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¿Tamaño mínimo para que un péptido / proteína sea inmunogénico en humanos?

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¿Cuál es el tamaño mínimo de un péptido / proteína (inyectado) para causar una respuesta inmunogénica en humanos? Una referencia también es muy útil.

Gracias por adelantado


Hay algunos factores limitantes, incluida la forma en que se presentan las proteínas, que restringen el tamaño real necesario para obtener la presentación de los péptidos. Estos dependen en gran medida de las moléculas MHC (HLA en humanos). El surco de unión en MHC-I en realidad limita el tamaño de los péptidos que puede cargar a 8-10 aminoácidos, siendo 9 el más común. Esto se debe a que se dice que los "bolsillos" en cada extremo del surco de unión agarran el péptido y no permiten secuencias mucho más largas. MHC-II carece de estos bolsillos de agarre, por lo que puede unir secuencias mucho más largas (Figura 1). El MHC-II típicamente se une a secuencias de 13-25 aminoácidos.

Figura 1. Diferencia entre la ranura de unión MHC-I y II.

También hay un número determinado de residuos de anclaje necesarios que complementan el bolsillo de unión del surco de unión del MHC que en su mayoría muestran un carácter particular en la posición dada (normalmente polar en una posición determinada, etc.) (Figura 2).

Figura 2. Solo una muestra de posibilidades entre las isoformas de HLA.

Toda la información y cifras son cortesía de Parham "The Immune System", 4th ED.

Si el péptido presentado ha cumplido los requisitos previos y ha sido identificado por un leucocito, en teoría debería producir una respuesta inmune. Creo que estas son algunas buenas consideraciones que se deben tener en cuenta cuando se piensa en lo pequeño que puede ser un péptido. Supongo aquí que el MHC-II manejaría la proteína inyectada a través de una vía extracelular (no puedo estar seguro), por lo que el rango de péptidos MHC-II más pequeño que he visto en la literatura es de 11 aminoácidos en el lado bajo. Existe una serie de estudios computacionales que intentan predecir la afinidad del MHC, pero es problemático debido al rango de tamaños que el MHC-II puede unirse y existe variabilidad entre los núcleos de unión que contienen los aminoácidos de anclaje.


Inmunógeno

Un inmunógeno es un antígeno o cualquier sustancia que pueda estar unida específicamente por componentes del sistema inmunológico (anticuerpos, linfocitos). El término antígeno surge de su capacidad para inducir la generación de anticuerpos. A pesar de que todos los antígenos son reconocidos por linfocitos específicos o por anticuerpos, no todos los antígenos pueden provocar una respuesta inmune. Los antígenos que son capaces de inducir una respuesta inmune se denominan inmunogénicos y se denominan inmunógenos. [1]

Un inmunógeno es cualquier antígeno que sea capaz de inducir una respuesta inmune humoral y / o mediada por células en lugar de una tolerancia inmunológica. Esta capacidad se llama inmunogenicidad. A veces, el término inmunógeno se usa indistintamente con el término antígeno. Pero solo un inmunógeno puede provocar una respuesta inmunitaria. [2]

Generalmente, ambas son sustancias capaces de generar anticuerpos (antígeno) o estimular respuestas inmunes (inmunógeno).

Podemos definir un inmunógeno como un antígeno completo que está compuesto por el portador macromolecular y los epítopos (determinantes) que pueden inducir una respuesta inmune. [3]

Un ejemplo explícito es un hapteno. Los haptenos son compuestos de bajo peso molecular que pueden estar unidos por anticuerpos, pero no pueden provocar una respuesta inmunitaria. En consecuencia, los propios haptenos no son inmunogénicos y no pueden provocar una respuesta inmunitaria hasta que se unan a una molécula inmunogénica portadora más grande. El complejo hapteno-portador, a diferencia del hapteno libre, puede actuar como inmunógeno y puede inducir una respuesta inmunitaria. [4]


Fondo

Junto con el saneamiento, las vacunas son las herramientas de salud pública más efectivas y económicas para el control de enfermedades infecciosas [1]. Sin embargo, el desarrollo de vacunas enfrenta una serie de desafíos, como superar la efectividad limitada de varias vacunas, la necesidad de reformulaciones frecuentes de las vacunas, así como la falta total de vacunas para algunas enfermedades. Un objetivo central de la vacunación es generar una inmunidad protectora amplia y duradera contra los patógenos diana, pero esta meta se ve obstaculizada por la variabilidad tanto de los patógenos diana como del sistema inmunológico humano [2]. Las soluciones prácticas actuales al problema incluyen vacunas polivalentes como las que se están desarrollando para el virus del dengue [3] o la reformulación de vacunas estacionales contra la influenza [4].

La mayoría de las vacunas tradicionales brindan protección a través de anticuerpos neutralizantes y las células T por sí solas rara vez ofrecen protección y prevención de enfermedades. Sin embargo, participan en la reducción, el control y la eliminación de patógenos intracelulares y se han relacionado con la inmunidad protectora contra varios patógenos virales [5-8]. El mayor éxito de la bioinformática inmunológica es el desarrollo de algoritmos para la predicción de la afinidad de unión del péptido al antígeno leucocitario humano (HLA), uno de los pasos que limitan la velocidad de la respuesta inmune basada en células T [9]. Aunque las formas actuales de estos algoritmos son muy precisas [10-12], el resultado por sí solo no es suficiente para informar la selección de epítopos para aplicaciones terapéuticas. En el marco conceptual de la vacunación inversa, Rino Rappouli describió en silico predicciones de epítopos inmunes a partir de datos de secuencias biológicas como un "enfoque na & # x000efve" en comparación con péptidos inmunogénicos de elucidación experimental. Muchos parámetros de una buena diana de vacuna que confiere inmunidad duradera y eficaz, aún quedan por considerar después de la predicción de la unión de HLA: múltiples pasos limitantes de la velocidad de preprocesamiento de péptidos, confirmando en vivo expresión, teniendo en cuenta la dinámica de expresión en diferentes etapas de desarrollo y entornos celulares, la presencia de epítopo en la población de patógenos, la respuesta en la población de acogida, la estabilidad del epítopo en el tiempo y otros [13]. Aquí, abordamos el tema de la variabilidad modificando el paso de selección de antígeno con un método computacional para seleccionar múltiples dianas de células T de regiones proteicas funcionalmente homólogas.

Tradicionalmente, las dianas de las vacunas se seleccionan de regiones conservadas en el genoma del patógeno en cuestión, con el objetivo de conferir una inmunidad amplia y duradera. El primer paso es un análisis de variabilidad realizado mediante el cálculo de la frecuencia de nucleótidos o aminoácidos en cada posición en un alineamiento de secuencia múltiple (MSA) de genes o proteínas homólogos [14]. Las regiones, en las que varios residuos consecutivos muestran una alta conservación (típicamente se elige & # x0003e90% de conservación como umbral), se analizan posteriormente en busca de potencial inmunogénico mediante predicciones computacionales, pruebas experimentales o una combinación de las mismas. Esta exclusión sistemática de variantes de baja frecuencia cuando se utilizan enfoques tradicionales [15-19] representa un factor limitante importante, ya que el potencial inmunogénico no siempre se correlaciona con la frecuencia en la población viral; tanto los péptidos raros como los comunes pueden ser inmunogénicos y valiosos en las construcciones de vacunas. con el objetivo de una amplia cobertura [20].

Dado que la evolución del sistema inmunológico humano ocurre en una escala de tiempo significativamente más larga que la de los patógenos de rápida mutación [21], la presión selectiva alta hace que alteren la expresión de algunos antígenos inmunogénicos más rápido de lo que el sistema inmunológico puede evolucionar para mantenerse al día con los cambios [22]. La afinidad de unión de HLA de un péptido en relación con su frecuencia en una población de células virales o malignas se conoce como su eficacia de direccionamiento (TE). Se ha demostrado que el TE de los péptidos varía en diferentes organismos, y en algunos virus muy variables tiende a ser bajo [20]. Las regiones de TE alto comprenden péptidos que están muy conservados, probablemente debido a la importancia funcional de la proteína que limita la capacidad de un patógeno para alterar la proteína mientras mantiene su aptitud [23]. Las regiones de TE baja comprenden uno o más péptidos, potencialmente todos de alta afinidad de unión a HLA, pero cada uno de ellos tendrá una frecuencia baja en la población de patógenos. Para los virus de rápida mutación, como los virus de ARN [24], la presión selectiva ejercida sobre los péptidos que se unen a HLA significa que la inmunidad del huésped a menudo, y en algunos casos preferentemente, se dirige a epítopos de baja frecuencia [20].

Selección de dianas de vacuna de regiones proteicas con unión de HLA conservada

Proponemos un método novedoso y un esquema de visualización para evaluar la estabilidad de las regiones proteicas para el descubrimiento de la diana de las células T, que tiene en cuenta la relación evolutiva entre el HLA y los epítopos de patógenos. Este método se basa en analizar columnas de ventanas deslizantes de tamaño adecuado (de aquí en adelante denominadas "bloques") de las filas de secuencias en un MSA (Figura & # x200B (Figura1). 1). Se puede realizar una MSA de secuencias de proteínas homólogas utilizando varios algoritmos [25] y bloques de péptidos de un tamaño determinado (generalmente de 8-11 aminoácidos de longitud para los epítopos restringidos de HLA de clase I y de 13-25 aminoácidos de longitud para los de clase HLA II epítopos de células T restringidos) se extraen de cada posición en la alineación. El número de péptidos en cada bloque indica la diversidad del bloque, para el cual la entropía de Shannon y la frecuencia de consenso se pueden calcular como métricas informativas [26].

Extracción de bloques de MSA. Subdivisión de un MSA en bloques de péptidos, l aminoácidos de longitud. En este ejemplo, l = 9. El bloque 1 está resaltado en azul. Mover la ventana deslizante hacia la derecha en el MSA en incrementos de una posición dará todos los bloques de bloques en el MSA.

Para identificar posibles dianas de células T, se predicen afinidades de unión a HLA para todos los péptidos en todos los bloques. Debido a que los bloques se extraen de regiones alineadas de proteínas homólogas, es probable que los péptidos dentro de un bloque dado muestren una alta homología de secuencia y la mayoría muestre propiedades de unión de HLA similares incluso cuando existen variaciones de secuencia. De manera similar, las regiones que rodean un bloque serán de alta homología, lo que aumentará la probabilidad de que los péptidos del mismo bloque se procesen y presenten en la superficie de las células diana de manera similar [27].

Los bloques de uno o más péptidos que se predice que se unirán a los mismos alelos HLA con afinidad similar son dianas potencialmente valiosas para diseños de vacunas polivalentes. Esto permite la inmunización simultánea con varios epítopos, una táctica necesaria contra virus altamente mutantes en los que las mutaciones que introducen la resistencia a los medicamentos pueden ocurrir en un solo día [28, 29]. Anteriormente utilizamos una versión rudimentaria del análisis de conservación en bloque para el descubrimiento de la diana de la vacuna en el virus del dengue (DENV) [30] e informamos de un número 10 veces mayor de posibles candidatos a la diana de la vacuna CD8 + en comparación con un estudio de referencia anterior de la diana de la vacuna DENV. candidatos [31]. Aquí formalizamos el enfoque y presentamos una implementación de software. Para demostrar aún más la utilidad de la conservación de bloques, realizamos un análisis de epítopos de HLA de clase I en hemaglutinina (HA) de influenza A H7N9. El software está integrado en un servicio web disponible gratuitamente en http://met-hilab.cbs.dtu.dk/blockcons/.


Resultados

Las vacunas son inmunogénicas y protectoras en ratones consanguíneos y consanguíneos.

La inmunogenicidad y la eficacia protectora de las vacunas combinadas contra las cepas CovR / S WT y MT se evaluaron en el modelo murino de infección cutánea por estreptococo A, en ratones consanguíneos y consanguíneos. Se administró a ratones endocriados SWISS (n = 10) J8-CRM + K4S2-CRM / Alum y a ratones BALB / c (n = 10) se les administró p * 17-DT + K4S2-DT / Alum, como tres inyecciones intramusculares. Las inmunizaciones finales fueron seguidas de pruebas cutáneas con Strep A CovR / S MT 5448AP (emm 1) o PESO (pNS1, emm 100) cepa. Tanto J8-CRM + K4S2-CRM / Alum como p * 17-DT + K4S2-DT / Alum indujeron títulos de IgG específicos de péptidos entre 10 4-10 6 (datos no mostrados) y fueron eficaces en la protección de ratones (& gt 99% de reducción en carga bacteriana) contra la infección sistémica inducida por Strep A de la cepa de Strep A WT o MT (Fig. 1a-d).

Eficacia protectora de J8-CRM + K4S2-CRM / Alum contra enfermedades invasivas después de la exposición a la piel. (a,B) Se inmunizaron cohortes de ratones SWISS (n = 10) por vía intramuscular con 0,025 mg / dosis de J8-CRM + K4S2-CRM / Alum los días 1, 22 y 43. Tras el refuerzo final, los ratones se expusieron a través de la piel con un mutante de Strep A 5448AP o cepa pNS1 de tipo salvaje. Los ratones se sacrificaron el día 7 después de la exposición y se sembraron en placa muestras de sangre para determinar la carga bacteriana. (C,D) Eficacia protectora de p * 17-DT + K4S2-DT / alumbre contra la enfermedad invasiva tras la exposición cutánea de ratones BALB / c. Se inmunizaron por vía intramuscular ratones BALB / c (n = 10 / grupo, hembras, 4-6 semanas de edad) con 0,025 mg / dosis de p * 17-DT + K4S2-DT / Alum los días 0, 21 y 42. Dos semanas después En la inmunización final, los ratones se expusieron a través de la piel con 5448AP. Los ratones se sacrificaron el día 7 después de la exposición y las muestras de sangre se sembraron en placas para determinar la carga bacteriana (unidades formadoras de colonias [ufc]). Carga bacteriana en sangre individual (ufc / mL) (a y C) y reducción del porcentaje de grupo en la carga bacteriana en sangre (B y D) son exhibidos. La protección se define como la reducción porcentual de la carga bacteriana y se calcula utilizando la carga bacteriana de Geomean en la sangre del grupo vacunado y de control (PBS / Alum). Las comparaciones estadísticas y los gráficos generados mediante la prueba de Mann-Whitney se realizaron utilizando GraphPad Prism (8.1.2). ***pag & lt 0,001, ****pag & lt 0,0001.

Un estudio de toxicidad de dosis repetidas en ratas Sprague Dawley de dos vacunas candidatas

Se administraron dos vacunas candidatas, J8-CRM + K4S2-CRM / Alum y p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum, y un artículo de control, CRM / Alum, a ratas Sprague-Dawley machos y hembras (n = 20, 10 / sexo / grupo) los días 1, 22 y 43. Las ratas recibieron inyecciones intramusculares de 0,5 ml (0,25 ml / muslo) de la siguiente manera: Grupo 1: 0,065 mg de CRM / alumbre (control) Grupo 2: 0,1 mg de J8-CRM + K4S2 -CRM / Alumbre Grupo 3—0.1 mg p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alumbre. El artículo de control, CRM / Alum, contenía 0,065 mg de CRM, que es la concentración media de CRM contenida en cualquiera de las vacunas. J8-CRM + K4S2-CRM / Alum contenía 0,05 mg de J8-CRM y 0,05 mg de K4S2-CRM para una concentración neta de conjugado de péptido de 0,1 mg. p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum contenía 0,05 mg de p * 17-CRM y 0,05 mg de K4S2-CRM para una concentración neta de péptido conjugado de 0,1 mg (Tabla 1). Todos los animales del estudio se observaron durante todo el tratamiento hasta que la mitad de los animales del estudio se sacrificaron y se les practicó la necropsia el día 57 del estudio (cohorte principal, 2 semanas después de la dosis 3), las ratas restantes se sacrificaron y se les practicó la necropsia el día 86 del estudio (cohorte de recuperación, 6 semanas después de la dosis). 3).

Todos los animales sobrevivieron hasta el sacrificio programado. No se informaron hallazgos adversos relacionados con la vacuna en los signos clínicos, peso corporal, consumo de alimentos, oftalmología, patología macroscópica u observaciones macroscópicas. Todos los cambios microscópicos observados en los grupos de vacuna estuvieron dentro del espectro de hallazgos esperados después de la vacunación y se consideraron no adversos.

Evaluación de la irritación local (puntuación Draize)

Se observaron eritema y edema menores en todos los grupos de dosis, después de la primera y segunda dosis. Después de la tercera dosis, se observó un efecto sobre el eritema y el edema en los lugares de inyección en los grupos de vacunas femeninas en comparación con las mujeres del grupo de control CRM / Alum. Los hallazgos en las puntuaciones de los grupos de vacunas masculinas en comparación con el grupo de control no se consideraron toxicológicamente relevantes.

En el grupo de control femenino, la aparición del eritema se produjo 48 h después de la dosis y comenzó a resolverse 72 h después de la dosis. En ambos grupos de vacunas femeninas, el inicio máximo del eritema se produjo a las 24 horas y persistió hasta las 72 horas posteriores a la dosis. Se observó un aumento significativo del eritema (izquierdo y derecho) a las 24 y 72 h después de la dosis en ambos grupos de vacuna. Además, a las 72 h después de la dosis, se observó un aumento en las puntuaciones de edema de la pierna izquierda y derecha en el grupo de mujeres J8-CRM + K4S2-CRM / Alum, en comparación con el grupo de control. Esto también se observó en el grupo femenino p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum, donde se observó un aumento significativo en el edema de la pierna izquierda y un aumento (no significativo) en el edema de la pierna derecha a las 72 h posteriores a la dosis (Fig.2 ). Estas observaciones se consideraron no adversas y no se observaron otros efectos toxicológicamente relevantes sobre la irritación local.

Puntaje de Draize hembra después de la tercera dosis (día 43). Las puntuaciones de Draize se tratan como réplicas (n = 10), para cada observación clínica, en un momento determinado. Las cuatro observaciones clínicas (a) eritema de la pierna izquierda (B) edema de la pierna izquierda (C) eritema de la pierna derecha y (D) edema de la pierna derecha se muestran para cada punto de tiempo. Los datos de una observación, en un momento determinado, se muestran como media de puntuación de grupo con DE. El análisis estadístico y los gráficos generados usando la prueba T para comparar cada grupo de vacuna con el control CRM / Alum, en cada punto de tiempo, se realizaron usando GraphPad Prism (8.1.2). *pag & lt 0.05, **pag & lt 0.01.

Patologia clinica

No se informaron hallazgos adversos relacionados con la vacuna en la química clínica, la coagulación o el análisis de orina durante las fases del estudio. Ningún efecto sobre los parámetros hematológicos se consideró relacionado con la vacuna durante la fase de dosificación del estudio. En el sacrificio del día 86, se informó un aumento modesto en los recuentos de glóbulos blancos y linfocitos en ambos grupos de mujeres que recibieron la vacuna (diferencia significativa del 5% con respecto al grupo de control CRM / Alum). También se observaron recuentos de monocitos levemente elevados en el día 86 en mujeres que recibieron p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum (diferencia significativa del 5% del grupo de control CRM / Alum). Estos aumentos no se consideraron adversos, sino más bien un reflejo de la respuesta inmune inducida por la inmunización.

Inmunogenicidad y evaluación funcional de vacunas en ratas.

No se detectaron anticuerpos específicos de péptido en muestras de suero recogidas de ratas antes de la dosificación (Fig. 3a, b). Hubo una fuerte respuesta inmune a los péptidos Strep A, J8 y K4S2, en los animales del grupo principal J8-CRM + K4S2-CRM / Alum (sueros del día 57) que persistió en los animales del grupo de recuperación (sueros del día 86) (Fig. 3a). Además, hubo una fuerte respuesta inmune a los péptidos Strep A, p * 17 y K4S2, en los animales del grupo principal p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum que persistió en los animales de recuperación (Fig. 3b).

Inmunogenicidad vacunal y funcionalidad de anticuerpos inducidos por vacunas. (a,B) Títulos de IgG séricos específicos de péptidos de la vacuna inducidos en ratas Sprague-Dawley después de la vacunación con J8-CRM + K4S2-CRM / Alum o p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum. Se inmunizaron ratas Sprague-Dawley por vía intramuscular con 0,1 mg / dosis de J8-CRM + K4S2-CRM / Alum o p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum los días 0, 21 y 42. Las ratas se sacrificaron el día 57 y el día 86. Se muestran títulos de IgG séricos específicos de J8, p * 17 y K4S2 (Geomean) para ratas individuales vacunadas con J8-CRM + K4S2-CRM / Alum (a) o p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alumbre (B) sacrificados el día 57 (n = 10 5 hombres, 5 mujeres) o 86 (n = 10 5 hombres, 5 mujeres). También se muestran los títulos de IgG en suero previos a la vacunación (día 0) de las mismas ratas evaluadas en el día 57 o 87. Las muestras se consideraron positivas cuando el valor medio de la absorbancia, de la dilución más alta (1: 100), estaba & gt 3SD por encima de la DO media del control negativo. (C,D) Strep A que se une a la superficie de los anticuerpos inducidos por la vacuna. Los sueros recolectados de ratas vacunadas con J8-CRM + K4S2-CRM / Alum, p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum o CRM / Alum en el estudio de toxicología se evaluaron para determinar la unión directa de IgG a pM1 muerto por calor (C) y 5448AP (D). Se muestran los títulos individuales medios de sueros recogidos de los días 0 (n = 4) y -57 (n = 4) y analizados mediante ELISA. El análisis estadístico y los gráficos generados mediante una prueba de Mann-Whitney para comparar todos los grupos se realizaron con GraphPad Prism (8.1.2) *pag & lt 0.05, **pag & lt 0.01, ***pag & lt 0,001, ****pag & lt 0,0001.

La funcionalidad de los anticuerpos inducidos por la vacuna en ratas se evaluó mediante el reconocimiento de anticuerpos de proteínas bacterianas. Los anticuerpos inducidos por la vacuna generados en el estudio de toxicología se evaluaron para el reconocimiento directo de proteínas bacterianas mediante ELISA. Sueros recolectados antes de la dosificación (día-0) y en la necropsia principal (día-57), de cada cohorte J8-CRM + K4S2-CRM / Alum, p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum y CRM / Alum (n = 4 / cohorte), se agregaron a los pocillos recubiertos con preparaciones de células enteras muertas por calor de Strep A emm 1 cepas pM1 (WT) y 5448AP (MT). La unión directa a las proteínas bacterianas se definió mediante títulos de IgG totales. En general, se observó una unión significativa a las proteínas bacterianas en los títulos del día 57 para todas las cohortes en comparación con los títulos del día 0. También se realizó un análisis comparativo entre la unión de los anticuerpos candidatos inducidos por la vacuna y los anticuerpos de control inducidos por CRM / Alum. No se observaron diferencias significativas en la capacidad de unión de los anticuerpos inducidos por J8-CRM + K4S2-CRM / Alum y p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum del día 57 frente a bacterias de tipo salvaje o mutantes. La unión a WT pM1 por los anticuerpos inducidos por la vacuna J8-CRM + K4S2-CRM / Alum o p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum fue significativamente mayor (pag & lt 0,05) que los anticuerpos inducidos por CRM / Alum. La unión a MT 5448AP por anticuerpos inducidos por la vacuna p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum fue significativamente mayor (pag & lt 0,05) que los anticuerpos inducidos por CRM / Alum. No hubo diferencia significativa en la unión a 5448AP entre el día 57 J8-CRM + K4S2-CRM / Alum y CRM / Alum. Finalmente, no se observó ninguna diferencia significativa en la unión entre los títulos del día 0 para todas las cohortes (Fig. 3c, d).

Pesos de órganos

No se informaron cambios de peso relacionados con la vacuna en el cerebro, epidídimo, corazón, riñón, hígado o pulmones en las necropsias del día 57 o 86. Se observó un aumento mínimo o leve en los pesos de las glándulas suprarrenales en las ratas macho que recibieron los candidatos a vacuna, en comparación con el control CRM / Alum, en el sacrificio del día 57. Esto se consideró un cambio común en la patología toxicológica. El correlato histopatológico fue la hipertrofia adrenocortical, que típicamente es secundaria al estrés fisiológico. No se informaron cambios en el peso de los órganos relacionados con la vacuna en el sacrificio del día 86.

Análisis histopatológico

En la Tabla complementaria S1 se proporciona una lista de los órganos y tejidos retenidos para el examen histopatológico. En resumen, las observaciones microscópicas en las ratas que recibieron la vacuna, en comparación con las ratas de control CRM / Alum, fueron inflamación granulomatosa en los lugares de inyección derecho y / o izquierdo y ganglios linfáticos inguinales en machos y / o hembras, e hipertrofia adrenocortical en machos. . Todas las observaciones se consideraron no adversas.

En el día 57 del sacrificio, la incidencia global de inflamación granulomatosa observada en los sitios de inyección derecho e izquierdo fue comparable entre el grupo de control y los grupos de vacuna (Tabla complementaria S2). Hubo un ligero aumento en la gravedad de la inflamación granulomatosa en los sitios de inyección izquierdo y derecho de las ratas macho y en el sitio de inyección derecho de las ratas hembra que recibieron J8-CRM + K4S2-CRM / Alum. Asimismo, hubo un pequeño aumento en la gravedad de la inflamación granulomatosa en los sitios de inyección izquierdo y derecho de las ratas hembra y en el sitio de inyección izquierdo de las ratas macho que recibieron p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum. En el día 86, persistió un ligero aumento en la gravedad de la inflamación granulomatosa en el sitio de inyección derecho de una de las cinco ratas hembras que recibieron p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum. No se observó evidencia de inflamación granulomatosa persistente en el sitio de inyección izquierdo. Los granulomas en el lugar de la inyección contenían agregados de macrófagos intercalados con pequeñas cantidades de linfocitos y células plasmáticas típicamente alrededor de la periferia de los agregados de macrófagos.

Se observó un aumento en la gravedad de la inflamación granulomatosa en los grupos de vacuna en los ganglios linfáticos inguinales (Tabla complementaria S3). En el sacrificio del día 57, el grupo al que se le administró J8-CRM + K4S2-CRM / Alum experimentó un ligero aumento en la gravedad de la inflamación granulomatosa de los ganglios izquierdo y derecho de las ratas hembra y los ganglios derechos de las ratas macho. La incidencia general de este hallazgo se consideró similar en los grupos de control y de vacuna. Además, en el sacrificio del día 86, se observó un pequeño aumento en la gravedad en los ganglios linfáticos inguinales izquierdos de ratas hembras en ambos grupos de vacuna. El aumento de la inflamación granulomatosa no se observó en los ganglios inguinales izquierdos de las ratas macho ni en los ganglios inguinales derechos de ninguno de los animales. Al igual que con la inflamación granulomatosa en el lugar de la inyección, los granulomas en los ganglios linfáticos inguinales se caracterizaron por la presencia de agregados de macrófagos. El material citoplasmático de los macrófagos individuales sugirió adyuvante fagocitado.

En el sacrificio del día 57, se informó hipertrofia adrenocortical mínima o leve en ratas macho en ambos grupos de vacuna, en comparación con el grupo de control CRM / Alum (Tabla complementaria S4). No se observó incidencia de hipertrofia moderada o marcada en ningún animal. El citoplasma de las células epiteliales corticales se describió como homogéneamente eosinofílico, mientras que el aumento del tamaño de las células provocó la compresión de los vasos sanguíneos próximos. La hipertrofia adrenocortical fue el correlato histopatológico para el aumento de peso de las glándulas suprarrenales, una respuesta al estrés típica observada en los estudios de toxicidad 20. En el contexto de este estudio, la observación se consideró secundaria al estrés fisiológico y no relacionada con la vacuna. No hubo informes de hipertrofia adrenocortical en el sacrificio del día 86.

Examen de los riñones, el cerebro y las articulaciones.

No se informaron hallazgos adversos relacionados con la vacuna en los riñones. Tanto en las necropsias del día 57 como en las del día 86, no hubo evidencia de daño macroscópico (lesiones) o cambios en el peso del órgano. Tampoco se observó ningún efecto sobre los parámetros del análisis de orina, incluida la sangre y las proteínas, después de la administración de cualquiera de las vacunas en comparación con el control CRM / Alum.

Se informó un amplio espectro de hallazgos histopatológicos en los riñones en las necropsias del día 57 y 86 y se describen en la Tabla 2. Estos hallazgos fueron de incidencia y gravedad similares en los grupos de control de CRM / Alum y tratados con vacuna. Las observaciones se consideraron incidentales para la cepa y la edad de las ratas y no relacionadas con la vacuna.

Un examen de los cerebros de todos los animales no encontró evidencia de daño macroscópico (lesiones) o hallazgos histopatológicos en la necropsia del día 57 ni evidencia de un cambio en el peso del órgano en el día 57 u 86. En el día 86, una sola rata macho Se encontró que p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum administrado tenía una dilatación leve de un ventrículo. No se informaron otros hallazgos histológicos relacionados con el cerebro durante el día 86.

Tampoco se informó de inflamación observada en las articulaciones de los animales que recibieron la vacuna.

Examen del corazon

Un examen microscópico del corazón no encontró evidencia de valvulitis, sin embargo, se observó miocardiopatía mínima en 11 de 60 animales y miocardiopatía leve en 1 animal, no se observó incidencia de miopatía moderada o marcada en ningún animal (Tabla 3). Análisis estadístico (prueba exacta de Fisher, pag & lt 0.05, GraphPad Prism) de miocardiopatía observada el día 56 en los grupos que recibieron la vacuna en comparación con el artículo de control no determinó una diferencia significativa en las tasas observadas (J8-CRM + K4S2-CRM / Alum pag valor 0.9999, p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alumbre PAG valor 0,9999). Además, las observaciones en el día 86 en los grupos que recibieron la vacuna en comparación con el artículo de control no determinaron diferencias significativas en las tasas de miocardiopatía observadas (J8-CRM + K4S2-CRM / Alum pag valor 0.0867, p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alumbre pag valor 0,2105). La observación de miocardiopatía está en línea con otros estudios de toxicología, donde la miocardiopatía espontánea en ratas jóvenes Sprague-Dawley es un hallazgo de antecedentes común y se ha informado que tiene una incidencia de hasta el 100%, particularmente en machos 21. La conclusión general fue que se trata de un hallazgo incidental no relacionado con las vacunas. Esto apoya nuestros hallazgos previos con J8 en un modelo de valvulitis cardíaca 13.

Estabilidad de las vacunas durante 12 meses.

La estabilidad de las vacunas, para el almacenamiento a largo plazo a 5 ° C ± 3 ° C, se evaluó en puntos de tiempo de 3, 6 y 12 meses (T3, T6, T12), después de la fabricación (Tiempo 0). Los parámetros de estabilidad evaluados fueron apariencia, pH, adsorción a alumbre (Tabla 4) e inmunogenicidad (Fig. 4). Se demostró que las vacunas son estables hasta por 12 meses, cuando se almacenan a 5 ° C ± 3 ° C, sin cambios significativos en los parámetros medidos durante ese tiempo. Esto incluyó la inducción de una potente respuesta inmune esperada en ratas Sprague Dawley.

Estabilidad de las vacunas. Se compararon los títulos de IgG sérica específicos de péptidos inducidos en ratas Sprague-Dawley, después de la vacunación con J8-CRM + K4S2-CRM / Alum o p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum almacenados durante 0, 3, 6 y 12 meses. Se inmunizaron ratas Sprague-Dawley una vez por vía intramuscular con 0,1 mg / dosis de J8-CRM + K4S2-CRM / Alum o p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alum. 18 ± 2 días después de la inmunización, se extrajo sangre de las ratas. Se muestran los títulos de IgG sérica específicos de J8, p * 17 y K4S2. Títulos de IgG en ratas (n = 6 3 machos, 3 hembras) vacunadas con J8-CRM + K4S2-CRM / Alum (a) o p * 17-CRM + K4S2-CRM / Alumbre (B) almacenado para 0 (T0), 3 (T3), 6 (T6) y 12 meses (T12). Las muestras se consideraron positivas cuando el valor medio de la absorbancia de la dilución más alta (1: 100) estaba 3 DE por encima de la DO media del control negativo. El análisis estadístico utilizando una prueba de Mann-Whitney para comparar todos los grupos con el grupo T0 se realizó utilizando GraphPad Prism (8.1.2). *pag & lt 0,05.


Resultados y discusión

Diseño de CHOPS

los Estafilocócica La proteína CHIPS es uno de los inhibidores más potentes de las respuestas inflamatorias inducidas por C5a que se conocen actualmente. En contraste con los numerosos agentes desarrollados para interactuar directamente con el sitio de activación de C5aR ubicado dentro del núcleo del receptor (Proctor et al. 2006 Chen et al. 2010), CHIPS bloquea la activación de C5a al unirse con alta afinidad al N extracelular flexible. -porción terminal del C5aR (Postma et al. 2005). La superficie de interacción de CHIPS31–121 con el C5aR comprende

20% de su superficie accesible al disolvente y no se limita a una región limitada de la proteína. Las interacciones entre CHIPS y C5aR implican un número sustancial de aminoácidos no secuenciales posicionados de forma óptima en la proteína inhibidora para proporcionar una unión estrecha. Una imitación exitosa de CHIPS no solo debe incluir los residuos de aminoácidos (o imitaciones de estos) cruciales para la unión de C5aR, sino también los aminoácidos responsables de la disposición espacial adecuada dictada por la topología de plegado de CHIPS. Nuestro primer enfoque para construir una estructura de este tipo es dejar fuera un número limitado de residuos que no interactúan directamente con el C5aR, pero con la intención de dejar la integridad estructural de CHIPS.31–121 intacto. Los estudios de titulación de RMN revelaron que dos regiones de CHIPS31–121 muestran perturbaciones relativamente grandes en la columna vertebral y cambios químicos de Cβ (Ippel et al. 2009): la primera región incluye los residuos 43-61, que comprenden parte de la hélice α y la hebra de conexión del bucle posterior β1 (Figura 1a). La segunda región está compuesta por los residuos 95-111 y comprende hebras β3 y β4 de CHIPS31–121. La parte que no interactúa de CHIPS31–121 comprende la hebra β2 y el bucle largo que conecta β2 con β3 (Figura 1a). Esta porción podría potencialmente quedar fuera conectando directamente la hebra β1 con β3 a través de una curva cerrada. Inspección de los modelos estructurales de RMN de CHIPS31–121 revela que el residuo L65 al final de la cadena β1 y el residuo K95 al comienzo de la cadena β3 are proximal and offer an excellent opportunity to link the two fragments interacting with the C5aR together to form one short, contiguous sequence. Several β-hairpin inducing sequences have been described and reviewed in the literature (Blanco et al. 1998 Stotz and Topp 2004). One of the smallest peptide fragments, which induces a β-turn and facilitates the formation of an anti-parallel β-sheet, is the dipeptide D-Pro-Gly (Haque and Gellman 1997). This fragment was chosen to link the N- and C-terminal segments of CHIPS, which interact with the C5aR, together. These segments were chosen to comprise the complete elements of secondary structure as present in native CHIPS (i.e. the α-helix and β-strands β1, β3, and β4) in order to pursue structural integrity. The resulting construct consisted of the CHIPS amino acid sequences T36-L65 and K95-G112 interconnected by D-Pro-Gly (Fig. 1b). A number of residues suggested to be part of discontinuous immunogenic epitopes by Gustafsson et al. (2009) are not present in this construct (designated CHOPS). A model representation of CHOPS based on the structure of native CHIPS31–121 is presented in Fig. 1c.

Affinity of CHOPS for the C5aR N terminus

The affinity of the CHOPS fragment for the C5aR was determined using isothermal titration calorimetry (ITC). We synthesized two peptide mimics of the C5aR N terminus: unsulfated peptide C5aR7–28 representing residues 728 of the C5aR and peptide C5aR7–28S2, the same sequence with tyrosine residues 11 y 14 O-sulfated. We titrated a solution of CHOPS with these peptides and recorded the subsequent heat exchange upon formation of the complex. Two typical ITC experiments are shown in Supplementary Figure 3. Clearly, titration of the doubly sulfated peptide C5aR7–28S2 to CHOPS resulted in a substantial exothermic effect (Supplementary Figure 3a) while no significant response was detected in the ITC experiment with the unsulfated peptide C5aR7–28 (Supplementary Figure 3b). Gratifyingly, the affinity of CHOPS for C5aR7–28S2 was in the micromolar range (K D = 3.6 ± 0.2 μM norte = 3). The complete thermodynamic analysis of these ITC data plus the comparison with previous ITC studies of CHIPS31–121 and C5a peptide mimics is compiled in Supplementary Table 1.

NMR spectroscopy

Previous NMR studies revealed that the synthetic peptides C5aR7–28 and C5aR7–28S2, which mimic the N-terminal portion of the C5aR, were very flexible in solution and did not have detectable propensity for any preferred secondary structure. Although there is no detailed structure available for the intact C5aR, it is expected that its free extra-cellular N terminus (residues 1–35) is unstructured as well. The protein CHIPS31–121 does adopt a well-defined conformation with flexible regions at the termini and some disorder in the loop region between the α-helix and strand β1 (Haas et al. 2005). As could be inferred from 15 N relaxation studies this particular loop region adopts an ordered conformation in the complex with C5aR7–28S2 (Ippel et al. 2009). NMR spectra of the free CHOPS construct appear to be typical for a largely unstructured polypeptide chain (Supplementary Figure 4a). 2D NOE spectra of free CHOPS contain predominantly sequential NOEs, but a few long-range contacts could be identified. These non-sequential cross-peaks are indicative for an anti-parallel orientation of strands β1 and β3, which are bridged by the β-hairpin inducing D-Pro-Gly sequence (Fig. 2).

Section of the NOESY spectrum of free CHOPS in solution. Several cross-peak assignments are shown indicative for the presence of a β-hairpin comprising strands β1 and β3

Titration of CHOPS with the unsulfated receptor mimic C5aR7–28 did not result in any changes in the 1 H-spectrum of the latter. In contrast, titration of CHOPS with the sulfated receptor mimic C5aR7–28S2 resulted in increased dispersion of resonance lines, which is characteristic for non-random coil behavior (Supplementary Figure 4b). The complex between CHOPS and C5aR7–28S2 is still flexible and the 1 H-spectra show a high degree of overlap. Nevertheless, we could assign some of the NMR signals as indicated in Supplementary Figure 4b. These new signals are at comparable positions as in spectra of the complex between CHIPS31–121 and C5aR7–28S2, and indicative for the formation of native-like structure. Similar features were observed in 1 H– 13 C HSQC spectra upon titration of C5aR7–28S2 to CHOPS (Fig. 3).

1 H– 13 C HSQC spectra of CHOPS. a Methyl group region of the 1 H– 13 C HSQC spectrum free CHOPS. B Similar spectrum of CHOPS in complex with receptor mimic C5aR7–28S2. The assignments are indicated. Peaks originating from C5aR7–28S2 se muestran en italic font

The NOESY spectra of the CHOPS:C5aR7–28S2 complex suffer from severe overlap, but still a limited number of long-range intra-molecular and inter-molecular NOE cross-peaks could be assigned. Inter-molecular NOEs were identified between the aromatic side-chain protons of sulfated tyrosine sY14 of C5aR7–28S2 and the side-chains of T53 (Fig. 4a) and Y108 (Fig. 4c) of CHOPS. H13 of C5aR7–28S2 has an NOE contact with V109 of CHOPS (Fig. 4b). Intra-molecular NOEs were identified between T53 and L49 and between Y97 and V109 (Fig. 4a). Similar peaks were observed in NOESY spectra of the complex between CHIPS31–121 and C5aR7–28S2. The position of these residues in the NMR structure of the CHIPS31–121:C5aR7–28S2 complex is indicated in Fig. 4d, e.

Observed cross-peaks in the NOESY spectrum of the CHOPS:C5aR7–28S2 complex in relation to structural features of the CHIPS31–121:C5aR7–28S2 complex (PDB ID code: 2K3U). a C Different sections of the NOESY spectrum recorded at 288 K of a 1:1 mixture of CHOPS and C5aR7–28S2. Identified long-range intra-molecular and inter-molecular NOE cross-peaks are indicated (normal fonts for residues belonging to CHOPS and italic fonts for residues belonging to C5aR7–28S2). D mi Cartoon representation of the structure of the CHIPS31–121:C5aR7–28S2 complejo. The side-chains of the residues identified in a C se muestran en stick representation. NOE cross-peaks observed in a C are indicated by flechas in the structure

CD spectroscopy

The presence of residual structure in the C5aR mimics and CHOPS was also monitored by CD spectroscopy. The CD spectra of the C5a-receptor mimics C5aR7–28 and C5aR7–28S2, and CHOPS show no structural features apart from a shallow minimum at 200 nm (Fig. 5). The CD spectrum of free CHIPS31–121 comprises a large positive signal around 190 nm and a minimum around 205 nm (Fig. 5). This spectrum does not change significantly upon binding of C5aR7–28S2 (datos no mostrados). Titration of CHOPS with a stoichiometric amount of unsulfated receptor mimic C5aR7–28 resulted in an increase of the CD signal, although the shape of the spectrum did not change (Fig. 5a). Stoichiometric titration of CHOPS with sulfated receptor mimic C5aR7–28S2, on the other hand yielded a clear change of the CD spectrum: an increase in the signal around 190 nm and a shift of the minimum from 200 to 205 nm (Fig. 5b). These changes shift the appearance of the CD spectrum towards that of CHIPS31–121 although at lower intensities.

Circular dichroism spectra (CD) of CHOPS, CHIPS31–121 and C5aR mimics. a CD spectra of CHOPS, C5aR7–28, CHOPS:C5aR7–28, and CHIPS31–121. B CD spectra of CHOPS, C5aR7–28S2, CHOPS:C5aR7–28S2, and CHIPS31–121

In this study we aimed to create a shorter version of the immune evasive protein CHIPS based on the NMR structure of the complex between CHIPS31–121 and C5aR7–28S2. The construct we designed (CHOPS) comprises all portions of CHIPS31–121 important in the interaction with the C5aR. Portions outside the binding region including strand β2 and the connecting loop between β2 and β3 were discarded. This was accomplished by coupling strand β1 and β3 together via a D-Pro-Gly linker segment. The resulting 50-residue long peptide appeared to be largely unfolded apart from some residual structure around the β-hairpin inducing D-Pro-Gly linker sequence. ITC studies revealed that CHOPS binds to the doubly sulfated C5a-receptor mimic C5aR7–28S2 with micromolar affinity (K D = 3.6 ± 0.2 μM). Although the affinity of C5aR7–28S2 to CHOPS is three orders of magnitude lower compared to binding to CHIPS31–121 (K D = 8.4 ± 1.2 nM Ippel et al. 2009), this is a very promising result for a first lead compound. No detectable affinity of CHOPS was observed in the ITC measurements using the unsulfated mimic C5aR7–28. This is consistent with previous measurements of CHIPS31–121 and C5aR7–28, which revealed that the absence of the two sulfate moieties results in an almost 400-fold decrease in affinity.

NMR spectroscopy confirmed the results obtained by ITC. Titration of CHOPS with unsulfated receptor mimic C5aR7–28 resulted in the sum of its constituent 1 H-spectra, while titration of doubly sulfated peptide C5aR7–28S2 yielded a completely different 1 H-spectrum with signals shifted from their random coil position. The latter is indicative for the formation of defined structural elements. The NMR titration experiments using C5aR7–28S2 showed binding in a fast-exchange regime, compatible with the observed micromolar affinity by ITC (Cavanagh et al. 2007). Several characteristic features observed in spectra of the CHIPS31–121:C5aR7–28S2 complex were also present in spectra of CHOPS:C5aR7–28S2. Specific resonances of residues L49, T53, T96, Y97, Y108, V109 and N111 have chemical shifts comparable with their counterparts in the CHIPS31–121:C5aR7–28S2 complejo. We also observed NOE cross-peaks between residues sY14, T53, L49, and Y108 and between residues H13, V109, and Y97 in NOESY spectra of CHOPS:C5aR7–28S2. These peaks are reminiscent of NOE contacts observed in spectra of the complex between CHIPS31–121 and C5aR7–28S2 and reveal that CHOPS, in the presence of sulfated peptide C5aR7–28S2, adopts similar structures as native CHIPS31–121.

The structural characteristics of CHOPS, either free in solution or in complex with the C5aR mimics, were also studied by CD spectroscopy. The spectra of the separate peptides (CHOPS, C5aR7–28 or C5aR7–28S2) did not show any significant absorption apart from a shallow minimum around 200 nm. Titration of CHOPS with receptor mimic C5aR7–28 increased the amount of absorption, but not the position of its minimum. Titration of CHOPS with the doubly sulfated receptor mimic C5aR7–28S2 caused an increase in absorption around 190 nm as well as a shift of the absorption minimum from 200 to 205 nm. Although the maximum and minimum intensities are smaller, the overall shape of the CD spectrum of the CHOPS:C5aR7–28S2 complex resembles that of native CHIPS31–121.


What is the maximum length of a peptide and minimum length of a protein?

Also, linking to an article would be nice, I know what wikipedia says.

Interesante pregunta. A peptide is technically any two or more amino acids linked by a peptide bond, so there is no maximum size. All proteins are peptide chains, the largest one in humans is titin, a spring-like muscle protein comprised of 34350 amino acids. Its virtually impossible to work with biochemically as a whole. Probably, there are bigger peptides out there.

Protein can also be used to refer to any peptide chain and in nutrition I believe it refers simply to amino acid content. There is no strictly delineated minimal size.

In terms of usage, protein generally refers to a complete gene product, whatever its size. Protein fragment is used to refer to incomplete gene products greater than 30-40 amino acids in length, and peptide is used to refer to everything smaller.


Methods

Clonación

In order to introduce an arginine followed by a stop codon in T2i88-8-pf [21] site-directed mutagenesis PCR was used. The resulting plasmids were transformed into Escherichia coli strain DH5α by heat shock. The resulting ampicilin-resistant colonies were screened for the recombinant gene by sequencing after miniprep (Promega, Madison, WI, USA). Plasmids harboring the desired genes were transformed into the Escherichia coli strain BL21(DE3) expression cells (Novagen, Gibbstown, NJ, USA) and a 20 % glycerol stock of each construct (3HR, 2.5HR y 2HR) was stored at −80 °C.

Protein expression

An overnight culture (50 ml) of BL21(DE3) (Novagen, Gibbstown, NJ, USA) cells containing the expression construct was added to LB (3L) supplemented with ampicillin (Fisher, Pittsburgh, PA, USA, 6 ml, 100 mg/ml). The culture was incubated (190 rpm, 37 °C) until the OD600 reached

0.5–0.6, at which time protein expression was induced (IPTG, Fisher, Pittsburgh, PA, USA, 3 ml, 1 M) and the culture incubated further (190 rpm, 37 °C, 3 h). The cells were isolated by centrifugation (4000gramo, 12 min), and the pellet was stored at −80 °C.

Purificación de proteínas

Purification was done under denaturing conditions (9 M urea). Cell pellet was thawed on ice, resuspended in lysis buffer A which is composed of 9 M Urea, 100 mM NaH2correos4, 10 mM Tris and 10 mM β-mercaptoethanol, pH 8.0 and lysed by sonication (SONICATOR → 3000 Ultrasonic Liquid Processor, cycle of 4 s pulse at 55 % amplitude followed by a 6 s rest repeated for a 10 min period). The insoluble cell debris was cleared by centrifugation (45 min at 30,500gramo). The supernatant was then incubated with nickel beads (Qiagen, Valencia, CA, USA) for one hour. Possible DNA contamination was removed by a wash with buffer B at pH 8.0: 9 M Urea, 500 mM NaH2correos4, 10 mM Tris, 10 mM imidazole. Protein contaminants were washed from the column using a pH gradient and 10 mM imidazole in the buffers. The first wash was done with lysis buffer A and the second and third washes at pHs 6.3 and 5.9 respectively with a buffer containing 9 M Urea, 100 mM NaH2correos4, 20 mM sodium citrate, 10 mM imidazole and 10 mM β- mercaptoethanol. Elution was done at pH 5.2 and pH 4.5 again with 9 M Urea, 100 mM NaH2correos4, 20 mM sodium citrate, 10 mM imidazole and 10 mM β-mercaptoethanol. Any protein that did not elute at the lower pH washes was eluted with buffers containing high concentration of imidazole (buffer C: 9 M Urea, 100 mM NaH2correos4, 10 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 8.0 or buffer D: 9 M Urea, 100 mM NaH2correos4, 10 mM Tris, 500 mM imidazole, pH 8.0).

Protein purity was verified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (15 % gel). Following purification, the denatured monomeric peptides were refolded using one of the following three methods: (1) dialysis performed in a stepwise manner (stepwise refolding) (2) one step dialysis against a buffer with no urea (direct refolding) or (3) concentrated (Amicon Ultra centrifugal filter devices, Millipore, Billerica, MA, USA) and diluted to a buffer with no urea (quick refolding). The proteins were filtered with a 0.1 μm polyvinylidene fluoride membrane filter before and after dialysis (Millipore, Billerica, MA, USA, #SLVV 033 RS).

For all three designs (3HR, 2.5HR y 2HR) the protein concentration was calculated using the absorbance at 280 nm with the extinction coefficient (M −1 cm −1 ) and molecular weight (Daltons) of the protein. The extinction coefficient and molecular weight were obtained with ExPASy’s ProtParam tool (http://ca.expasy.org/tools/protparam.html).

Dynamic light scattering

The hydrodynamic diameter was obtained with a Malvern Zetasizer Nano S equipped with a 633 nm laser using a 3 mm path length quartz suprasil cell. The measurements were done at 25 °C and for each protein five scans were collected.

Transmission electron microscopy

Transmission Electron Microscopy samples were negatively stained with 1 % uranyl acetate (SPI) at a peptide concentration of 50 μg/ml. Electron micrographs were taken with a Philips EM 300 transmission electron microscope at an accelerating voltage of 80 kV. The micrographs were scanned at 600 dpi.

Model building

A starting model of the nanoparticle peptide was built using the crystal structures of the helix-turn-helix motif of the channel-forming domain of colicin E1 [24], the tryptophan zipper [25] and a de novo designed trimeric coiled-coil peptide [26] as templates for the linker, the N-terminal pentameric domain and the C-terminal trimeric domain, respectively (Fig. 1a). The model building (Fig. 1b) was done in silico using the graphics program ‘O’ version 12.0.1 [27].

Molecular dynamics simulation

Eleven different constructs were studied by molecular dynamics (MD) simulations with CHARMM 36b1 [28] installed on a Linux cluster at the Biotech Center of the University of Connecticut. The whole MD simulation procedure is divided into five steps: vacuum minimization, solvation, energy minimization, heating and equilibration, and production dynamics. The peptide molecule was solvated and ions were added to achieve a particular salt concentration. In the energy minimization step, we used the steepest descent (SD) method for 50 steps followed by the adopted basis Newton–Raphson (ABNR) method for 50,000 steps, where each step is 1 fs. After the energy minimization of the whole system, the temperature was raised slowly to 300 K from an initial temperature of 100 K at a rate of 10°/1000 steps to relax the molecule and then to run the equilibration for a total time of 100 ps, including the time to raise the temperature. Production dynamics for 2 ns were run thereafter on the whole system for initial screening. Long 10 ns production dynamics were also performed on selected models to find the best one. To analyze the final models, we have calculated root mean square deviation (RMSD) and radius of gyration (RGYR) with respect to the energy minimized structure using CHARMM algorithm [28].


Introducción

Novel coronaviruses are large enveloped single-stranded RNA viruses (size ranging from

32 kb in length) in the coronaviridae family that cause the common cold, influenza-like illness and more serious acute respiratory illnesses, including pneumonia, exacerbations of underlying lung disease, croup and bronchiolitis [1–3]. The subgroups of coronavirus families are alpha (α), beta (β), gamma (γ) and delta (δ) coronaviruses. In particular, this virus was reported to be a member of the β group of coronaviruses. The novel virus was Wuhan coronavirus or 2019 novel coronavirus (2019-norteCoV) by the Chinese [4–7]. The International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) named the virus SARS-CoV-2 and the disease COVID-19 [8–10]. Globally, to date, there has been 1 death every

358 people in the general population. In addition, 89% of the time, the person who died had one or more underlying medical conditions. A total of

8,256,725 coronavirus cases in approximately

3.4% of reported COVID-19 cases have died according to the COVID-19 outbreak [4–7] as of June 17, 2020, 02:16 GMT. By comparison, seasonal flu generally kills far fewer than 1% of those infected [9], estimated by simply looking at the value of current total deaths plus current total recovered and pairing it with a case total in the past that has the same value, i.e.,

445,959/(445,959 + 4,306,426) = 9% CFR (crude fatality ratio) worldwide [11].

Since the 1930s, when the coronavirus family of viruses was first identified, until now commercially, there have been no successful vaccines or antiviral drugs that have been able to prevent or treat infections for COVID-19, and past and current vaccine development efforts against this disease might be of high value for the development of an effective vaccine for COVID-19 [12–14]. According to the WHO,

41 candidate vaccines are being developed for COVID-19 from different countries as of March 13, 2020 (WHO 15 Mar 2020). Many research teams worldwide have been working on monoclonal and polyclonal antibodies against novel coronaviruses produced in vitro using tissue culture techniques, but few of them have entered into trials. Monoclonal antibodies are generally very rarely used in the treatment of infectious diseases. As polyclonal antibodies are composed of a mixture that represents the natural immune response to an antigen, they are prone to a higher risk since they are not all successful. Second, drugs and small molecules can calm the immune system, but patients become seriously ill when their immune system overreacts and starts causing collateral damage to the body. The US Food and Drug Administration today dated June 4, 2020, announced the following actions taken in its ongoing response effort to the COVID-19 pandemic. Dexmedetomidine hydrochloride in

0.9% sodium chloride injection (ANDA-209307) [15] and hydroxychloroquine and chloroquine to treat COVID-19 [16], but side effects such as irregular heartbeats, dizziness or fainting, require medical attention immediately. Another drug use of remdesivir in treatment of COVID-19 is having current drug with possible mechanism of action and chemistry of remdesivir against viral infection [12–14].

The inhaled virus SARS-norteCoV-2 likely binds to epithelial cells in the nasal cavity and starts replicating [17]. Human angiotensin-converting enzyme-2 (hACE2) is the main receptor for cell entry in both SARS-CoV and SARS-norteCoV-2 outbreaks [18, 19]. The spike glycoprotein (S) on the surface of coronaviruses is essential for virus entry through binding to the hACE2 receptor and for viral fusion with the host cell [20]. Thus, one could target this interaction site between hACE2 and SARS-norteCoV-2 spike protein with antibodies or small drug molecules [21]. In vitro data with SARS-norteCoV-2 indicate that ciliated cells are primary cells infected in the conducting airways [22]. At this time, the disease COVID-19 is clinically manifest. Overexpression of hACE2 enhanced the disease severity in a physiologically relevant model for investigating hACE2 as a therapeutic target for antiviral intervention against the COVID-19 pandemic. Without a vaccine, we should not think of herd immunity as a light at the end of the tunnel. A vaccine is the only lifetime way to move directly from susceptibility to immunity, bypassing the pain from becoming infected and possibly dying. Moreover, the aim of this study is to focus on identifying selected fragmented (protein subunit) genetic code of antigenic epitope peptides from each novel coronavirus protein domain such as spike protein (S), membrane glycoprotein (M), envelop protein (E) and nucleocapsid protein (N) of the virus and use that as our vaccine. When the vaccine is injected into the body, muscle cells naturally “amplify” it by producing copies of each antigenic epitope peptide from each protein domain, which the immune system detects as a threat. This trains the body’s immune system to defend against novel coronaviruses to produce specific antibodies, such as IgG, IgA, IgM and IgM, by recognizing all antigenic peptides. Finally, only a solution is vaccine that produces antibodies by our own body’s β-cells to fight off infections by novel coronavirus other than any side effects.


VLPs for vaccination against cancer

A strong cytotoxic T lymphocyte (CTL)-mediated immune response is a major factor in eradicating tumor cells and the ability of VLPs to induce these responses by delivering antigen to the cytosol and activating the MHC class I pathway makes them excellent candidates for development of vaccines in the treatment of cancer. Several important elements of the immune system play a role in targeting cancer cells. First, DC cells must receive sufficient signals to mature and stimulate adaptive immunity. This is important to ensure that the immune system does not become tolerant to the antigen by activating regulatory T cells (Tregs) and suppressing the immune system. Second, most cancer antigens are related or identical to self-antigens. Finally, T cells must be able to overcome the immune-suppressive signals generated by tumor cells. VLPs have features that allow them to address these challenges. In this section, we consider the VLP-based vaccines that have been explored as potential anti-tumor treatments [185].

VLP-based vaccines developed against cervical cancer

Some viral infections can lead to cancer. For example, HPV is one of these viruses, especially the two types HPV16 and HPV18, which cause 70% of cervical cancer cases [186]. The virus also causes other cancers such as anal, head, and throat and genital warts. HPV capsid consists of two important proteins called L1 (major) and L2 (minor) proteins. Two commercial vaccines, Merck’s Gardasil®, and GlaxoSmithKline’s Cervarix® have been developed to prevent HPV-related cancer. The expression systems of these two L1-based VLP vaccines are yeast and insect cells, respectively. However, these two vaccines can only prevent cancer associated with genotypes 16 and 18 (Gardasil also protects against genotypes 11 and 6, which cause benign genital warts), and do not protect against other HPV genotypes. Meanwhile these prophylactic vaccines do not cure infected people. Therefore, researchers are still trying to develop a more efficient vaccine. It has been observed that two tumor-specific antigens called E6 and E7 are expressed in all HPV infected cells and increased in cervical tumor cells [187]. E6 inactivates the P53 by binding to ubiquitin ligase E6AP and E7 degrades the phosphorylated retinoblastoma tumor suppressor pRb [188]. Thus, these two proteins repress two critical tumor suppressor proteins. HPV VLP-based vaccines are mainly L1-based because this protein can form VLP. But because the L1 is not conserved between different types of HPV, the researchers have also focused on L2 based vaccine development [189, 190]. However, the L2 challenge is its inability to form VLP [189, 191]. The concatemers consists of tandem or conserves sequences of several HPV types were designed on the MS2 bacteriophage-based VLP vaccine and the mice immunized with the construct produced high antibody titers. They also protected against different types of HPV (16, 18, 31, 33, 45 and 58) in challenge test, as the latest version of the commercial VLP-based vaccine, Gardasil9 [192]. In another study, the bacteriophage AP205 capsid-based VLP with the surface display of the HPV L2-protein and VAR2CSA placental malaria antigen was developed to protect against two diseases, cervical cancer and PM infection, simultaneously. The results showed that this system can induce humoral immunity to protect mice in challenge against both diseases [193].

VLP-based vaccines developed against Breast cancer

Breast cancer is the most common cancer in women and affects men as well (https://www.who.int/). 20–30% of cases of invasive breast cancer is associated with overexpression of human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) that is involved in the proliferation and inhibition of programmed cell death [194, 195]. The induction of passive immunogenicity using monoclonal antibodies has been effective in preventing metastasis and tumor growth, but this method is costly, requires multiple administrations at regular intervals for long-term protection and has undesirable side effects [196, 197]. VLP-based vaccines have been shown to address these challenges. Active vaccination with a VLP-based vaccine derived from Acinetobacter phage AP205 coat protein, with surface displayed HER2 protein, was evaluated in FVB mice which had been transplanted with human HER2-positive breast cancer cells. This showed that vaccination was able to inhibit tumor growth in the mice. This approach induced strong humoral immunity and also overcame immune system tolerance [198]. The product of the SLC7A11 gene, xCT, is a transmembrane protein that is overexpressed in cancer stem cells and is a target in breast cancer therapy. This protein activates Treg cells, reduces glutathione synthesis, and helps to encourage tumor invasion as Treg cells suppress the immune system to promote immune tolerance to the tumor cells [199]. A bacteriophage MS2 VLP-based vaccine that displayed the extracellular loop of xCT transporter on its surface was used to treat mice carrying metastatic breast cancer cells. The treated animals produced high levels of specific antibodies and reduced metastasis [200]. Bolli et al. developed the AX09-0M6 as a VLP-based vaccine platform by displaying of the human xCT extracellular domain (ECD6) on its surface. In vaccinated BALB/c mice the neutralizing IgG2a titer was significantly increased and the growth of breast cancer stem cells, xCT activity and pulmonary metastasis was decreased [201].

VLP-based vaccines developed against pancreatic cancer

The cell surface glycoprotein, Mesothelin (MSLN), is overexpressed in many cancers, including pancreatic cancer, and is seen used as a potential anti-cancer drug target. This glycoprotein is involved in cell adhesion and causes cancer cell masses to attach to mesothelial cells. A VLP-based on SHIV VLPs with murine MSLN displayed on the surface of the particles was used to immunize mice harboring pancreatic tumor cells [202]. Following vaccination, tumor growth was inhibited and 60% of the treated mice survived. The VLP strongly stimulated both specific anti-tumor antibody production and CD8 + T cell immunity. It also prevented self-antigen suppression by inhibiting Treg cells.

An alternative therapeutic target for pancreatic cancer treatment is the transmembrane glycoprotein Trop2, which is also overexpressed in other cancers [203]. This protein has little or no expression in healthy epithelial tissue. A simian immunodeficiency virus (SIV) VLP-based vaccine presenting the Trop2 protein was examined for its efficacy against syngeneic pancreatic cancer in C57BL/6 mice [204]. Vaccinated mice showed reduced tumor growth and the VLP-based vaccine significantly activated CD4 + , CD8 + , and the natural killer cell population. Moreover, the population of Treg and myeloid‐derived suppressor cells in the tumor microenvironment was decreased. Decreased expression of immunosuppressive cytokines such as IL-10 and TGF-β confirmed that the treatment inhibited tumor-suppressing immune signals induced by the tumor cells [204].

VLP-based vaccines developed against melanoma

Melanoma is the cause of 10% of all skin tumors and more than 90% of deaths due to skin cancer [205]. A VLP-based vaccine derived from the plant CPMV was used to assess the capacity of and empty CPMV VLP (eCPMV) to suppress tumor growth. Culture medium containing bone marrow-derived DCs (BMDCs) and primary macrophages derived from C57BL6 mice were treated with eCPMV and after 24 h an increase in the expression of some cytokines, such as IL-1β, IL-6, IL-12p40, Ccl3 (MIP1-α), and TNF-α was observed. Treatment of B16F10 lung melanoma cells with eCPMV altered tumor microenvironment immune cell organization. Tumor-infiltrating neutrophil (TIN) numbers were increased and conversely the immune-suppressing cells such as CD11b− Ly6G+ neutrophils were decreased. The mechanism of action of the vaccine was investigated using null mutant mice lacking neutrophils and cytokines IL-12 and IFNγ. In these mice, vaccination was not effective against the tumor and the vaccine did not show its protective anti-tumor effects. This strongly suggests that the beneficial effect was immune-mediated and that neutrophils and IL-12 and IFNγ played a key role in the antitumor effects [206]. The bacteriophage Qβ-based VLP system coupled with TLR9 ligands, in which the surface of each VLP was loaded with one of the Germline or mutated CTL epitopes of B16F10 were also investigated as a potential therapy with positive results. In vaccinated C57BL/6 mice with a mixture of both types of VLP the population of CD8 + T cells specific for the B16F10 murine melanoma significantly increased and tumor progression was inhibited leading to increased survival of the mice. All three types of VLPs were able to provide a degree of protection but the mixture of the two provided significant protection and prevented the progression and invasion of B16f10 cells changed the tumor microenvironment by increasing Ly6G+ granulocytic cells and decreasing Ly6C+ monocytic population [207]. These results indicate that activation of a CD8 + T cell mediated immune response is essential for vaccine efficacy in cancer prevention. In a study to analyze the importance of adjuvant size in stimulating T cell immunity and to evaluate the immune response in a mice model of melanoma a VLP-based platform derived from CMV and incorporating tetanus toxoid epitope TT830–843 (CMVTT-VLP) was established. The p33 peptide epitopes as a model antigen, derived from Lymphocytic choriomeningitis virus, was displayed on the particle surface and the CuMVTT-p33 VLP vaccine was formulated with micron-sized microcrystalline tyrosine (MCT) adjuvant. Comparison of the results with commercial adjuvants, Alum and B type CpGs showed that the micron-sized adjuvant stimulated CD8 + T cell immunity as much as CpG but more potent than Alum. The VLP-based vaccine showed notable antitumor effects against the B16F10 murine tumor cells [208]. VLP-based vaccines for cancer prevention have opened a new era in vaccine research, and although the results so far look promising, more research is needed to reach a definitive conclusion about the effectiveness of these vaccines. The summary of the VLP-based vaccines against different cancers are listed in Table 2.


Fondo

Shigella is the causative agent of shigellosis, a severe acute gastrointestinal infection that frequently presents as bloody diarrhea, fever, and severe abdominal pain [1]. In 2016, Shigella was estimated to cause > 250 million cases and > 200,000 deaths globally [2]. Higher income countries experience Shigella infections among travelers, aging populations, deployed military personnel, and men who have sex with men (MSM) [2, 3]. However, the preponderance of the Shigella disease burden is in children aged under 5 years residing in low-middle income countries (LMICs). Infection in this vulnerable group can also result in significant long-term consequences such as severe stunting and impaired cognitive development [2, 4]. The global epidemiology of Shigella is worsened by the emergence and spread of multi- and extensively drug resistant (MDR and XDR) variants, making infections increasingly difficult to treat [5]. The principal method of Shigella prevention has been improvements in water, sanitation, and hygiene (WASH) [6]. However, due to the low infectious dose, the standard of WASH required to break transmission is difficult to attain in many LMICs [7]. Furthermore, recent application of molecular techniques to identify Shigella infections found a severe underestimation of the global Shigella burden [8, 9], highlighting the need for new low-cost prevention techniques.

There is currently no licensed vaccine against Shigella [10]. However, studies in animals and controlled human infection models (CHIMs) have shown that protection through immunization is feasible [11, 12]. Natural disease epidemiology in humans and non-human primate infection studies show complete protection from re-infection with a homologous Shigella especies. Long-term homologous protection has been attributed to serotype-specific systemic (serum IgG) and mucosal (IgA) antibody responses [12, 13]. The most immunodominant target of the Shigella IgG and IgA response is the O-antigen component of lipopolysaccharide (LPS) [14, 15]. LPS/O-antigen-specific antibodies elicit protection through antibody-mediated opsonization, phagocytosis, and intracellular cytotoxicity [13]. However, antibodies against Shigella O-antigen are highly specific for the infecting species only [11, 13], and do not provide protection against heterologous Shigella especies. Desde el Shigella genus consists of four species and > 50 serotypes, a lack of cross-protection against heterologous species and serotypes poses a major challenge for vaccine development [16]. This challenge may be overcome by a vaccine that elicits either a broadly reactive immune response or numerous species-specific responses against the globally dominant Shigella species (i.e., S. flexneri y S. sonnei) [17].

The primary strategy of developing an efficacious Shigella vaccine has been to elicit antibody responses targeting Shigella O-antigen [10]. Live-attenuated vaccines with genetically attenuated Shigella [18,19,20], or the expression of Shigella O-antigen on live-attenuated vectors [21], have been shown to induce good antibody responses against O-antigen. Multivalent killed-vaccines also induce high titers of serum IgG and mucosal IgA targeting Shigella O-antigens and have shown protection in early clinical development [22, 23]. Recombinant forms of Shigella O-antigen have also been pursued as vaccine candidates [10], with a Shigella O-antigen conjugated to a carrier protein [24,25,26], which engages T cell help and produces a longer lasting antibody response to the polysaccharide antigen [27]. Various immunogenic proteins, such as the toxins from other pathogens, have been used as carrier proteins [28, 29]. However, protein antigens from Shigella have not been evaluated as a carrier protein for Shigella O-antigen.

Whole genome sequencing provided the ability to predict and derive novel antigens for use as vaccines, and this approach ultimately gave rise to the meningococcal B vaccine [30,31,32]. Further technological advances in immunology and protein engineering to study the interaction of pathogens with the immune system can aid in reverse engineering of protective immunogens [33,34,35]. Here, we aimed to identify novel immunogenic Shigella antigens that could serve as Shigella vaccine candidates, either alone, or when conjugated to Shigella O-antigen. Therefore, we conducted immunogen prediction using bioinformatic analysis, then created a protein microarray of predicted immunogenic Shigella antigens. These expressed antigens were screened for immunogenicity using polyclonal antibodies from patients who recovered from confirmed Shigella infections, to identify a novel set of proteins which may facilitate the development of novel Shigella vaccines.


Example 8

The following fusion proteins are generated PE313-NES-antigen-K, PE1-252-PE268-313-NES-antigen-K, PE1-252-PE280-313-NES-antigen-K. In addition, the fragment of PE domain Ia (PE1-252) of the fusion protein PE313-antigen-NESK is replaced by RAP1 domain 3 (SEQ ID NO: 8). A2M minimum (SEQ ID NO: 9), HIV-Tat minimum (SEQ ID NO: 10) or HSPs minimum (SEQ ID NO: 11) to generate the fusion proteins RAP1 domain 3-PE253-313-antigen-NESK, A2M-PE253-313-antigen-NESK, Tat-PE253-313-antigen-NESK and HSP-PE253-313-antigen-NESK, RAP1 domain 3-PE268-313-antigen-NESK, A2M-PE268-313-antigen-NESK, Tat-PE268-313-antigen-NESK and HSP-PE268-313-antigen-NESK vaccines, RAP1 domain 3-PE280-313-antigen-NESK, A2M-PE280-313-antigen-NESK, Tat-PE280-313-antigen-NESK and HSP-PE280-313-antigen-NESK, respectively. RAP1 domain 3-PE253-313-NES-antigen-K, A2M-PE253-313-NES-antigen-K, Tat-PE253-313-NES-antigen-K and HSP-PE253-313-NES-antigen-K, RAP1 domain 3-PE268-313-NES-antigen-K. A2M-PE268-313-NES-antigen-K, Tat-PE268-313-NES-antigen-K and HSP-PE268-313-NES-antigen-K vaccines, RAP1 domain 3-PE280-313-NES-antigen-K. A2M-PE280-313-NES-antigen-K, Tat-PE280-313-NES-antigen-K and HSP-PE280-313-NES-antigen-K. The cell mediated immune responses enhanced by these vaccines are examined using similar methods as described above.

Table 1 shows SEQ ID NOs. of peptides used for making various fusion proteins.

In summary, the results have proved that a fusion protein containing an APC-binding domain at the N-terminal end, a translocation domain, followed by an antigen of a pathogen, and then a fusion peptide of NESK at the carboxyl terminal end is an improved design over the PE-fusion protein that is without the fusion peptide of NESK at the carboxyl terminus in terms of enhancing cell-mediated immune response, suppressing tumor growth, and/or increasing the percentage of tumor-free animals.

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