales y análisis de genotipos

La generación de los diferentes alelos de señalización del reunió gen utilizado en este estudio (reunió D , reunió 2P y reunió 2S ) se ha descrito anteriormente [9], [15]. Los alelos neo + originales, que contenían un casete de selección neo flanqueado por sitios LoxP, se denominaron met 2Pneo y met 2Sneo. Alelos sin neo se obtuvieron después de la escisión de la neo casete cruzando ratones mutantes con los transgénicos Deleter-Cre [9]. El análisis del genotipo por PCR se realizó como se describe [9], [12]. los reunió LacZ alelo es un alelo knock-in / knock-in alternativo de reunió en el que la LacZ El gen informador también refleja la expresión de la endógena. reunió gen [4]. En el alelo original, LacZ la expresión está condicionada por la eliminación de un casete Lox-stop-Lox [4]. En el alelo utilizado aquí, al cruzar con una línea deleter-cre, hemos derivado una línea de ratón en la que el casete de parada se ha eliminado de forma permanente. El análisis del genotipo se realizó mediante PCR como se describe [4]. Pea3-lacZ Se utilizaron ratones con el permiso de Arber y Jessell, y se genotipificaron como se describió anteriormente [32]. Los animales se mantuvieron y sacrificaron de acuerdo con las pautas institucionales. Los ratones adultos fueron sacrificados mediante dislocación cervical.

En el lugarhibridación

Los embriones se recogieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4%. Las ISH se realizaron con la sonda de ARN correspondiente en embriones completos, miembros disecados o médula espinal, de acuerdo con procedimientos publicados anteriormente [16]. La ISH de la médula espinal completa se realizó como se describe [74], con sondas de ARN marcadas con digoxigenina para reunió, MyoD (obtenido de Ponzetto), Guisante3, (de Jessell), Retirado (de Rosenthal) y Chat (colina acetil transferasa de Henderson). Las médulas espinales se montaron en forma plana como preparaciones de libro abierto con MN en la parte superior y se obtuvieron imágenes usando un estereomicroscopio Zeiss Axiophot (Marly le Roi, Francia) o Leica (Wetzlar, Alemania). Los embriones completos se aclararon parcialmente en glicerol al 50% y se obtuvieron imágenes usando un estereomicroscopio.

Tinción de X-Gal y Salmon-Gal para la actividad β-galactosidasa

La tinción para la actividad de la β-galactosidasa se realizó usando dos métodos alternativos. Para la médula espinal de embriones que llevan el guisante3 LacZ alelo, empleamos el protocolo tradicional utilizando sustrato X-Gal en combinación con iones férricos y ferrosos. Brevemente, se diseccionaron las médulas espinales de los embriones recién recolectados, se fijaron en PFA al 4% en PBS (40 min), se enjuagaron en PBS y se incubaron en X-Gal en combinación con ferricianuro de potasio y ferrocianuro (FeCN). Para detectar β-galactosidasa en la médula espinal de embriones portadores de la reunió LacZ alelo, utilizamos un método alternativo basado en Salmon-Gal (6-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido de Appolo Scientific, Maschester, Reino Unido) en combinación con sal de tetrazolio [75]. Brevemente, se diseccionaron las médulas espinales de los embriones recién recolectados, se fijaron en PFA al 1% y glutaraldehído al 0.2% en PBS (10 min), se enjuagaron tres veces en PBS y luego se incubaron durante un mínimo de 7 h durante la noche a 37 ° C en pre-tinción solución sin sustrato (ferricianuro de potasio 200 mM, ferrocianuro de potasio 200 mM, MgCl2 4 mM y NP40 al 0,04% en PBS) para reducir la actividad de β-galactosidasa endógena. A continuación, las muestras se enjuagaron tres veces en PBS y se incubaron en una solución de tinción (1 × PBS, con NP40 al 0,04%, MgCl 2 mM2, 1 mg / ml Salmon-Gal (solución madre 40 mg / ml en dimetilsulfóxido (DMSO)) y 0,33 mg / ml NBT (solución madre 75 mg / ml en DMF al 70%)), durante aproximadamente 30 a 40 min a 37ºC. ° C. En todos los casos (X-Gal y Salmon-Gal), la tinción se terminó enjuagando con PBS y después de la fijación en PFA al 4%. Las médulas espinales se montaron de forma plana en 1 volumen de glicerol / 1 volumen de PFA al 4% para la obtención de imágenes.

Cultivos de neuronas motoras embrionarias

Se recolectaron embriones de ratón E12.5 en medio Hibernate (E) (Life Technology) con suplemento B-27 (Life Technology) y se mantuvieron en hielo hasta la disección, mientras que el genotipo se determinó por PCR. Se diseccionaron las médulas espinales ventrales de un número igual de embriones mutantes y WT. Los MN se aislaron de los segmentos braquial + lumbar o cervical + torácico + sacro, mediante un método descrito anteriormente [34] que implica una combinación de centrifugación en cojines BSA y una centrifugación en gradiente de densidad de metrizamida. Al final del procedimiento, la suspensión celular estaba altamente enriquecida en MN. Para los ensayos de supervivencia, los MN se sembraron en placas de cultivo de tejidos de cuatro pocillos recubiertos con poliornitina / laminina (1.500 neuronas por pocillo) en medio Neurobasal (Life Technology, Saint Aubain 91190, Francia). Se añadieron inhibidores y factores neurotróficos recombinantes 2 h después de la siembra. Los MN se mantuvieron durante 3 días en medio neurobasal o en presencia de GDNF o HGF (ambos obtenidos de R & ampD, Minneapolis, MN, EE. UU.). Todos los inhibidores (LY294002, PD98059, PP2 y PP3) se obtuvieron de Calbiochem (Darmstadt, Alemania). Se usó PP3 como control negativo para PP2 (no se muestra). La supervivencia de MN se cuantificó contando grandes neuronas unipolares brillantes con procesos axonales largos en toda el área de cada pocillo.

Inmunohistoquímica anti-neurofilamento de montaje completo

Los embriones se recogieron en PBS frío, se fijaron durante 2 h en PFA al 4% en PBS y se fijaron posteriormente durante la noche en fijador de Dent (metanol al 80%, DMSO al 20%) a 4ºC. La inmunohistoquímica anti-neurofilamento de montaje completo se realizó como se describió anteriormente [29]. Brevemente, los embriones se blanquearon durante 4 h en 6% de H2O2 en solución de Dent y luego rehidratado a través de una serie progresiva de metanol. Las incubaciones de anticuerpos se realizaron en suero de ternero recién nacido al 80%, DMSO al 20%, tritón al 0,5% con timerosal. Los anticuerpos utilizados fueron los siguientes: anticuerpo anti-neurofilamento (2H3 y DSHB) y anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con HRP (Sigma). La tinción se desarrolló utilizando tabletas DAB (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, Francia). Los embriones se aclararon para la formación de imágenes en BABB (1: 2, alcohol bencílico / benzoato de bencilo).

Procesamiento y análisis de imágenes

La cuantificación de la intensidad de la señal se realizó utilizando el software ImageJ. Brevemente, las imágenes de ISH se convirtieron primero a una escala de grises y se invirtieron a una escala negativa (siendo la mayor coincidencia de intensidad de señal el blanco y el menor el negro). La intensidad de la señal se midió a lo largo de una línea horizontal de una longitud de píxel determinada (coincidiendo con la mitad de una médula espinal montada en plano, siempre colocada donde se indica con líneas de puntos en la Figura 3). Después de la sustracción de fondo y umbral, los valores se promediaron entre varias muestras de cada genotipo (considerando los lados izquierdo y derecho por separado, para el número de lados de la médula espinal utilizados, para cada gráfico indicado en las figuras correspondientes) para generar un gráfico de distribución de señal promedio. La intensidad total de la señal también se calculó para cada muestra y se trazó individualmente (Figuras 2 y 5, Archivo adicional 1: Figura S1 y Archivo adicional 4: Figura S4).

Análisis estadístico

Los resultados se expresaron como media ± error estándar de la media. Las diferencias estadísticamente significativas fueron evaluadas por estudiantes no apareados. t-prueba cuando los datos mostraban una distribución normal y por la prueba de Mann-Whitney en caso contrario. * indica PAG & lt 0.05 y ** indica PAG & lt 0,001.


Ver el vídeo: EGF Signal Transduction Pathway (Febrero 2023).