Información

¿El número de pares de bases entre el final de un gen y el comienzo del siguiente gen tiene que ser múltiplo de 3?

¿El número de pares de bases entre el final de un gen y el comienzo del siguiente gen tiene que ser múltiplo de 3?

We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ib KD ri SO eo Hm fq gU AT Fy cJ mw wt nE py

Estoy trabajando en un proyecto para un curso de Coursera en el que necesito escanear una cadena de pares de bases e identificar posibles genes, pero hay algo sobre el ADN real que necesito saber para diseñar el algoritmo correctamente. Mi pregunta se ilustra mejor con un ejemplo.

Supongamos que tenemos una hebra de ADN como esta: ATGxxxyyyzzzTAAqqATGrsssATGuuTAAvpppTAG

Las letras minúsculas solo representan pares de bases generales que no están en las secuencias "ATG", "TAA", "TAG" o "TGA".

"ATGxxxyyyzzzTAA" constituye un gen para los propósitos de la asignación, y mi programa identifica correctamente esa cadena de pares de bases como un gen. Lo que quiero saber se centra en lo que sucede después de que se encuentra ese primer gen. Consideremos la última parte de la cadena:

"qqATGrsssATGuuTAAvpppTAG"

Mi programa actual de búsqueda de genes identificaría "ATGrsssATGuuTAA" como un gen, pero observe que esta hebra comienza después de que sólo se hayan buscado dos pares de bases ("qq"). ¿Eso importa? Es decir, ¿sucedería esto en el ADN real o debería identificarse el segundo gen válido como "ATGuuTAAvpppTAG"?


Absolutamente hay no una regla que dice que todos los genes de una hebra deben estar en el mismo marco.

Su programa está buscando ORF (marcos de lectura abiertos) y debería identificarlos a todos, en cada marco. Si estaba siendo muy minucioso, debería generar el complemento inverso de su secuencia y buscarlo también para los ORF. Pero supongo que si le dieron esta secuencia, presumiblemente el profesor le dio la secuencia en la orientación deseada.


R vs Python: una comparación uno a uno

Soy un ávido usuario de R y rara vez utilizo cualquier otra cosa para el análisis de datos y visualizaciones. Pero aunque R es mi opción, en algunos casos, Python podría ser una mejor alternativa.

Por eso quería ver cómo les va a R y Python en una comparación uno a uno de un análisis que sea representativo de lo que normalmente trabajaría.

Conclusiones

Con todo, el código Python se podía traducir fácilmente a R y era comparable en longitud y simplicidad entre los dos idiomas. Si bien la sintaxis de Python es inherentemente más limpia / ordenada, podemos usar paquetes que implementan la tubería en R y logran resultados similares (aunque la sintaxis separada por puntos de Python es mucho más fácil de escribir que usar el operador de tubería de magrittr). Para el trazado y la visualización, sigo pensando que el ggplot2 de R es el mejor en sintaxis, personalización y resultado (es cierto que no conozco ni matplotlib ni ggplot). En términos de funcionalidad, no pude encontrar grandes diferencias entre los dos idiomas y diría que ambos tienen sus méritos. Para mí, R es más natural ya que eso es en lo que soy más fluido, pero puedo ver por qué Python también tiene un atractivo y creo que haré un mayor esfuerzo para usar ambos lenguajes en mis proyectos futuros.


Secuencia de ADN del bacteriófago T3 desde el gen 2.5 hasta el gen 9 ☆

Se ha determinado la secuencia de nucleótidos del ADN del bacteriófago T3, desde el gen 2.5 hasta el gen 9. Además de los sitios reguladores, la secuencia predice 19 genes empaquetados más dos genes que se superponen, en un marco de lectura diferente, a otro gen. La mayoría de estos genes son muy homólogos a los de la región correspondiente del bacteriófago T7. Sin embargo, hay algunos genes que están presentes en un fago, pero no en el otro. Estas deleciones aparentes son casi exactamente del tamaño de un gen y, por lo tanto, la organización de genes compactos sigue siendo la misma en T3 que en T7. Los niveles variables de homología entre los ADN de T3 y T7, señalados por primera vez por Davis y Hyman en su estudio de los heterodúplex de ADN, también se demuestran aquí mediante una comparación de las secuencias de nucleótidos de T3 y T7. Muchas regiones de homología extremadamente alta lindan inmediatamente con secuencias que no tienen homología aparente. Estos datos sugieren que los bacteriófagos T3 y T7 se han recombinado, tanto entre sí como con otros miembros de un grupo de fagos similares a T7, durante su coevolución.


Examinar el manual

Detectar y refinar Fusion Genes encuentra genes de fusión en un proceso de dos pasos. El paso de detección identifica fusiones potenciales y el paso de refinamiento acumula y evalúa la evidencia de cada fusión. Brevemente, el paso de detección funciona al volver a mapear los extremos no alineados de las lecturas y determinar si estos son consistentes con una fusión. Las fusiones se identifican a partir de lecturas que deben tener un extremo no alineado cerca de un límite de exón que se puede reasignar cerca de otro límite de exón. Si se ha habilitado la opción para Detectar fusiones con límites de exón nuevos, la herramienta también considera lecturas que están lejos de un límite de exón y / o cuyos extremos no alineados pueden mapearse lejos de un límite de exón en una segunda pasada.

El paso de refinamiento toma las fusiones identificadas en el paso de detección y vuelve a contar el número de lecturas de cruce de fusión, así como las lecturas de soporte de tipo salvaje utilizando un mapeo de RNA-Seq contra el tipo salvaje y las referencias de fusión. La referencia de fusión es una secuencia de referencia artificial que "asume" las fusiones detectadas generando nuevos cromosomas correspondientes a cada fusión además de los cromosomas originales (figura 7.13).


Figura 7. 13: Se crea un cromosoma artificial que consiste en la vecindad de ambos extremos de la fusión.

Todas las lecturas se reasignan a la referencia artificial, con la expectativa de que las lecturas que se usaron para detectar la fusión ahora se asignen a la transcripción de la fusión con una lectura empalmada. Además, algunas lecturas que originalmente no se asignaron en absoluto ahora se asignarán a la secuencia de referencia artificial, lo que aumentará la evidencia del evento de fusión. Luego, la herramienta calcula la puntuación Z y el valor p mediante una prueba binomial.

La herramienta Detectar y perfeccionar genes de fusión se puede encontrar en la Caja de herramientas en:

Herramientas Herramientas expertas del panel QIAseq () | Herramientas expertas del panel QIAseq RNAscan () | Detectar y refinar genes de fusión ()

La herramienta Detectar y perfeccionar genes de fusión toma una lista de secuencias () como entrada (figura 7.14).


Figura 7. 14: Seleccionar secuencias.

En el siguiente cuadro de diálogo de la figura 7.15, especifique la pista de lecturas que contiene un mapeo de lectura de RNA-seq, así como pistas de secuencia de referencia, genes y mRNA de la carpeta CLC_References del Área de navegación. Es posible, pero opcional, agregar un CDS o una pista de cebador para ejecutar el análisis.


Figura 7. 15: Especifique lecturas de pista, referencias y parámetros para la detección.

    Número máximo de fusiones: el número máximo de fusiones putativas que se evaluarán. Múltiples puntos de corte de fusión posibles diferentes entre los mismos dos genes cuentan como 1 fusión.

El aumento de este parámetro cuenta lecturas que están más lejos de un límite de exón conocido como si se fusionaran en el límite, lo que aumenta la señal para la fusión. Sin embargo, aumentar el parámetro también disminuye la resolución a la que se puede detectar una fusión: por ejemplo, si "distancia máxima al límite del exón conocido = 10", entonces no se distinguirán dos transcripciones con límites de exón separados por 9nt, y la herramienta solo producirá transcripciones de fusión artificial para uno de ellos, lo que puede reducir el número de lecturas de mapeo en el paso de refinamiento.


Figura 7. 16: especifique los parámetros para el refinamiento.

    Número mínimo de lecturas complementarias: número mínimo de lecturas que deben admitir una fusión. Las fusiones con menos lecturas complementarias obtendrán una anotación de filtro correspondiente.

  1. Fusion Genes (WT): la pista Fusion Genes contiene los puntos de interrupción de todas las fusiones detectadas. La pista se describe con más detalles a continuación, consulte 7.4.1.
  2. Lecturas (WT): una asignación de lectura al genoma de WT. Las lecturas se asignan a una combinación del genoma WT y los cromosomas de fusión artificiales. Las lecturas que se asignan mejor a los cromosomas de fusión artificiales estarán en la salida de lecturas (fusiones).
  3. Extremos no alineados: un mapeo de lectura que muestra dónde se asignan los extremos alineados al genoma de referencia. La pista de extremos no alineados es útil al elegir cómo configurar los parámetros "Recuento mínimo de lectura de extremos no alineados", "Longitud mínima de la secuencia no alineada" y "Distancia máxima al límite del exón" para un panel en particular y un protocolo de secuenciación para encontrar fusiones conocidas. , ya que muestra qué extremos no alineados de lecturas se consideraron y dónde se asignaron.
  4. Fusion Genes (fusiones): puntos de interrupción para las fusiones detectadas en la referencia artificial.
  5. Lecturas (fusiones): un mapeo de lectura de los cromosomas de fusión artificiales. Las lecturas se asignan a una combinación del genoma WT y los cromosomas de fusión artificiales. Las lecturas que se asignan mejor al genoma de WT estarán en la salida de lecturas (WT).
  6. Secuencia de referencia (fusiones): Secuencia de referencia para la referencia artificial.
  7. ARNm (fusiones): transcripciones de ARNm correspondientes a las fusiones detectadas en la referencia artificial.
  8. Genes (fusiones): región del gen para el producto del gen fusionado en la referencia artificial.
  9. CDS (fusiones): si se proporcionó la pista CDS, esta pista contiene la región CDS para el producto del gen fusionado en la referencia artificial.
  10. Cebadores (fusiones): si se proporcionó una pista de cebador, esta pista contiene las regiones de cebador en la referencia artificial. Tenga en cuenta que aquí solo se representarán los cebadores de genes implicados en una fusión detectada, y que el mismo cebador puede estar en varios cromosomas de fusión, si el mismo gen está implicado en múltiples fusiones.
  11. Informe: informe que contiene representaciones gráficas de las fusiones que pasan todos los filtros. El informe se describe con más detalle a continuación, consulte 7.4.1.

Pistas de fusión

  • Cromosoma. Cromosoma donde se encuentran "Gene" y "Transcript".
  • Región. Posición del punto de corte del evento de fusión con respecto a la secuencia de referencia hg38.
  • Nombre. Nombre corto del evento de fusión, gen 5 'gen-3'.
  • Número de fusión. Números filas que describen fusiones entre los mismos dos genes.
  • Par de fusión. Números pares de puntos de corte de fusión para un número de fusión dado.
  • Gen 5 'o 3'. El gen de fusión que corresponde a los campos "Cromosoma" y "Región".
  • Tipo de punto de interrupción. 3 'o 5'.
  • Lecturas de Fusion Crossing. Número de lecturas que cruzan el límite de fusión.
  • Cobertura de lectura de 5 'o 3'. Número de lecturas (pares y extremos no alineados) que cubren el punto de interrupción de la transcripción 5 'o 3', incluidas las transcripciones normales y las transcripciones de fusión.
  • Puntuación Z Convertido del valor P utilizando la función de distribución inversa para una distribución gaussiana estándar.
  • Valor p. Una medida de certeza de la llamada calculada mediante una prueba binomial, se calcula como la probabilidad de que una observación que indique un evento de fusión ocurra por casualidad cuando no hay fusión. Cuanto más cercano esté el valor a 0, más segura será la llamada. Aunque se debe evitar interpretar estrictamente el valor p como la tasa de verdaderos falsos positivos, los datos de nuestra prueba muestran que el valor p parece estar calibrado apropiadamente usando la configuración de parámetros estándar.
  • Filtrar. Contiene los nombres de los filtros aplicables a la fusión, o el valor "PASS" si pasó todos los filtros.
  • Nombre de la translocación. Descripción de la fusión en formato COSMIC (http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/help/fusion/summary) utilizando la transcripción preferida.
  • Salto de exón. Si la fusión es una fusión del mismo gen donde el punto de ruptura 5 'está aguas arriba del punto de ruptura 3'.
  • Fusión con límites de exones novedosos. Indica si uno o ambos puntos de corte de fusión se encuentran en un límite de exón nuevo.
  • Encontrado CDS en cuadro. Esta columna está presente cuando se especificó una pista CDS como entrada. Contiene "Sí" si se ha encontrado al menos un CDS de fusión que permanece en el marco a través de los puntos de corte de fusión. Tenga en cuenta que el cálculo en el marco solo tiene en cuenta el marco del último exón incluido en el gen 5 'y el primer exón incluido en el gen 3', e ignora factores más complejos que podrían afectar el marco, como mutaciones de cambio de marco o stop codones debido a variantes alrededor de los puntos de corte de fusión.
  • Transcripciones compatibles. Todas las transcripciones conocidas con las que se lee la fusión son compatibles. Las transcripciones son "compatibles" con las lecturas de fusión si incluyen el límite del exón en el que se produce la fusión. Si no hay transcripciones compatibles conocidas, se incluirá una transcripción artificial con un nombre como "10-gene27693-32015547-BEGINNING-0". Esto muestra que la transcripción se creó para el gen27693 en el cromosoma 10, modificando el comienzo de un exón, para describir un punto de interrupción en la posición 32015547 (el "0" final es solo un contador).
  • Cromosoma original. (solo en pistas basadas en una referencia de fusión)
  • Región de punto de interrupción original. (solo en pistas basadas en una referencia de fusión)
  • Fusión conocida. Indica el número de identificación de Fusion de la fusión coincidente en la base de datos de fusión conocida. Si la fusión no se encuentra en la base de datos, se informa -1. De forma predeterminada, la herramienta utiliza una base de datos de fusiones conocida de QIAGEN, pero puede reemplazar esta base de datos con otra base de datos de fusiones conocida relevante para su ensayo. Tenga en cuenta que esta base de datos no se utiliza para detectar las fusiones, sino solo para anotar la salida de fusiones identificadas de Detectar y refinar los genes de fusión antes del refinamiento.
  • Gráfico de fusión. Contiene un enlace a un diagrama de fusión QIMERA. Haga clic en el enlace para abrir la trama.

Informe Detectar y perfeccionar genes de fusión

En el cuadro de diálogo Manejo de resultados, es posible elegir generar un informe que contenga información de muestras y extremos no alineados, así como información detallada y gráficos para todas las fusiones que pasan los filtros (figura 7.17):

El informe tiene tres secciones: "Resumen", "Extremos no alineados" y "Fusiones". La sección de resumen tiene una tabla con el nombre de la muestra. La sección de extremos no alineados contiene una tabla con estadísticas sobre los extremos no alineados que se utilizan para detectar fusiones, la tabla tiene la siguiente información:

  • Extremos no alineados: número de extremos no alineados encontrados.
  • Extremos no alineados mapeados: número de extremos no alineados que podrían mapearse
  • Extremos no alineados sin asignar: número de extremos sin alinear que no se pudieron asignar.
  • Puntos de corte de base descartados: cuando dos transcripciones del mismo gen se superponen de modo que dos puntos de corte se encuentran uno al lado del otro, uno de ellos se descartará.


Figura 7. 17: Sección de extremos no alineados en el informe Detectar y refinar fusiones.

La sección Fusion enumera todas las fusiones con FILTER = PASS. Cada gen de fusión se describe mediante dos tablas y un gráfico de fusión (figura 7.18).


Figura 7. 18: Una sección de informe para un gen de fusión.

La primera tabla contiene una descripción general de la fusión más compatible para el gen de fusión. Los valores de esta tabla incluyen:

  • Transcripción reportada 5 '/ 3' - la transcripción reportada es la transcripción de mayor prioridad que es compatible con esta fusión
  • Nombre de la translocación: descripción HGVS de la fusión con las transcripciones informadas
  • Lecturas de cruce de fusión: el número de lecturas que se empalman desde el exón 5 'hasta el exón 3'
  • Cobertura de lectura de 5 '/ 3': el número total de lecturas que se empalman en el exón de 5 '/ 3'. Por lo tanto, este número es siempre al menos tan alto como las lecturas de cruce de fusión.

La segunda tabla enumera los valores de todos los puntos de corte de fusión admitidos en el gen de fusión, ordenados por recuento de lecturas. Por lo tanto, la primera fila de la tabla recapitula algunos de los valores de la primera tabla. Las filas adicionales muestran evidencia de otras fusiones entre los mismos dos genes. Se muestran como máximo 10 filas.


Genes

Los seres humanos tienen alrededor de 20.000 a 23.000 genes.

Los genes consisten en ácido desoxirribonucleico (ADN). El ADN contiene el código o plano que se utiliza para sintetizar una proteína. Los genes varían en tamaño, dependiendo de los tamaños de las proteínas que codifican. Cada molécula de ADN es una doble hélice larga que se asemeja a una escalera de caracol que contiene millones de escalones. Los escalones de la escalera constan de pares de cuatro tipos de moléculas llamadas bases (nucleótidos). En cada paso, la base adenina (A) se empareja con la base timina (T), o la base guanina (G) se empareja con la base citosina (C). Cada molécula de ADN extremadamente larga está enrollada dentro de uno de los cromosomas.

Estructura del ADN

El ADN (ácido desoxirribonucleico) es el material genético de la célula, contenido en los cromosomas dentro del núcleo celular y las mitocondrias.

A excepción de ciertas células (por ejemplo, espermatozoides y óvulos y glóbulos rojos), el núcleo celular contiene 23 pares de cromosomas. Un cromosoma contiene muchos genes. Un gen es un segmento de ADN que proporciona el código para construir proteínas.

La molécula de ADN es una doble hélice larga y enrollada que se asemeja a una escalera de caracol. En él, dos hebras, compuestas por moléculas de azúcar (desoxirribosa) y fosfato, están conectadas por pares de cuatro moléculas llamadas bases, que forman los escalones de la escalera. En los pasos, la adenina se combina con timina y guanina con citosina. Cada par de bases se mantiene unida por un enlace de hidrógeno. Un gen consta de una secuencia de bases. Las secuencias de tres bases codifican un aminoácido (los aminoácidos son los componentes básicos de las proteínas) u otra información.

Sintetizar proteínas

Las proteínas están compuestas por una larga cadena de aminoácidos unidos uno tras otro. Hay 20 aminoácidos diferentes que se pueden usar en la síntesis de proteínas; algunos deben provenir de la dieta (aminoácidos esenciales) y otros son producidos por enzimas en el cuerpo. A medida que se forma una cadena de aminoácidos, se pliega sobre sí misma para crear una estructura tridimensional compleja. Es la forma de la estructura plegada la que determina su función en el cuerpo. Debido a que el plegamiento está determinado por la secuencia precisa de aminoácidos, cada secuencia diferente da como resultado una proteína diferente. Algunas proteínas (como la hemoglobina) contienen varias cadenas plegadas diferentes. Las instrucciones para sintetizar proteínas están codificadas dentro del ADN.

Codificación

La información se codifica dentro del ADN por la secuencia en la que se ordenan las bases (A, T, G y C). El código está escrito en tripletes. Es decir, las bases están dispuestas en grupos de tres. Las secuencias particulares de tres bases en el ADN codifican instrucciones específicas, como la adición de un aminoácido a una cadena. Por ejemplo, GCT (guanina, citosina, timina) codifica la adición del aminoácido alanina y GTT (guanina, timina, timina) codifica la adición del aminoácido valina. Por tanto, la secuencia de aminoácidos en una proteína está determinada por el orden de pares de bases tripletes en el gen para esa proteína en la molécula de ADN. El proceso de convertir información genética codificada en una proteína implica transcripción y traducción.

Transcripción y traducción

Transcripción es el proceso por el cual la información codificada en el ADN se transfiere (transcribe) al ácido ribonucleico (ARN). El ARN es una cadena larga de bases como una hebra de ADN, excepto que la base uracilo (U) reemplaza a la base timina (T). Por lo tanto, el ARN contiene información codificada en tripletes al igual que el ADN.

Cuando se inicia la transcripción, parte de la doble hélice del ADN se abre y se desenrolla. Una de las hebras de ADN desenrolladas actúa como plantilla contra la que se forma una hebra complementaria de ARN. La hebra complementaria de ARN se llama ARN mensajero (ARNm). El ARNm se separa del ADN, abandona el núcleo y viaja hacia el citoplasma celular (la parte de la célula fuera del núcleo; consulte la Figura: Dentro de una célula). Allí, el ARNm se adhiere a un ribosoma, que es una estructura diminuta en la célula donde se produce la síntesis de proteínas.

Con traducción, el código del ARNm (del ADN) le dice al ribosoma el orden y el tipo de aminoácidos que deben unirse. Los aminoácidos llegan al ribosoma mediante un tipo de ARN mucho más pequeño llamado ARN de transferencia (ARNt). Cada molécula de ARNt aporta un aminoácido que se incorpora a la cadena creciente de proteínas, que se pliega en una estructura tridimensional compleja bajo la influencia de moléculas cercanas llamadas moléculas chaperonas.

Control de la expresión génica

Hay muchos tipos de células en el cuerpo de una persona, como las células del corazón, las células del hígado y las células musculares. Estas células se ven y actúan de manera diferente y producen sustancias químicas muy diferentes. Sin embargo, cada célula es descendiente de un único óvulo fertilizado y, como tal, contiene esencialmente el mismo ADN. Las células adquieren apariencias y funciones muy diferentes porque diferentes genes se expresan en diferentes células (y en diferentes momentos en la misma célula). La información sobre cuándo debe expresarse un gen también está codificada en el ADN. La expresión genética depende del tipo de tejido, la edad de la persona, la presencia de señales químicas específicas y muchos otros factores y mecanismos. El conocimiento de estos otros factores y mecanismos que controlan la expresión génica está creciendo rápidamente, pero muchos de estos factores y mecanismos aún no se conocen bien.

Los mecanismos mediante los cuales los genes se controlan entre sí son muy complicados. Los genes tienen marcadores químicos para indicar dónde debe comenzar y terminar la transcripción. Varias sustancias químicas (como las histonas) dentro y alrededor del ADN bloquean o permiten la transcripción. Además, una cadena de ARN llamada ARN antisentido puede emparejarse con una cadena complementaria de ARNm y bloquear la traducción.

Replicación

Las células se reproducen dividiéndose en dos. Debido a que cada nueva célula requiere un conjunto completo de moléculas de ADN, las moléculas de ADN de la célula original deben reproducirse (replicarse) durante la división celular. La replicación ocurre de manera similar a la transcripción, excepto que toda la molécula de ADN de doble hebra se desenrolla y se divide en dos. Después de dividirse, las bases de cada hebra se unen a bases complementarias (A con T y G con C) que flotan cerca. Cuando se completa este proceso, existen dos moléculas de ADN de doble cadena idénticas.

Mutación

Para evitar errores durante la replicación, las células tienen una función de "corrección de pruebas" para ayudar a garantizar que las bases se emparejen correctamente. También existen mecanismos químicos para reparar el ADN que no se copió correctamente. Sin embargo, debido a los miles de millones de pares de bases involucrados y la complejidad del proceso de síntesis de proteínas, pueden ocurrir errores. Tales errores pueden ocurrir por numerosas razones (incluida la exposición a radiación, medicamentos o virus) o sin razón aparente. Las variaciones menores en el ADN son muy comunes y ocurren en la mayoría de las personas. La mayoría de las variaciones no afectan a las copias posteriores del gen. Los errores que se duplican en copias posteriores se denominan mutaciones.

Mutaciones heredadas son los que pueden transmitirse a la descendencia. Las mutaciones se pueden heredar solo cuando afectan las células reproductoras (espermatozoides u óvulos). Las mutaciones que no afectan a las células reproductoras afectan a los descendientes de la célula mutada (por ejemplo, convirtiéndose en cáncer) pero no se transmiten a la descendencia.

Las mutaciones pueden ser exclusivas de un individuo o una familia, y la mayoría de las mutaciones dañinas son raras. Las mutaciones que se vuelven tan comunes que afectan a más del 1% de la población se denominan polimorfismos (por ejemplo, los tipos de sangre humana A, B, AB y O). La mayoría de los polimorfismos tienen poco o ningún efecto sobre el fenotipo (el real estructura y función del cuerpo de una persona).

Las mutaciones pueden involucrar segmentos pequeños o grandes de ADN. Dependiendo de su tamaño y ubicación, la mutación puede no tener un efecto aparente o puede alterar la secuencia de aminoácidos en una proteína o disminuir la cantidad de proteína producida. Si la proteína tiene una secuencia de aminoácidos diferente, puede funcionar de manera diferente o no funcionar en absoluto. Una proteína ausente o que no funciona es a menudo dañina o fatal. Por ejemplo, en la fenilcetonuria, una mutación da como resultado la deficiencia o ausencia de la enzima fenilalanina hidroxilasa. Esta deficiencia permite que el aminoácido fenilalanina (absorbido de la dieta) se acumule en el cuerpo, causando en última instancia una discapacidad intelectual grave. En casos raros, una mutación introduce un cambio que es ventajoso. Por ejemplo, en el caso del gen de células falciformes, cuando una persona hereda dos copias del gen anormal, la persona desarrollará la enfermedad de células falciformes. Sin embargo, cuando una persona hereda solo una copia del gen de las células falciformes (llamado portador), la persona desarrolla cierta protección contra la malaria (una infección de la sangre). Aunque la protección contra la malaria puede ayudar a sobrevivir a un portador, la enfermedad de células falciformes (en una persona que tiene dos copias del gen) causa síntomas y complicaciones que pueden acortar la vida útil.

Seleccion natural se refiere al concepto de que las mutaciones que perjudican la supervivencia en un entorno determinado tienen menos probabilidades de transmitirse a la descendencia (y, por lo tanto, se vuelven menos comunes en la población), mientras que las mutaciones que mejoran la supervivencia progresivamente se vuelven más comunes. Por lo tanto, las mutaciones beneficiosas, aunque inicialmente raras, eventualmente se vuelven comunes. Los cambios lentos que ocurren a lo largo del tiempo causados ​​por mutaciones y selección natural en una población que se cruza colectivamente se denominan evolución.


Visión general

In-Fusion Snap Assembly es una tecnología de clonación simple pero elegante que se ha optimizado para brindarle una precisión excepcionalmente alta, lo que garantiza el éxito de la clonación y le ahorra tiempo y molestias.

  • La subclonación es innecesaria: clone cualquier inserto directamente en su vector final, independientemente de su lugar de clonación
  • Altamente eficiente: más del 95% de eficiencia demostrada con una amplia gama de tamaños de fragmentos, de 0,5 kb a 34 kb *
  • Construcción sin costuras: las construcciones finales no tienen pares de bases adicionales sobrantes (como suele ser el caso con la digestión de restricción o la clonación de TA)
  • Diseño experimental flexible: clonar fragmentos de ADN únicos o múltiples simultáneamente, con una sola reacción
  • Mutagénesis dirigida al sitio:haga clic aquí para aprender cómo esta tecnología optimizada se puede aplicar a inserciones, eliminaciones o sustituciones

* Cuando se utiliza con las células Stellar Competent Cells, la polimerasa PrimeSTAR Max y el gel NucleoSpin y el kit de limpieza de PCR incluidos.


Genética Cap. 18

A. son la fuente de variabilidad genética para las poblaciones.

B. permiten a los genetistas investigar la función de los genes.

C. se producen para permitir la adaptación.

D. intergénico versus intragénico.

B. una mutación de sustitución.

A. involucrado con trastornos genéticos como el síndrome de X frágil.

B. explicaciones razonables del fenómeno de la anticipación.

D. variable en tamaño de la repetición.

A. usando cepas bacterianas que tenían una mutación que bloquea la biosíntesis de histidina.

B. exponer las bacterias a diversas concentraciones de mutágenos potenciales.

C. rastrear el número de células que mutaron para sintetizar histidina.

A. interrumpir un gen cuando se inserta en él.

B. facilitar la recombinación entre transposones, produciendo mutaciones cromosómicas.

C. produciendo roturas bicatenarias durante la escisión, lo que da lugar a mutaciones cromosómicas.

D. Activar genes con su propio promotor, desregularlos.

A. la atenuación de la transcripción de la transposasa.

B. el uso de metilación para silenciar el transposón.

C. bloqueo de la traducción de la transposasa.

D. el uso de piRNA para bloquear la transposasa de transcripción.

A. Alu, que es exclusivo de Homo sapiens y Pan troglodytes (chimpancé).

B. Ac y Ds, cuyo descubrimiento le valió a Barbara McClintock un premio Nobel.

C. LÍNEAS (elementos largos intercalados), que constituyen el 21% del genoma.

D. Elementos P, que son responsables de la disgenesia híbrida.

A. reparación de desajustes de ADN recién sintetizado

B. reparación por escisión de la base, que elimina el uracilo cuando se produce por desaminación de citosina

C. reparación por escisión de nucleótidos, que elimina secciones distorsionadas de ADN

D. fotoliasa, que repara los dímeros de pirimidina que distorsionan el ADN

A. qué ADN polimerasa se utiliza.

B. cómo se identifica la mutación.

C. la precisión del mecanismo de reparación.

C. aumento de las tasas de transposición.

D. cáncer de colon hereditario.

B. Las respuestas A y D son correctas.

D. Las respuestas A y D son correctas.

B. mutación supresora intergénica.

A. Se produce una mutación en un gen diferente al de la mutación original, y esto conduce a una interacción funcional de las dos proteínas elaboradas a partir de estos dos genes.

B. Una mutación de cambio de marco de deleción es suprimida por una segunda mutación de cambio de marco que es una inserción que restaura el marco de lectura.

C. Ninguna de las anteriores es correcta.

D. Se produce una mutación en un gen de ARNt y suprime los efectos de la mutación original.

A. Emparejamiento incorrecto con bases normales

B. Depurinación de guaninas

C. Desaminación de citosina que conduce a uracilo

D. Intercalación entre bases adyacentes en el ADN

B. Las respuestas B y D son correctas.

B. Ninguno de los anteriores es correcto.

R. Ninguno de los anteriores es correcto.

R. Primero se transcribe en ARN, luego una transcriptasa inversa produce una copia de ADN y finalmente el ADN se integra en un nuevo sitio.

B. Primero hace una copia de ADN de sí mismo, que luego se transcribe en ARN, y finalmente el ARN se integra en el genoma.

C. Primero produce transposasa, que luego une las repeticiones invertidas y permite que se elimine de su ubicación original e integre en el genoma en un nuevo sitio.

D. Ninguna de las anteriores es correcta.

La variedad se produce porque un elemento Ac dirige diferentes niveles de transcripción de los elementos Ds insertados en el gen del pigmento, creando células con cantidades variables de pigmento.

B. La variedad ocurre porque durante el desarrollo del grano, un elemento Ac o Ds se transpone al gen del pigmento en momentos aleatorios en múltiples células, creando células y sectores incoloros.

C. Ds hace que un Ac inactivo se transponga desde su sitio cercano a un gen de pigmento a un sitio dentro del gen, lo que hace que el gen esté inactivo, lo que da como resultado sectores incoloros en un grano de otro modo coloreado.

D. La variedad se produce porque durante el desarrollo del grano, un elemento Ac o Ds se transpone fuera del gen del pigmento en momentos aleatorios creando sectores pigmentados dentro de las células.

A. Porque todos se originaron como virus que asumieron una existencia parasitaria dentro de las células huésped infectadas.

B. Porque pueden replicarse o eliminarse para formar virus, que son parásitos celulares.

C.Porque fueron transferidos horizontalmente de los genomas de los parásitos.

D. Porque parecen existir solo para replicarse y diseminarse a expensas del genoma del hospedador

A. Las respuestas A y B son correctas.

B. reparación por escisión de nucleótidos.

A. está libre de errores, mientras que la recombinación homóloga es propensa a errores.

B. ocurre durante la etapa G2 del ciclo celular, mientras que la recombinación homóloga ocurre durante G1.

C. Ninguna de las anteriores es correcta.

D. no requiere una plantilla.

A. Una transversión que conduce a una mutación sin sentido

B. Una transición que conduce a una mutación neutra

C.Una transición que conduce a una mutación sin sentido

D. Una transversión que conduce a una mutación sin sentido

Esta secuencia de aminoácidos se determinó en una serie de mutantes. Uno de los mutantes, con la secuencia Met-Ser-Ser-Arg-Leu-Glu-Gly, ¿se debió a qué tipo de mutación?

R. Ninguno de los anteriores es correcto.

Esta secuencia de aminoácidos se determinó en una serie de mutantes. ¿Uno de los mutantes, con la secuencia Met-Ser-Pro ocurrió debido a qué tipo de mutación?

R. Ninguno de los anteriores es correcto.

Esta secuencia de aminoácidos se determinó en una serie de mutantes. Uno de los mutantes, con la secuencia Met-Ser-Pro-Asp-Trp-Arg-Asp-Lys, ¿se debió a qué tipo de mutación?

D. Ninguna de las anteriores es correcta.

A. solo puede inducir una transición de CG a AT.

B. convertirá el codón en un aminoácido diferente.

C. Las respuestas A y C son correctas.

D. elimina un grupo amino del nucleótido.

R. El 5-MC es perjudicial para los animales y los que portan grandes cantidades no sobreviven.

B. Es probable que la 5-MC conduzca a la pérdida de funciones genéticas importantes, por lo que los pares de bases AT necesitarán reemplazar los pares de bases GC.

C. 5-MC se desamina a timina, lo que puede conducir a cambios de GC a AT.

D. Ninguna de las anteriores es correcta.

A. Single-base deletions and insertions

B. None of the above is correct.

C. GC to AT base-pair substitutions

D. AT to GC base-pair substitutions

A. The lack of visible light allowed nucleotide excision repair to act upon the pyrimidine dimers and create mutations.

B. Visible light promoted the activity of mismatch repair which led to a reduced number of mutations and fewer UV-induced pyrimidine dimers.

C. Visible light killed many of the mutant cells for the second group and this included many mutant cells.

D. Visible light caused the pyrimidine dimers to be converted directly to mutations.

A. Transposable elements insert into the white-eye locus in the majority of the eye cells, leaving only a patch of eye cells with an active white-eye locus, still producing red pigment.

B. A transposable element located within the white-eye gene uses reverse transcriptase to produce normal gene product, and this causes the white eyes with red spots.

C. A transposable element transposes to the regulatory region of the white-eye gene and causes gene expression to be reduced, and this results in the white eyes with red spots.

D. Insertion of a transposable element upstream of the white-eye locus during eye development activates the red pigment production gene in a patch of eye cells.

A. All of the above are correct.

B. The length of the inverted repeats at the ends of the transposon

C. The number of base pairs between the staggered nicks made at the target site

D. The length of the long terminal repeats at the ends of the transposon

A. Ac and Ds elements simultaneously transpose into the C allele, but later Ac transposes back out, which results in colored sectors in an otherwise colorless (yellow) kernel.

B. An active Ds element causes an Ac element to transpose into the C allele, which results in colored sectors in an otherwise colorless (yellow) kernel.

C. An active Ds element causes an Ac element to transpose out of the C allele during kernel development, allowing colored sectors produced in an otherwise colorless (yellow) kernel.

D. An active Ds element that enhances transcription of the C allele is suppressed by an Ac element, which results in colored sectors in an otherwise colorless (yellow) kernel.

A. Strain B contains transposable elements on the Y chromosome.

B. Strain A contains transposable elements on the X chromosome.

C. Strain A contains a transposable element that makes transposase, while strain B contains a transposable element that does not make transposase.

D. Strain B is P+, and strain A is P-.

A. This transposable element can never transpose.

B. If another transposable element of the same type is present in the cell and expresses a functional transposase enzyme

C. If another transposable element that produces reverse transcriptase is present in the cell, the insertion sequence will be able to transpose.

D. If the transposable element is transcribed and the host cell also expresses a functional reverse transcriptase that then makes a DNA copy

A. Yes. Transposable elements that transpose through a copy-and-paste mechanism would be blocked at the replication step.

B. Yes. All transposable elements would be prevented from transposing.

C. Yes. LTR retrotransposons only would be blocked at the reverse transcription step.

D. Yes. All types of retrotransposons would be blocked at the reverse transcription step.

A. It has long terminal repeats and transposes through a cut-and-paste mechanism.

B. It has inverted terminal repeats and transposes through an RNA intermediate.

C. It has inverted terminal repeats along with a polIII promoter and a poly(A) sequence, and transposes through an RNA intermediate.

D. It has either long terminal repeats, or a polIII promoter and a poly(A) tail, and it transposes through an RNA intermediate.

C. Homologous recombination

D. Nucleotide-excision repair

Yellow kernels are caused by insertion of Ac or Ds elements into a pigment gene to inactivate it purple spots are produced when the fertilizing pollen does not have enough active Ac elements to inactivate the pigment gene in all the cells. The big sectors result from late transpositions of Ac or Ds during kernel development.

Yellow kernels are normally produced when the pollen contains no Ac elements pollen containing Ac elements introduce a purple pigment gene that piggybacks along with the Ac element. The big sectors result from early transpositions of Ac during kernel development.

Yellow kernels have a Ds element insertion inactivating a pigment gene the Ds element transposes and reactivates the pigment gene in kernels that are fertilized by pollen with an Ac element. The big sectors result from early transpositions of Ds during kernel development.

The purple spots are caused by the prior transposition of an Ac element whose insertion into a pigment gene has inactivated it the transposition of the Ac element reactivates the pigment gene. The big sectors result for early transpositions of Ac during kernel development.

A. All of the above are correct.

B. measuring the somatic mutation rates for the putative DNA-repair mutant plants.

C. measuring the germ line spontaneous and induced mutation rates for the putative DNA repair mutant plants.

D. exposing putative DNA repair mutant plants to ionizing radiation and seeing if they survive less well than wild-type plants.

A. Nonsense mutation in a rRNA gene

B. Intragenic suppressor in a rRNA gene

C. None of the above is correct.

D. Intergenic suppressor in a tRNA gene

A. Older men produce sperm that have originated from more prior mitotic cell divisions in the germ line, so there are more opportunities for mutations to occur.

B. Chromosome aberrations occur more often in older men than in younger men, so this will produce more achondroplasia mutations in older men.

C. Older men produce more sperm than younger men, and this would allow more mutations to appear in the next generation of offspring.

D. Nucleotide excision repair is error prone in older men, so this would lead to more achondroplasia mutations compared to that of younger men who have error-free nucleotide excision repair.

A. mRNAs with premature stop codons are destroyed through a process called nonsense-medicated mRNA decay.

B. Nucleotide-excision repair will remove the mRNA with its exonuclease activity.

C. The RNA polymerase will degrade the mRNA as soon as it transcribes the premature stop codon.

D. The mRNA will fold into an inappropriate secondary structure because of the premature stop codon and this will lead to the cleavage of the message.

A. Both codons contain a G or a C.

B. The ochre codon contains a G or a C, and the amber codon must contain an A or a U.

C. None of the above is correct.

D. The ochre codon contains an A or U, and the amber codon contains a G or a C.

A. males will exhibit disproportionate lethality due to the presence of a Y chromosome, that is, more males than females are expected to die because of sex-linked recessive lethal mutations on the Y chromosome.

B. males will exhibit disproportionate lethality due to the existence of one X chromosome, that is, more males than females are expected to die because of sex-linked recessive lethal mutations..

C. Answers A and B are both correct.

D. females will exhibit disproportionate lethality due to the presence of two X chromosomes, that is, more females than males are expected to die because of sex-linked recessive lethal mutations.

A. Female D. willistoni flies should be mated to male D. melanogaster flies and the hybrid progeny recovered and examined for P elements. Those that have P elements should be exposed to mites, and then the mites should contain P element after several generations.

B. Mites that have infected a laboratory culture of D. melanogaster have been isolated and found to contain P elements. These mites are then allowed to infect a culture of D. willistoni that initially does not have P elements, but after several generations in the presence of the mites, the D. willistoni of the colony now possess P elements.

C. Mites with P elements should be allowed to feed on colonies of D. willistoni without P elements and colonies of D. melanogaster without P elements. After several generations, the colony of D. melanogaster flies should contain P elements, but the colony of D. willistonia flies should not.

D. Mites that have infected a laboratory culture of D. willistoni have been isolated and found to contain P elements. These mites are then allowed to infect a culture of D. melanogaster that initially does not have P elements, but after several generations in the presence of the mites, the D. melanogaster of the colony now possess P elements.

A. It might increase the level of spontaneous mutations because it would increase depurinations in the DNA, and this would lead to cell death and accelerated aging.

B. It might enhance the level of spontaneous mutagenesis because cells would not be able to remove oxidized guanines from their genomes, and this would lead to cell death and accelerated aging.

C. It might reduce the level of nonhomologous end joining repair so that cells would not be able to repair their DNA in the G2 stage of the cell cycle.

D. It likely would enhance DNA replication so that tissues age more quickly.


MATERIALES Y MÉTODOS

Strains and media

Escherichia coli DH10B T1R (Invitrogen) was used as host for cloning, plasmid propagation and fluorescence assays. Bacteria were generally cultured on LB medium (10 g/l peptone (Oxoid), 5 g/l yeast extract (BD), 10 g/l NaCl (Acros)) at 37°C. When required, media were supplemented with kanamycin (kan 50 mg/l) and/or chloramphenicol (cam 35 mg/l). Fluorescence assays were performed on M9TG medium (1x M9 salts (Sigma), 10 g/l tryptone (Oxoid), 5 g/l glycerol (Acros)). Induction of the FnCas12a was done with l -rhamnose (2 g/l).

Plásmidos

The commercial pRham N-His SUMO Kan from Lucigen was made compatible for Ligation Independent Cloning (LIC) by polymerase chain reaction (PCR) (BG7802 and BG7803). los fncas12a gene was PCR amplified (BG7709 and BG7710) and cloned into pRham_LIC using a standard LIC protocol. The pRham-FnCas12a-DAS was made using pRham-FnCas12a as a base. The pRham-Cas12a was digested with BamHI-HF (NEB) and SpeI-HF (NEB). A fragment was created with a variant of the ssrA tag behind the Cas12a coding sequence (AANDENYADAS see below) by PCR with Q5 polymerase (NEB), using BG8998 and BG10140 as primers and pRham-FnCas12a as template. The PCR fragment was digested with BamHI-HF and SpeI-HF and ligated into the pRham-FnCas12a digest using T4 ligase (NEB) to generate pCas12a.

Target plasmids pTarget1 to pTarget8 are generated from two fragments. The fragments are generated by PCR with Q5 polymerase (NEB). The first fragment contains the gato gene (chloramphenicol resistance) from pACYC184 flanked by a SalI site—terminator (Target1 – F1)/mature repeat (Target2 – F1)/full repeat (Target3 – F1) on one side and SacI on the other. The second fragment contains the P15A ori from pACYC184 and an mrfp gene. A SacI site—PAM—target is attached by PCR on the one end while the other end the crRNA is attached followed by a SalI site. Depending on whether a full repeat is required (Target1 – F2) or a mature repeat (Target4 – F2), a different template is used. Ligating the Target1 – F2 to Target1/2/3 – F1 yields pTarget1/2/3 respectively and ligating Target4 – F2 to Target1/2/3 – F1 yields pTarget4/5/6. Fragments were digested with SalI-HF (NEB) and SacI-HF (NEB), and ligated with T4 ligase (NEB). pTarget7 is generated by ligating Target7 – F1 to Target7 – F2, while pTarget8 is a ligation of Target8 – F1 and Target8 – F2. pTarget9 is a ligation of Target8 – F1 and Target9 – F2. These plasmids are assembled by Golden Gate cloning with SapI (NEB) and T4 ligase (NEB). An overview of the cloning details, including primer sequences, can be found in the supplementary data ( Supplementary sequence 1 , Supplementary Tables S1 and S2 ).

Fluorescence loss assay

The targeting activity of programmable nucleases in bacteria is generally measured either by transformation efficiency assays (based on the recovery of viable transformants), or by plasmid loss assays (based on loss of plasmid over time). In both cases, the fraction of bacteria harbouring a plasmid is assessed by plating in parallel on both selective and non-selective medium. However, apart from being labour intensive, we consider these methods not accurate enough to distinguish small differences in cleavage efficiency. Major drawbacks of transformation efficiency assays include inconsistency of bacterial competence and differences in plasmid purity and concentration, resulting in low accuracy. Plasmid loss assays do not suffer from these artefacts, but still require plating and colony counting. The duration of the expression of the Cas12a nuclease is quite essential, as resolution is lost either at high plasmid clearance rates or during extended Cas12a exposure. While the extended Cas12a exposure increases sensitivity, the information on plasmid cleavage efficiency is lost after full plasmid clearance.

For these reasons, we developed a robust screening approach that allows for accurate detection of variations in the copy number of a target plasmid. Apart from a chloramphenicol resistance marker (gato), the target plasmid (pTarget) contains a constitutively expressed reporter gene (mrfp), a short CRISPR array with a single spacer sequence, and a matching target sequence downstream of a 5′-TTTV PAM motif (hereafter referred to as ‘target’) (Figure 1B Table 1 Supplementary Table S2 ). To ensure the differences in mRFP fluorescence are a direct result of Cas12a cleavage activity, and not, for example, caused by blocking of read-through transcription, the mrfp gene is isolated by two terminators. In addition, targeting occurs outside of the mrfp transcription region. The target plasmids were individually transformed to E. coli cells harbouring a second plasmid (pCas12a) that encodes FnCas12a (hereafter referred to as Cas12a). The rate of Cas12a-mediated clearance of the target plasmid is detected as loss of mRFP fluorescence, directly reflecting the spacer-based targeting efficiency.

Name . 5′-spacer flank . 3′-spacer flank .
pTarget1 Leader-full repeat (L-FR) SalI-Terminator (|T|)
pTarget2 Leader-full repeat (L-FR) SalI-Mature repeat-spacing-terminator (MR)
pTarget3 Leader-full repeat (L-FR) SalI-Full repeat-spacing-terminator (FR)
pTarget4 Mature repeat (MR) SalI-Terminator (|T|)
pTarget5 Mature repeat (MR) SalI-Mature repeat-spacing-terminator (MR)
pTarget6 Mature repeat (MR) SalI-Full repeat-spacing-terminator (FR)
pTarget7 Mature repeat (MR) Terminator (|T|)
pTarget8 Mature repeat (MR) Mature repeat-spacing-terminator (MR)
pTarget9 Full repeat (FR) Mature repeat-spacing-terminator (MR)
Name . 5′-spacer flank . 3′-spacer flank .
pTarget1 Leader-full repeat (L-FR) SalI-Terminator (|T|)
pTarget2 Leader-full repeat (L-FR) SalI-Mature repeat-spacing-terminator (MR)
pTarget3 Leader-full repeat (L-FR) SalI-Full repeat-spacing-terminator (FR)
pTarget4 Mature repeat (MR) SalI-Terminator (|T|)
pTarget5 Mature repeat (MR) SalI-Mature repeat-spacing-terminator (MR)
pTarget6 Mature repeat (MR) SalI-Full repeat-spacing-terminator (FR)
pTarget7 Mature repeat (MR) Terminator (|T|)
pTarget8 Mature repeat (MR) Mature repeat-spacing-terminator (MR)
pTarget9 Full repeat (FR) Mature repeat-spacing-terminator (MR)
Name . 5′-spacer flank . 3′-spacer flank .
pTarget1 Leader-full repeat (L-FR) SalI-Terminator (|T|)
pTarget2 Leader-full repeat (L-FR) SalI-Mature repeat-spacing-terminator (MR)
pTarget3 Leader-full repeat (L-FR) SalI-Full repeat-spacing-terminator (FR)
pTarget4 Mature repeat (MR) SalI-Terminator (|T|)
pTarget5 Mature repeat (MR) SalI-Mature repeat-spacing-terminator (MR)
pTarget6 Mature repeat (MR) SalI-Full repeat-spacing-terminator (FR)
pTarget7 Mature repeat (MR) Terminator (|T|)
pTarget8 Mature repeat (MR) Mature repeat-spacing-terminator (MR)
pTarget9 Full repeat (FR) Mature repeat-spacing-terminator (MR)
Name . 5′-spacer flank . 3′-spacer flank .
pTarget1 Leader-full repeat (L-FR) SalI-Terminator (|T|)
pTarget2 Leader-full repeat (L-FR) SalI-Mature repeat-spacing-terminator (MR)
pTarget3 Leader-full repeat (L-FR) SalI-Full repeat-spacing-terminator (FR)
pTarget4 Mature repeat (MR) SalI-Terminator (|T|)
pTarget5 Mature repeat (MR) SalI-Mature repeat-spacing-terminator (MR)
pTarget6 Mature repeat (MR) SalI-Full repeat-spacing-terminator (FR)
pTarget7 Mature repeat (MR) Terminator (|T|)
pTarget8 Mature repeat (MR) Mature repeat-spacing-terminator (MR)
pTarget9 Full repeat (FR) Mature repeat-spacing-terminator (MR)

Compared to plasmid loss or transformation assays, the here-established fluorescence-loss assay allows for distinguishing between efficient (good) and less-efficient (bad) crRNAs with high accuracy and ease. The fluorescence builds up as long as the plasmid is retained and the bacteria are still producing protein. The higher the activity of the Cas12a, the higher the loss of fluorescence. The effect of exposure to Cas12a is terminated by bacteria reaching the stationary phase where protein production eventually stops, so timing is less essential compared to a plasmid loss assay. Even when all the plasmid is lost, differences in targeting activity can still be extrapolated from fluorescence values. Important to note, however, is that the dilution of the preculture to the final culture dictates the exposure time. It is therefore essential that the dilution is carried out very precisely. If more sensitivity is required, the cells can be further diluted to allow for a longer period of plasmid loss.

Fine-tuning of the assay

To allow for accurate comparative analyses of crRNA performance, fine-tuning of the assay has been performed at three levels. (I) Synchronizing cells: The time available for the plasmid clearance is crucial for the final fluorescence. For the best possible comparison of targeting performance of different crRNAs, the bacteria harbouring both plasmids (pCas12a and pTarget) were synchronized by growing them to the stationary phase in a pre-culture in the presence of antibiotics to select for maintenance of both plasmids. (II) Minimize targeting when undesired: Simultaneous selection of pTarget maintenance (through presence of chloramphenicol) and targeting of pTarget by background Cas12a activity, would allow for growth of escape mutants and hence selection of false negatives in the fluorescence loss assay. Indeed, under these conditions we observed sabotage of Cas12a activity in different ways: by deletion of the entire spacer through recombination of the two flanking repeats, by recombination of the ribosome binding site of the cas12a gene, and by introduction of a transposon into the cas12a coding region (not shown). To control the timing of Cas12a targeting, the cas12a gene expression is controlled by the rhamnose-inducible PrhaBAD promoter. (III) Limit the lifespan of Cas12a: To further reduce leaky expression of Cas12a, an ssrA degradation tag is fused to the C-terminus of the protein. While the native ssrA tag (‘AANDENYALAA’) almost completely abolishes the Cas12a activity, a less efficient tag variant (‘AANDENYA D A S ’) ( 30, 31) was found to limit both the Cas12a residence time and its leaky expression ( Supplementary Figure S3 ). It also reduces the protein levels of Cas12a in the cell while being induced. A large excess of Cas12a would cause crRNAs to bind because of the high effector protein concentration rather than a high affinity in that case moderate affinity might cause the fluorescence to drop to background levels, resulting in loss of resolution for the high efficiency spacers. When the Cas12a concentration is limited, we can distinguish moderate from good spacers.

Without Cas12a induction and without antibiotics pressure on the target plasmid, a very low basic level of fluorescence loss is observed for most spacers ( Supplementary Figure S4 ). A low, non-induced fluorescence loss indicates that the plasmid is not targeted severely during the synchronisation, and therefore, escape mutants have no significant growth advantage. Some of the highly efficient spacers do show substantial fluorescence loss without induction of Cas12a and without addition of cam. The presence of cam enforces target plasmid maintenance, and although we see a reduction in fluorescence compared to less efficient spacers, the reduction is only marginally under these conditions, and no escape mutants were observed.

In vitro cleavage assay

Pre-crRNA was made by in vitro transcription with the HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit (NEB). FnCas12a was diluted to 0.4 nM in 2× NEBuffer 4 with 2 mM Mg 2+ , instead of 20 mM Mg 2+ . Reactions were started by adding 0.2 nM pre-crRNA in a 1:1 ratio. Reactions were incubated at 37°C and sampled at t = 0, t = 5 and t = 10 min. Sampled reactions were quenched by adding 1 μl of quenching solution (9% SDS, 50 mM EDTA) to 10 μl of sample. Samples were heated to 95°C for 5 min and cooled to 12°C. Potassium dodecyl sulphate was pelleted by centrifugation and the 10 μl of supernatant was mixed with 2× RNA Loading Dye (NEB) and analysed on a 1.5 mm 5% acrylamide gel containing 7 M urea. The gel was run on a Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell system at 15 mA until the bromophenol blue was at the bottom. RNA cleavage products were stained by SYBR gold and visualised on a Bio-Rad Gel Doc XR+.


Nucleotide sequence and gene organization of ColE1 DNA.

The primary structure of the plasmid ColE1 DNA has been determined. The plasmid DNA consists of 6646 base pairs (molecular mass of 4.43 MDa) and is 48.46% in GC content. The phi 80 trp insert of the composite plasmid of ColE1, pVH51, has also been determined. The determination of the nucleotide sequence of ColE1 DNA provides the basis for examining the relationships between the DNA sequence and the gene organization of the plasmid. The focus of this paper is to use this sequence data coupled with a review of the literature and our own work to examine the nine known functional regions of ColE1: imm (colicin E1 immunity), rep (replication function), inc (plasmid incompatibility and copy number control), bom (basis of mobility), rom (modulator of inhibition of primer formation by RNA I), mob (plasmid mobilization), cer (determinant for conversion of plasmid multimers to monomers), exc (plasmid entry exclusion), cea (structural gene for colicin E1), and kil (structural gene for the Kil protein).


Contenido

Qualitatively, guanine (G) and cytosine (C) undergo a specific hydrogen bonding with each other, whereas adenine (A) bonds specifically with thymine (T) in DNA and with uracil (U) in RNA. Quantitatively, each GC base pair is held together by three hydrogen bonds, while AT and AU base pairs are held together by two hydrogen bonds. To emphasize this difference, the base pairings are often represented as "G≡C" versus "A=T" or "A=U".

DNA with low GC-content is less stable than DNA with high GC-content however, the hydrogen bonds themselves do not have a particularly significant impact on molecular stability, which is instead caused mainly by molecular interactions of base stacking. [2] In spite of the higher thermostability conferred to a nucleic acid with high GC-content, it has been observed that at least some species of bacteria with DNA of high GC-content undergo autolysis more readily, thereby reducing the longevity of the cell per se. [3] Because of the thermostability of GC pairs, it was once presumed that high GC-content was a necessary adaptation to high temperatures, but this hypothesis was refuted in 2001. [4] Even so, it has been shown that there is a strong correlation between the optimal growth of prokaryotes at higher temperatures and the GC-content of structural RNAs such as ribosomal RNA, transfer RNA, and many other non-coding RNAs. [4] [5] The AU base pairs are less stable than the GC base pairs, making high-GC-content RNA structures more resistant to the effects of high temperatures.

More recently, it has been demonstrated that the most important factor contributing to the thermal stability of double-stranded nucleic acids is actually due to the base stackings of adjacent bases rather than the number of hydrogen bonds between the bases. There is more favorable stacking energy for GC pairs than for AT or AU pairs because of the relative positions of exocyclic groups. Additionally, there is a correlation between the order in which the bases stack and the thermal stability of the molecule as a whole. [6]

GC-content is usually expressed as a percentage value, but sometimes as a ratio (called Relación G + C o Relación GC). GC-content percentage is calculated as [7]

whereas the AT/GC ratio is calculated as [8]

The GC-content percentages as well as GC-ratio can be measured by several means, but one of the simplest methods is to measure the melting temperature of the DNA double helix using spectrophotometry. The absorbance of DNA at a wavelength of 260 nm increases fairly sharply when the double-stranded DNA molecule separates into two single strands when sufficiently heated. [9] The most commonly used protocol for determining GC-ratios uses flow cytometry for large numbers of samples. [10]

In an alternative manner, if the DNA or RNA molecule under investigation has been reliably sequenced, then GC-content can be accurately calculated by simple arithmetic or by using a variety of publicly available software tools, such as the free online GC calculator.

Within-genome variation Edit

The GC-ratio within a genome is found to be markedly variable. These variations in GC-ratio within the genomes of more complex organisms result in a mosaic-like formation with islet regions called isochores. [11] This results in the variations in staining intensity in chromosomes. [12] GC-rich isochores typically include many protein-coding genes within them, and thus determination of GC-ratios of these specific regions contributes to mapping gene-rich regions of the genome. [13] [14]

Coding sequences Edit

Dentro de una región larga de secuencia genómica, los genes a menudo se caracterizan por tener un contenido de GC más alto en contraste con el contenido de GC de fondo para todo el genoma. La evidencia de la proporción de GC con la de la longitud de la región codificante de un gen ha demostrado que la longitud de la secuencia codificante es directamente proporcional al mayor contenido de G + C. [15] This has been pointed to the fact that the stop codon has a bias towards A and T nucleotides, and, thus, the shorter the sequence the higher the AT bias. [16]

Comparison of more than 1,000 orthologous genes in mammals showed marked within-genome variations of the third-codon position GC content, with a range from less than 30% to more than 80%. [17]

Among-genome variation Edit

GC content is found to be variable with different organisms, the process of which is envisaged to be contributed to by variation in selection, mutational bias, and biased recombination-associated DNA repair. [18]

The average GC-content in human genomes ranges from 35% to 60% across 100-Kb fragments, with a mean of 41%. [19] The GC-content of Yeast (Saccharomyces cerevisiae) is 38%, [20] and that of another common model organism, thale cress (Arabidopsis thaliana), es del 36%. [21] Because of the nature of the genetic code, it is virtually impossible for an organism to have a genome with a GC-content approaching either 0% or 100%. However, a species with an extremely low GC-content is Plasmodium falciparum (GC% =

20%), [22] and it is usually common to refer to such examples as being AT-rich instead of GC-poor. [23]

Several mammalian species (e.g., shrew, microbat, tenrec, rabbit) have independently undergone a marked increase in the GC-content of their genes. These GC-content changes are correlated with species life-history traits (e.g., body mass or longevity) and genome size, [17] and might be linked to a molecular phenomenon called the GC-biased gene conversion. [24]

Molecular biology Edit

In polymerase chain reaction (PCR) experiments, the GC-content of short oligonucleotides known as primers is often used to predict their annealing temperature to the template DNA. A higher GC-content level indicates a relatively higher melting temperature.

Systematics Edit

The species problem in non-eukaryotic taxonomy has led to various suggestions in classifying bacteria, and the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics has recommended use of GC-ratios in higher-level hierarchical classification. [25] For example, the Actinobacteria are characterised as "high GC-content bacteria". [26] In Streptomyces coelicolor A3(2), GC-content is 72%. [27]

GCSpeciesSorter [28] and TopSort [29] are software tools for classifying species based on their GC-contents.

Ver el vídeo: Componentes del Gen Humano (Noviembre 2024).