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¿Cómo depende la alta fidelidad de la replicación del ADN de la formación de enlaces de hidrógeno?

¿Cómo depende la alta fidelidad de la replicación del ADN de la formación de enlaces de hidrógeno?


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La replicación tiene una tasa de error de menos de 1 en 100 millones. La ADN polimerasa forma un enlace H con los átomos aceptores del enlace H en el surco menor. <- ¿mejorar la fidelidad aquí?

La unión del grupo trifosfato al sitio activo de la ADN polimerasa desencadena un cambio conformacional. Cambiar un residuo de Tyr conservado aumenta la tasa de error en 40 veces.

No entiendo bien las dos declaraciones anteriores. ¿Alguien me puede explicar en detalle? ¡Gracias!


La ADN polimerasa debe catalizar la adición de 4 nucleótidos diferentes a la hebra en crecimiento. Esto significa que no puede determinar directamente qué base incorporar en un punto específico (cómo 'sabría' qué base incorporar y cómo cambiaría su especificidad para diferentes bases). Esto significa que la especificidad de qué par de bases incorporar depende de la hebra de ADN molde.

El emparejamiento correcto de bases de Watson-Crick (es decir, enlace de hidrógeno) entre la hebra plantilla y el nucleótido que se va a incorporar desencadena el cierre del dominio de dedo de DNAP alrededor de la unión cebador-plantilla y coloca a esta última en la posición óptima para la catálisis (con el $ ce { alpha-PO_4} $ del nucleótido entrante cerca del $ ce {3'-OH} $ del cebador para un ataque nucleofílico catalizado por dos $ ce {Mg ^ ​​{2 +}} $ iones ). Aquí es donde entra en juego el residuo de tirosina conservado que mencionaste. Un nucleótido emparejado incorrectamente no desencadenará este cambio conformacional y no se posicionará de manera óptima, por lo que la catálisis es menos probable.

Además, la ADN polimerasa hace contacto con el surco menor de la unión cebador-plantilla a través de enlaces de hidrógeno. Esta interacción no es específica de bases (todos los pares de bases de Watson-Crick tienen el mismo patrón de aceptores de enlaces de hidrógeno en el surco menor) pero solo ocurre cuando se incorpora el nucleótido correcto, estabilizando así el complejo.

Finalmente, la discriminación entre ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos se realiza mediante exclusión estérica de $ ce {2'-OH} $ por residuos de aminoácidos en el bolsillo de unión.

Estos factores pueden considerarse como corrección cinética, ya que simplemente ralentizan la velocidad de reacción y dan tiempo para que un nucleótido emparejado incorrectamente se disocie. Sin embargo, todavía se pueden incorporar y muchas ADN polimerasas tienen una exonucleasa de corrección de pruebas $ ce {3 '-> 5'} $ que puede eliminar nucleótidos emparejados incorrectamente. Esta corrección de pruebas está nuevamente mediada por interacciones entre el DNAP y la unión cebador-molde (es decir, enlaces de hidrógeno con el surco menor). Una interacción debilitada debido a una base emparejada incorrectamente reduce la afinidad entre el ADN y el sitio catalítico y aumenta la afinidad entre el ADN y el sitio de corrección de pruebas (porque tiene preferencia por escindir el ssDNA del extremo 3 ').


Las ADN polimerasas de alta fidelidad tienen varias salvaguardas para proteger contra cometer y propagar errores al copiar ADN.

Tales enzimas tienen una preferencia de unión significativa por el nucleósido trifosfato correcto frente al incorrecto durante la polimerización.

Si un nucleótido incorrecto se une al sitio activo de la polimerasa, la incorporación se ralentiza debido a la arquitectura subóptima del complejo del sitio activo. Este tiempo de retardo aumenta la oportunidad de que el nucleótido incorrecto se disocie antes de la progresión de la polimerasa, lo que permite que el proceso comience de nuevo, con un nucleósido trifosfato correcto (1,2).

Si se inserta un nucleótido incorrecto, corregir las ADN polimerasas tiene una línea de defensa adicional

Se detecta la perturbación causada por las bases mal emparejadas, y la polimerasa mueve el extremo 3 'de la cadena de ADN en crecimiento hacia un dominio de exonucleasa 3' → 5 'de corrección de pruebas. Allí, el nucleótido incorrecto es eliminado por la actividad exonucleasa 3 '→ 5', después de lo cual la cadena se mueve de regreso al dominio de la polimerasa, donde la polimerización puede continuar.

De: biolabs de Nueva Inglaterra:

https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/polymerase-fidelity-what-is-it-and-what-does-it-mean-for-your-pcr


Ambas frases se pueden entender a partir de la siguiente explicación.

En una hebra de ADN de nueva síntesis, la ADN polimerasa forma extensas enlaces de hidrógeno con la base recién agregada cada vez que se agrega un nuevo nucleótido. (Primera oración) La polimerasa también forma enlaces con la columna vertebral del ADN del fosfato y el azúcar. (Segunda oración)

La primera oración habla de cómo la polimerasa formará enlaces a través del surco menor del ADN recién sintetizado. La segunda oración habla sobre el cambio de un aminoácido de la ADN polimerasa (que es importante para formar enlaces con la columna vertebral del ADN). Este cambio de aminoácido provocará un error en el nucleótido agregado (ya que la polimerasa no está colocada correctamente, lo que comprenderá en la siguiente explicación).

Estos enlaces de polimerasa y bases junto con los enlaces entre la columna vertebral del ADN y la polimerasa. posición la ADN polimerasa.

Cuando un nucleótido recién agregado se empareja correctamente con las bases, la estructura de las bases emparejadas será tal que los enlaces formados entre la polimerasa y la base permitirán que la ADN polimerasa se coloque para la adición del próximo nucleótido nuevo. Si se agregó un nucleótido incorrecto, la ADN polimerasa se posiciona de manera que su sitio de exonucleasa esté en una posición para catalizar la actividad de exonucleasa.

Por lo tanto, los enlaces de hidrógeno entre la base y la polimerasa son necesarios para el posicionamiento correcto de la polimerasa para permitir que se agregue el siguiente nucleótido (si se agregó la base correcta) o permitir la actividad exonucleasa de la polimerasa (si se agregó una base incorrecta). Esto ayudará en la corrección de pruebas y, por lo tanto, proporcionará una alta fidelidad.


6 Procesos y tipos involucrados en la replicación del ADN (con diagrama)

Han pasado más de 30 años desde que J. D. Watson, F. H. C. Crick y M. H. F. Wilkins establecieron la naturaleza helicoidal bicatenaria de la molécula de ADN y sugirieron cómo el ADN sirve en su propia replicación.

De acuerdo con su modelo original para la replicación del ADN, las dos cadenas de polinucleótidos de la doble hélice & # 8220parent & # 8221 se separan y cada una sirve como una & # 8220template & # 8221 para la síntesis de una nueva cadena de polinucleótidos complementaria.

Durante la separación de la hebra, las bases de nitrógeno de cada hebra original se exponen y establecen sitios para la asociación de nucleótidos libres.

Estos nucleótidos luego se unen enzimáticamente para formar una nueva hebra complementaria. Debido a que el ácido desoxiadenílico (dAMP) puede formar enlaces de hidrógeno solo con timina de la hebra molde (y dGMP puede unirse solo a citosina, dCMP solo a guanina y dTMP solo a adenina), la hebra recién sintetizada será idéntica a la hebra complementaria original .

Como resultado, se forman dos nuevas dobles hélices, cada una de las cuales consta de una hebra polinucleotídica de la doble hélice madre y una hebra polinucleotídica recién sintetizada. Debido a que cada una de las dos hélices dobles conserva solo una de las cadenas de polinucleótidos parentales, se dice que el proceso es semiconservador.

Replicación como proceso & # 8220Semiconservative & # 8221:

Aunque el modelo original de Watson-Crick predijo la replicación semiconservativa del ADN, no se verificó hasta los estudios clásicos de M. S. Meselson y F. W. Stahl. En el momento de sus experimentos, se consideraron igualmente factibles otros dos modos de replicación (figura 21-1):

(1) Replicación conservadora, en la que ambas hebras de la doble hélice parental se conservarían y la nueva molécula de ADN consistiría en dos hebras recién sintetizadas y

(2) Replicación dispersiva, en la que la replicación implicaría la fragmentación de la doble hélice parental y la intercalación de piezas de las hebras parentales con piezas recién sintetizadas, formando así las dos nuevas dobles hélices.

Meselson y Stahl verificaron la naturaleza semiconservadora de la replicación del ADN en una serie de elegantes experimentos utilizando ADN marcado isotópicamente y una forma de centrifugación en gradiente de densidad isopícnica (véase el capítulo 12). Cultivaron células de Escherichia coli en un medio en el que el nitrógeno era 15 N (un isótopo & # 8220 pesado & # 8221 de nitrógeno, pero no un radioisótopo) en lugar de los 14 N.

Con el tiempo, las purinas y pirimidinas del ADN en las células nuevas contenían 15 N (donde normalmente se encuentran 14 N) y, por lo tanto, las moléculas de ADN eran más densas. El ADN en el que los átomos de nitrógeno son 15 N se puede distinguir del ADN que contiene 14 N porque durante la centrifugación isopícnica, los dos ADN diferentes se agrupan en diferentes posiciones de densidad en el tubo de centrífuga (fig. 21-2).

Meselson y Stahl centrifugaron el ADN aislado de las células durante 2-3 días a velocidades de rotación muy altas en tubos de centrífuga que inicialmente contenían una solución uniforme de CsCl. Durante la centrifugación, se formaron automáticamente gradientes de densidad en los tubos como resultado del equilibrio que se estableció entre la sedimentación de CsCl hacia el fondo del tubo y la difusión de la sal hacia la parte superior del tubo. Esta forma de centrifugación, llamada centrifugación isopícnica de equilibrio,

Dependiendo de su contenido de 15 N y 14 N, el ADN se agrupa en una posición específica en el gradiente de densidad. Debido a que el ADN sintetizado por las células cultivadas en 15 N sería más denso que el ADN que contiene 14 N, se colocaría en bandas más abajo del tubo (fig. 21-2).

Las células que crecieron durante algún tiempo en presencia de medio 15 N se lavaron para liberarlas del medio y se transfirieron a un medio que contenía 14 N y se dejaron continuar creciendo durante períodos de tiempo específicos (es decir, durante varios números de tiempos de generación). El ADN aislado de células cultivadas durante una generación en el medio 14 N tenía una densidad intermedia a la del ADN de las células cultivadas solo en medio que contenía 15 N (identificado como generación 0 en la figura 21-3) y la del ADN a partir de células cultivadas sólo en medio que contiene 14 N (los controles de la figura 21-3).

Tal resultado descartó inmediatamente la posibilidad de que la replicación del ADN fuera conservadora, ya que la replicación conservadora habría producido dos bandas de ADN en el gradiente de densidad para las células de generación 1 (es decir, F). La banda única de densidad intermedia (identificada como ADN & # 8220híbrido & # 8221 en la figura 21-3) consistía en moléculas de ADN en las que una hebra contenía 15 N y la otra 14 N.

Cuando la incubación en medio 14 N se llevó a cabo durante dos generaciones de tiempo (es decir, generación 2), se formaron dos bandas de ADN, una en la misma posición de densidad que el ADN de células cultivadas exclusivamente en medio 14 N (es decir, & # 8220 controles de luz & # 8221) y uno de densidad intermedia. Las generaciones posteriores produjeron un mayor número de moléculas de ADN que formaron bandas en la posición & # 8220light & # 8221 (ADN que contiene 14 N) en el gradiente de densidad. Estos resultados son consistentes solo con el modelo de replicación semiconservadora.

La replicación dispersiva habría producido una sola banda para cada generación y la banda se habría encontrado en posiciones de densidad sucesivamente más ligeras en el gradiente. Los estudios que utilizan otros procariotas además de eucariotas indican que la replicación semiconservativa del ADN es probablemente el mecanismo universal.

Replicación por adición de nucleótidos en el 5 & # 82423 y # 8242 Dirección:

Cada nucleótido de una hebra de ADN se une al siguiente nucleótido mediante un enlace fosfodiéster que une el carbono 3 & # 8242 de su desoxirribosa con el carbono 5 & # 8242 de la desoxirribosa del siguiente nucleótido. En un extremo de la cadena de polinucleótidos, hay un grupo hidroxilo unido al carbono 3 & # 8242 del último nucleótido, y en el otro extremo hay un grupo fosfato unido al carbono 5 & # 8242.

Las dos cadenas de una doble hélice tienen polaridades opuestas y se dice que son antiparalelas, es decir, cada extremo de la doble hélice contiene el extremo 5 & # 8242 de una hebra y el extremo 3 & # 8242 de la otra. Durante la replicación, la unión de un nucleótido a una hebra en crecimiento siempre tiene lugar en la posición terminal 3 & # 8242 de esa hebra. En otras palabras, la cadena de polinucleótidos en formación & # 8220 crece & # 8221 desde su extremo 5 & # 8242 hacia su extremo 3 & # 8242.

Replicación unidireccional y bidireccional:

La replicación comienza en un punto del cromosoma donde las dos hebras parentales comienzan a separarse, este punto se llama origen. La adición de nucleótidos complementarios para formar dos nuevas hebras tiene lugar a lo largo de ambas plantillas de hebras parentales a partir de ese punto (fig. 21-4).

En la replicación unidireccional, el crecimiento avanza a lo largo de ambas hebras en la misma dirección desde el origen. A lo largo de una de las hebras molde parentales, la síntesis de la nueva hebra complementaria tiene lugar mediante la adición continua de nucleótidos al extremo 3 & # 8242 disponible de la hebra en formación. La hebra en crecimiento se llama hebra principal o hebra continua. El extremo 5 & # 8242 de esta hebra se encuentra en el origen y su extremo 3 & # 8242 en la horquilla de replicación móvil (es decir, el punto progresivo de separación de las hebras parentales).

La otra hebra de polinucleótidos que se está formando se llama hebra retrasada o hebra discontinua. El alargamiento de esta hebra se produce mediante un mecanismo algo modificado. En contraste con la hebra principal, la hebra retrasada tiene su posición 3 & # 8242 en el origen y su posición 5 & # 8242 en la horquilla de replicación. Si se añadieran secuencialmente nucleótidos al final de la hebra rezagada en la bifurcación de replicación, entonces el crecimiento de esta hebra y # 8217s procedería en una dirección 3 & # 8217 → 5 & # 8242.

Esto no ocurre. En cambio, el crecimiento tiene lugar mediante la síntesis de una serie de cadenas polinucleotídicas cortas entre la horquilla de replicación y el origen. Cada cadena corta se coloca en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242 y luego se unen entre sí y al extremo 5 & # 8242 de la hebra retrasada.

Como resultado, la dirección general de crecimiento de la hebra rezagada es la misma que la de la hebra principal. El patrón de crecimiento inusual que caracteriza la síntesis de la hebra rezagada explica por qué también se la conoce como hebra & # 8220discontinua & # 8221.

En la replicación bidireccional (fig. 21-5), se forman dos horquillas de replicación en el origen que se alejan del origen en ambas direcciones a medida que se separa la doble hélice parental. La síntesis de las hebras complementarias también se produce en ambas direcciones. Detrás de cada horquilla hay un conjunto de hebras anteriores y posteriores. Como en el caso de la replicación unidireccional, el alargamiento de las dos hebras principales es continuo, mientras que el alargamiento de las dos hebras retrasadas es discontinuo.

Cabe señalar que independientemente de si la replicación es unidireccional o bidireccional, la adición de nucleótidos siempre ocurre en la dirección de 5 & # 8242 a 3 & # 8242, ya que se agregan nuevos nucleótidos a los extremos 3 & # 8242 disponibles de la hebra continua o la hebra discontinua. R. Okazaki demostró por primera vez la síntesis discontinua de hebras rezagadas. Okazaki incubó células de E. coli en un medio que contenía 3 H-timidina durante períodos de tiempo muy cortos (un pulso de solo 15 segundos) y luego examinó la distribución del radioisótopo en el ADN recién sintetizado.

El radioisótopo se encontró en varios polinucleótidos (1000-2000 nucleótidos de longitud), ahora denominados fragmentos de Okazaki (Figs. 21-4 y 21-5). Cuando las células pulsadas se transfirieron a un medio sin marcar durante períodos de tiempo variables antes del análisis, el marcador radiactivo se recuperó en tramos mucho más largos de ADN. Esto se debe a que los fragmentos de Okazaki producidos durante el pulso corto de tritio se habían unido y conectado al extremo 5 & # 8242 de la hebra rezagada.

En las células eucariotas, los fragmentos de Okazaki suelen ser más pequeños (alrededor de 100-200 nucleótidos de largo). La replicación bidireccional del ADN es el mecanismo empleado en todas las células eucariotas y en la mayoría de las procariotas. La replicación unidireccional es rara y parece ocurrir solo en un número limitado de procariotas.

Visualización de la replicación en E. coli:

En 1963, J. Cairns desarrolló un procedimiento que emplea una combinación de microscopía y autorradiografía que hizo posible visualizar la replicación del cromosoma de E. coli. Cairns colocó en placas células de E. coli en un medio que contenía 3 H-timidina durante varios períodos de tiempo de modo que la timidina radiactiva se incorporó al ADN a medida que el cromosoma se replicaba en generaciones sucesivas de células.

Las células se extrajeron del medio después de varios períodos de incubación y se lisaron suavemente para liberar el cromosoma de la célula (las fuerzas de cizallamiento creadas por la lisis severa rompen el cromosoma en pequeños trozos). A continuación, los cromosomas se transfirieron a portaobjetos de vidrio y se recubrieron con una emulsión fotográfica sensible a las partículas beta de baja energía emitidas por la 3 H-timidina.

Después de exponer la emulsión a los rayos beta, la emulsión se desarrolló y se examinó mediante microscopía óptica. Dondequiera que se hubiera producido la descomposición de la timidina marcada en un cromosoma, la emulsión se expuso y se crearon granos visibles.

Un cromosoma que no participaba en la replicación apareció como una estructura circular formada a partir de una sucesión cercana de puntos de exposición. Los cromosomas & # 8220 atrapados en el acto & # 8221 de replicación dieron lugar a lo que se llama estructuras theta porque tienen la apariencia de la letra griega theta (es decir, 0) (Fig. 21-6). Las estructuras theta revelan las posiciones de las horquillas de replicación en el cromosoma circular.

El Replicón y la Secuencia de Replicación:

La secuencia de eventos que tiene lugar durante la replicación del ADN se comprende mejor para los procariotas y parece ser la siguiente (figura 21-7). La separación de la hebra parental comienza en un sitio llamado origen que contiene una secuencia de nucleótidos especial y dirige la asociación de varias proteínas. Las enzimas de desenrollado dependientes de ATP (también llamadas helicasas) promueven la separación de las dos hebras parentales y establecen horquillas de replicación que se alejarán progresivamente del origen (fig. 21-7a). Las helicasas separan la hebra parental a aproximadamente 1000 pares de bases por segundo.

Detrás de la bifurcación de replicación, se evita que las hebras simples de ADN se rebobine una sobre la otra (o que formen bucles de horquilla de doble hebra en cada hebra simple) por las acciones de un conjunto de proteínas llamadas proteínas desestabilizadoras de hélice o proteínas de unión de hebra única (es decir, , & # 8220SSBs & # 8221) (Fig. 21-7b). La acción de una helicasa introduce un superenrollamiento positivo en el ADN dúplex antes de la horquilla de replicación. Las enzimas llamadas topoisomerasas relajan el superenrollamiento uniéndose al dúplex transitoriamente superenrollado, cortando una de las hebras y haciéndola girar a través de la hebra intacta. A continuación, se vuelve a sellar la muesca.

Antes de que la síntesis de ADN comience en el origen, se forman polinucleótidos de ARN cortos que son complementarios a la plantilla de ADN. Estos tramos de ARN se denominan cebadores y también se colocan en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242. A continuación, se añaden los nucleótidos de ADN de uno en uno a los extremos libres 3 & # 8242 de los cebadores de ARN. Debido a que el crecimiento de la hebra rezagada es discontinuo, se forman varios cebadores de ARN y fragmentos de Okazaki. Tenga en cuenta que debe formarse un cebador de ARN para cada fragmento de Okazaki que se depositará (figura 21-7c). Las enzimas necesarias para la síntesis de los cebadores de ARN son una clase especial de ARN polimerasas llamadas ARN primasas.

El alargamiento de la cadena principal y la síntesis de los fragmentos de Okazaki son catalizados por una enzima llamada ADN polimerasa III. Los sustratos de la ADN polimerasa III son los desoxinucleósidos trifosfatos (por ejemplo, dATP, dGTP, dCTP y dTTp). La adición de un nucleótido a la posición 3 & # 8242 disponible de la hebra líder en continuo crecimiento o un fragmento de Okazaki de la hebra retrasada implica la eliminación de pirofosfato para producir un monofosfato de desoxinucleósido (por ejemplo, dAMP, dGMP, dCMP y dTMP).

Una vez finalizados los fragmentos de Okazaki, los cebadores de ARN son escindidos por la ADN polimerasa I, que luego llena los huecos resultantes con ADN (figura 21-7d). Después de que la ADN polimerasa I agrega el desoxirribonucleótido final en el espacio dejado por el cebador escindido, la enzima ADN ligasa forma el enlace fosfodiéster que une el extremo libre 3 & # 8242 del reemplazo del cebador con el extremo 5 & # 8242 del fragmento de Okazaki (Fig. 21-7f).

ADN polimerasas y & # 8220Processivity & # 8221:

En general, en las células se encuentran tres enzimas polimerasas de ADN diferentes. En los procariotas, estos se denominan ADN polimerasa I, ADN polimerasa II y ADN polimerasa III. Como se señaló anteriormente, la ADN polimerasa I escinde los cebadores de ARN y llena los huecos con ADN, mientras que la ADN polimerasa III agrega nucleótidos a la cadena principal en crecimiento y a los extremos 3 & # 8242 de los cebadores de ARN.

La función de la ADN polimerasa II sigue siendo desconocida. En las células eucariotas, las ADN polimerasas son ADN polimerasa a, ADN polimerasa II y ADN polimerasa 7; sus funciones se comparan con las de las enzimas procarióticas en el cuadro 21-1. La rapidez y eficacia con la que una ADN polimerasa extiende una cadena en crecimiento se denomina procesividad. Por ejemplo, la procesividad de la ADN polimerasa III que actúa sobre el extremo 3 & # 8242 de la hebra principal es muy alta porque la enzima permanece asociada con el extremo en crecimiento de la cadena y la hebra molde.

Durante la replicación unidireccional, la horquilla de replicación rodea completamente el cromosoma y las moléculas de ADN resultantes se separan. Para los procariotas en los que la replicación es bidireccional, las horquillas de replicación avanzan alrededor del cromosoma hasta que se encuentran. En los cromosomas eucariotas, donde hay muchas unidades de replicación o replicones, todos los replicones se unen antes de que las cromátidas puedan separarse. El replicón consiste en ese segmento de un cromosoma que incluye un origen y dos puntos de terminación (es decir, puntos donde termina la replicación).

NK Sinha y A. Kornberg han sugerido que las ADN polimerasas, las ARN primasas y las helicasas pueden asociarse entre sí para formar un complejo multienzimático, el replisoma que lleva a cabo la síntesis de las cadenas principales y rezagadas de manera coordinada (Fig. 21-8). Un complejo de este tipo sería altamente procesable y aseguraría una rápida replicación del ADN.

Alta fidelidad de replicación:

A pesar de la complejidad del proceso y la rapidez con la que procede, se cometen muy pocos errores durante la replicación del ADN. Por ejemplo, se estima que por cada error que ocurre, 10 9 pares de bases se replican fielmente. La alta fidelidad de la replicación del ADN se atribuye en parte a las propiedades especiales de las ADN polimerasas.

Las ADN polimerasas agregarán un nucleótido al extremo 3 & # 8242-OH disponible de una cadena de ADN en crecimiento (o cebador de ARN) solo si el nucleótido anterior está emparejado correctamente con el nucleótido molde. Si está presente un nucleótido no emparejado, el crecimiento de la hebra se detiene transitoriamente mientras se escinde un segmento de la hebra que contiene el error. Con un extremo 3 & # 8242 corregido restablecido, se reanuda el alargamiento por la ADN polimerasa.

Queda mucho por aprender sobre las enzimas que catalizan las reacciones de replicación. Hasta ahora, el principal obstáculo para tales estudios ha sido la dificultad de aislar y purificar las enzimas, ya sea individualmente o en complejos. Esto se debe en parte al hecho de que algunos de ellos pueden estar asociados con membranas. En las células procariotas, las horquillas de replicación están unidas a la membrana plasmática.

Se ha demostrado que alrededor de dos docenas de proteínas diferentes están involucradas en la replicación del ADN en las células de E. coli. Varias de las proteínas de E. coli están involucradas en las reacciones previas al cebado, es decir, las reacciones que ocurren antes de la formación de cebadores de ARN.


14,1 | Base histórica del entendimiento moderno

Al final de esta sección, podrá:

  • Explica la transformación del ADN.
  • Describe los experimentos clave que ayudaron a identificar que el ADN es el material genético.
  • Enunciar y explicar las reglas de Chargaff.

La comprensión moderna del ADN ha evolucionado desde el descubrimiento de los ácidos nucleicos hasta el desarrollo del modelo de doble hélice. En la década de 1860, Friedrich Miescher (Figura 14.2), médico de profesión, fue la primera persona en aislar las sustancias químicas ricas en fosfato de los glóbulos blancos o leucocitos. Llamó a estas sustancias químicas (que eventualmente se conocerían como ARN y ADN) nucleína porque estaban aisladas de los núcleos de las células.

Figura 14.2 Friedrich Miescher (1844-1895) descubrió los ácidos nucleicos.

Medio siglo después, el bacteriólogo británico Frederick Griffith fue quizás la primera persona en demostrar que la información hereditaria se podía transferir de una célula a otra "horizontalmente", en lugar de por descendencia. En 1928, informó de la primera demostración de bacterias transformación, un proceso en el que el ADN externo es absorbido por una célula, cambiando así la morfología y la fisiología. Estaba trabajando con Steotococos neumonia, la bacteria que causa la neumonía. Griffith trabajó con dos cepas, rugosa (R) y suave (S). La cepa R no es patógena (no causa enfermedad) y se llama rugosa porque su superficie exterior es una pared celular y carece de cápsula, como resultado, la superficie celular parece irregular bajo el microscopio. La cepa S es patógena (causa de enfermedad) y tiene una cápsula fuera de su pared celular. Como resultado, tiene una apariencia suave bajo el microscopio. Griffith inyectó la cepa R viva en ratones y sobrevivieron. En otro experimento, cuando inyectó a ratones con la cepa S muerta por calor, también sobrevivieron. En una tercera serie de experimentos, se inyectó a ratones una mezcla de cepa R viva y cepa S muerta por calor y, para su sorpresa, los ratones murieron. Tras aislar las bacterias vivas del ratón muerto, solo se recuperó la cepa de bacterias S. Cuando se inyectó esta cepa S aislada en ratones frescos, los ratones murieron. Griffith concluyó que algo había pasado de la cepa S muerta por calor a la cepa R viva y la transformó en la cepa S patógena, y llamó a esto el principio de transformación (Figura 11.3). Estos experimentos se conocen ahora como experimentos de transformación de Griffith.

Figura 14.3 Se utilizaron dos cepas de S.pneumoniae en los experimentos de transformación de Griffith. La cepa R no es patógena. La cepa S es patógena y causa la muerte. Cuando Griffith inyectó a un ratón la cepa S muerta por calor y una cepa R viva, el ratón murió. La cepa S se recuperó del ratón muerto. Por lo tanto, Griffith concluyó que algo había pasado de la cepa S muerta por calor a la cepa R, transformando la cepa R en cepa S en el proceso. (crédito & # 8220living mouse & # 8221: modificación del trabajo por NIH credit & # 8220dead mouse & # 8221: modificación del trabajo por Sarah Marriage)

Los científicos Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty (1944) estaban interesados ​​en explorar más este principio transformador. Aislaron la cepa S de los ratones muertos y aislaron las proteínas y los ácidos nucleicos, a saber, el ARN y el ADN, ya que eran posibles candidatos para la molécula de la herencia. Llevaron a cabo un estudio de eliminación sistemático. Usaron enzimas que degradaban específicamente cada componente y luego usaron cada mezcla por separado para transformar la cepa R. Descubrieron que cuando el ADN se degradaba, la mezcla resultante ya no podía transformar las bacterias, mientras que todas las demás combinaciones podían transformar las bacterias. Esto los llevó a concluir que el ADN era el principio transformador.

Los experimentos llevados a cabo por Martha Chase y Alfred Hershey en 1952 proporcionaron evidencia confirmatoria de que el ADN era el material genético y no las proteínas. Chase y Hershey estaban estudiando un bacteriófago, que es un virus que infecta a las bacterias. Los virus suelen tener una estructura simple: una cubierta de proteína, llamada cápside, y un núcleo de ácido nucleico que contiene el material genético, ya sea ADN o ARN. El bacteriófago infecta la célula bacteriana huésped al adherirse a su superficie y luego inyecta sus ácidos nucleicos dentro de la célula. El ADN del fago hace múltiples copias de sí mismo utilizando la maquinaria del huésped y, finalmente, la célula huésped estalla, liberando una gran cantidad de bacteriófagos. Hershey y Chase etiquetaron un lote de fagos con azufre radiactivo, 35 S, para marcar la cubierta de proteína. Otro lote de fagos se marcó con fósforo radiactivo, 32 P. Dado que el fósforo se encuentra en el ADN, pero no en la proteína, el ADN y no la proteína se marcaría con fósforo radiactivo.

Se permitió que cada lote de fagos infectara las células por separado. Después de la infección, la suspensión bacteriana del fago se colocó en un mezclador, lo que provocó que la capa del fago se desprendiera de la célula huésped. La suspensión de fagos y bacterias se centrifugó en una centrífuga. Las células bacterianas más pesadas se asentaron y formaron un sedimento, mientras que las partículas de fago más ligeras permanecieron en el sobrenadante (el líquido sobre el sedimento). En el tubo que contenía el fago marcado con 35 S, el sobrenadante contenía el fago marcado radiactivamente, mientras que no se detectó radiactividad en el sedimento. En el tubo que contenía el fago marcado con 32 P, se detectó radiactividad en el sedimento que contenía las células bacterianas más pesadas y no se detectó radiactividad en el sobrenadante. Hershey y Chase concluyeron que era el ADN del fago el que se inyectaba en la célula y transportaba información para producir más partículas de fago, lo que proporciona evidencia de que el ADN era el material genético y no las proteínas (Figura 14.4).

Figura 14.4 En los experimentos de Hershey y Chase, las bacterias se infectaron con fagos radiomarcados con 35S, que marca la proteína, o 32P, que marca el ADN. Solo 32P ingresó a las células bacterianas, lo que indica que el ADN es el material genético.

Por esta misma época, el bioquímico austríaco Erwin Chargaff examinó el contenido de ADN en diferentes especies y descubrió que las cantidades de adenina, timina, guanina y citosina no se encontraban en cantidades iguales, y que variaba de una especie a otra, pero no entre individuos de la misma especie. Descubrió que la cantidad de adenina es igual a la cantidad de timina, y la cantidad de citosina es igual a la cantidad de guanina, o A = T y G = C. Estas también se conocen como reglas de Chargaff. Este hallazgo resultó inmensamente útil cuando Watson y Crick se estaban preparando para proponer su modelo de doble hélice de ADN, que se analiza en el Capítulo 5.


Direccionalidad

Estas hebras tienen dos extremos designados llamados 5 y rsquo y 3 y rsquo (puede leer eso como 5 extremos principales y 3 extremos principales). Estos números indican la orientación química de un extremo a otro. Los números 5 y 3 representan el quinto y tercer átomo de carbono del anillo de azúcar, respectivamente. 5 y rsquo es el final, que se une a un grupo de fosfato que se une a otro nucleótido. 3 y rsquo final es importante ya que durante la replicación se agrega el nuevo nucleótido con este fin.

En términos de dirección, si una hebra es de 5 y rsquo a 3 y rsquo mientras se lee de izquierda a derecha, la otra hebra será de 3 y rsquo a 5 y rsquo. En pocas palabras, las hebras corren en direcciones opuestas. This orientation is kept for easy binding between nucleotides of the opposite strands.

The chemical structure of a four base pair fragment of a DNA double helix. (Photo Credit : Thomas Shafee / Wikimedia Commons)


How does high-fidelity of DNA replication depend on the formation of hydrogen bonds? - biología

We have characterized the role of Watson-Crick hydrogen bonding in the 3′-terminal base pair on the 3′-5′ exonuclease activity of the human mitochondrial DNA polymerase. Nonpolar nucleoside analogs of thymidine (dF) and deoxyadenosine (dQ) were used to eliminate hydrogen bonds while maintaining base pair size and shape. Exonuclease reactions were examined using pre-steady state kinetic methods. The time dependence of removal of natural nucleotides from the primer terminus paired opposite the nonpolar analogs dF and dQ were best fit to a double exponential function. The double exponential kinetics as well as the rates of excision (3–6 s –1 fast phase, 0.16–0.3 s –1 slow phase) are comparable with those observed during mismatch removal of natural nucleotides even when the analog was involved in a sterically correct base pair. Additionally, incorporation of the next correct base beyond a nonpolar analog was slow (0.04–0.22 s –1 ), so that more than 95% of terminal base pairs were removed rather than extended. The polymerase responds to all 3′-terminal base pairs containing a nonpolar analog as if it were a mismatch regardless of the identity of the paired base, and kinetic partitioning between polymerase and exonuclease sites failed to discriminate between correct and incorrect base pairs. Thus, sterics alone are insufficient, whereas hydrogen bond formation is essential for proper proofreading selectivity by the mitochondrial polymerase. The enzyme may use the alignment and prevention of fraying provided by proper hydrogen bonding and minor groove hydrogen bonding interactions as critical criteria for correct base pair recognition.


Hydrogen bonding revisited: Geometric selection as a principal determinant of DNA replication𠂟idelity

That hydrogen bonds play a central role in forming Watson𠄼rick (W𠄼) A⋅T and G𢱜 base pairs is a fundamental paradigm dating from the discovery of the structure of DNA in 1953. In addition to interstrand H bonding, intrastrand base-stacking and interstrand cross-stacking interactions are important in maintaining the bases in a stacked structure along the length of the DNA backbone. In general, H bonds between W𠄼 base pairs are viewed as “informational,” whereas the base-stacking interactions are regarded as “noninformational,” merely stabilizing the double helix. Consequently, it is a common perception that the H bonds pairing A with T and G with C are primarily responsible for the ability of DNA polymerases to synthesize DNA with high fidelity.

Difluorotoluene, a nonpolar isosteric analog of thymine (T), contains fluorine atoms in place of oxygens on the pyrimidine ring and thus cannot form H bonds with A (1). Nevertheless, A𢱟 base pairs are formed almost as well as A⋅T pairs by Escherichia coli proofreading-defective DNA polymerase I (KF exo − ), as Moran et al. (2) report in this issue of the Proceedings [the chemical structures of F and T and space-filling models of each are shown in Moran et al. (2), figure 1]. The observation that KF exo − fails to discriminate strongly against A𢱟 pairs applies when F is present either as a template base on DNA (3) or as a dFTP substrate (2). The apparently inescapable conclusion is that H bonds are not absolutely required for polymerase to form W𠄼 base pairs selectively.

These results provide an impetus to reconsider what role H bonds actually play in stabilizing DNA and enhancing DNA polymerase fidelity. Mismatched base pairs in a duplex DNA oligomer do cause marked reductions in DNA melting temperatures (4). The loss of H bonds upon replacement of T with F has this type of destabilizing effect (2). However, the notion that H bonds alone keep the two strands of a DNA double helix together, which is found in many textbooks, seems inadequate. When one considers that duplex alternating copolymers poly d(A,T) or poly d(G,C) have melting temperatures in aqueous solution that differ substantially from their respective homopolymer counterparts poly dA⋅poly dT or poly dG⋅poly dC, it becomes clear that base-stacking interactions have an important, perhaps dominant, sequence-dependent effect on duplex stability.

Furthermore, the free-energy differences (ΔΔG 0 ) between matched and mismatched base pairs deduced from melting data are in a range of about 0.2𠄴.0 kcal/mol (4𠄶), depending on the identity of the mispair, the surrounding sequence context, and its location near the center or at the DNA terminus. These ΔΔG 0 values, as measured in solution, are insufficient to account for the high nucleotide insertion fidelities of virtually all polymerases, including those that seem to be especially 𠇎rror prone” such as eukaryotic Pol β (7) or HIV-1 reverse transcriptase (8�). For example, ΔΔG 0 𢒃.7 kcal/mol measured for the natural base pairs A⋅T versus A𢱜 (6) should result in an A𢱜 misinsertion frequency of about 2 × 10 𢄣 . However, dAMP𢱜 and dCMP𢱚 misinsertion frequencies are typically about one to two orders of magnitude lower than that (11).

The recognition that base-pairing free-energy differences are too small to completely account for polymerase insertion selectivities prompted H. Echols and me to propose a “geometric selection” mechanism as a key component of insertion specificity (12, 13). The idea is that geometrical and electrostatic properties of the polymerase active site are likely to have a profound influence on nucleotide-insertion specificities. This influence would strongly favor insertion of bases having an optimal geometry, such that the C1′ distances and bond angles most closely approximate those of the Watson𠄼rick base pairs. For example, G⋅T, G𢱚, and C𢱚 mispairs have markedly different bond angles than A⋅T and G𢱜 pairs (Fig. ​ (Fig.1) 1 ) (14).

Geometric properties of Watson𠄼rick and mismatched base pairs. This figure is based on x-ray crystallography of duplex B-DNA oligonucleotides. The striking geometric identity of the Watson𠄼rick A⋅T and G𢱜 base pairs is not matched by the A𢱜 protonated wobble and G⋅T wobble base mispairs or by the G(anti)𢱚(syn) base mispair. [Reproduced with permission from ref. 14 (copyright 1987, Springer, Heidelberg).]

The observation by Moran et al. (2) that insertion of the base analog F opposite A is reduced by only 40-fold compared with its isosteric parent compound T opposite A suggests that the geometrical alignment of the substrate and template bases is a major determinant of polymerase fidelity. This result can be compared with earlier studies using the base analog 2-aminopurine (2AP), which forms 2AP⋅T base pairs with two H bonds in a proper W𠄼 geometry and is reduced by 7-fold compared with A⋅T (15, 16). Thus, the absence of H bonds in the incorporation of F opposite A decreases selectivity only about 6-fold relative to incorporation of 2AP opposite T. Considering that mispairs assuming non-W𠄼 geometries such as G⋅T (wobble), A𢱜 (protonated wobble), G𢱚 (antisyn) (Fig. ​ (Fig.1) 1 ) are misinserted with frequencies on the order of 10 𢄣 � 𢄦 (11), geometric constraints imposed at the polymerase active site may improve selectivities by perhaps three orders of magnitude or more.

There are at least three possible check points for proper geometric alignment during base insertion by polymerases: initial dNTP binding (16, 17), postbinding selection for the correct geometry (12, 18) by an induced-fit mechanism (19�), and the chemical step of phosphodiester formation. Previous data suggest there are significant differences in the extent to which different polymerases use each of the check points. We have suggested that the remarkable base-insertion fidelity of DNA polymerases derives from the sequential application of each check point to provide exquisite sensitivity to Watson𠄼rick geometry at the transition state for phosphodiester formation (13).

Taking the geometrical constraints imposed by the polymerase active site into consideration in conjunction with the active site electrostatic environment, it may be possible to relate the polymerase-insertion selectivity to solution free-energy differences between matched and mismatched base pairs. Measurements of ΔG 0 = ΔH 0 − TΔS 0 indicate relatively small differences between right and wrong base pairs at 37ଌ ΔΔG 0 is in a range of 0.2𠄴 kcal/mol, as mentioned above. The differences are small because ΔS 0 correlates with ΔH 0 (5, 22), a phenomenon called enthalpy𠄾ntropy compensation, which is observed in aqueous solution (23). That is, it takes more energy to melt highly stable, rigidly constrained base pairs than it does to melt less stable, weakly constrained base pairs. However, rigid base pairs having fewer degrees of freedom in the double helix will gain more degrees of freedom upon melting, whereas the opposite is true for less stable base pairs. As long as entropy and enthalpy changes are proportional, ΔΔH 0 is reduced by TΔΔS 0 , resulting in a small ΔΔG 0 (5).

How might polymerases increase free-energy differences to achieve high discrimination? Perhaps the geometric constraints imposed on the substrate and template bases in the polymerase active cleft can suppress ΔΔS enough to bring ΔΔG much closer in magnitude to ΔΔH. Typical values of ΔΔH 0 measured in aqueous solution are, by themselves, almost large enough to accommodate polymerase-insertion fidelities (5). Then, to the extent that dNTP and template bases confront each other in a lower dielectric medium that acts to partially exclude water, ΔΔH values may be even larger than in water (24). Thus, a polymerase active site that snugly accommodates correct base pairs by geometric selection and also reduces water in the vicinity of the base pair may amplify base pair free-energy differences by reducing entropy differences and increasing enthalpy differences by amounts sufficient to account for nucleotide-insertion fidelity.

In addition to discrimination during nucleotide insertion, fidelity in DNA replication is often enhanced by an associated exonuclease activity. Proofreading exonucleases increase fidelity by approximately 40- to 200-fold (25), displaying significantly less selectivity than polymerases. It is generally believed that exonuclease relies on the “melting capacity” of the 3′ terminus to distinguish between correct and incorrect insertions (26, 27). It is reasoned that polymerization and proofreading are competing reactions at a primer-3′ terminus, requiring an annealed or melted terminus, respectively (16, 17). Discrimination arises because the 3′ terminus is more likely to be annealed following correct insertions, favoring polymerization, but much more likely to be melted out following incorrect insertions, favoring excision (16, 28). It is tempting to ask if a geometric selection mechanism might be occurring in the exonuclease active site, enhancing the excision of non-Watson𠄼rick base pairs beyond what would be expected based solely on the relative stabilities of base pairs in solution.

Qualitatively, differences in base pair stabilities appear to be sufficient. Evidence comes from presteady state kinetics measurements on the excision of 2AP paired opposite T, C, A, and G using bacteriophage T4 DNA polymerase (29). The rate of excision of 2AP from a primer-3′ terminus is inversely correlated with the melting temperature of 2AP⋅N base pairs imbedded in an oligomer DNA duplex. For example, when present in the same sequence context, a “stable” 2AP⋅T Watson𠄼rick base pair is hydrolyzed much more slowly than an unstable 2AP𢱜 wobble mispair. However, a terminal 2AP⋅T in a A-T rich environment is hydrolyzed more rapidly than 2AP𢱜 in a G-C rich environment. Thus, exonuclease specificity appears to be more strongly tied to DNA stability than to terminal base pair geometry.

Nevertheless, it would be of great interest to use proofreading-proficient polymerases to measure the excision of difluorotoluene. Based on thermal denaturation measurements, Moran et al. (2) demonstrate that F pairs poorly with all of the natural bases. Significantly, the magnitude of the free energy difference between F𢱚 and T𢱚 base pairs is 3.6 kcal/mol, similar to that found for C𢱚 versus T𢱚 base pairs (6). If proofreading activities are governed primarily by primer stability and not geometric selection, then one would expect F to be excised much more rapidly than T opposite A, and, furthermore, the rate of excision of F might be the same whatever natural bases with which it paired.

The surface has barely been scratched in terms of understanding the interactions between polymerases and DNA that determine replication fidelity. The magnitude and location of mutations depend on a complex interplay between polymerases, proofreading exonucleases, processivity factors and the properties of the DNA primer-template sequences. Although models have been proposed to include polymerase steady-state kinetic parameters along with base stacking and sequence context to explain fidelity (11), precise molecular mechanisms governing mutagenic hot and cold spots remain obscure. Different polymerases copying the same primer-template DNA can exhibit markedly different mutation frequencies and spectra. The ability to separate the effects of H bonding from base stacking holds the promise of new progress in these directions. The future use of the difluorotoluene T analog along with an anticipated group of other non-H bonding base analogs should enable a precise determination of the effects of nearest-neighbor base stacking on misinsertion frequencies and proofreading efficiencies, and shed light on how different polymerase and exonuclease active sites sense the presence of nearby primer and template bases.

I acknowledge the fundamental contribution of Hatch Echols in recognizing the importance of geometric selection in the determination of polymerase fidelity, and I thank D. Kuchnir Fygenson, John Petruska, Ken Breslauer, and Sharon Wald Krauss for their insightful, intellectual contributions and generous advice. This work was supported by the National Institutes of Health (GM21422) and by the Hedco Molecular Biology Laboratory at the University of Southern California.


B. DNA Polymerases Catalyze Replication

The first of these enzymes was discovered in E. coli by Arthur Kornberg, for which he received the 1959 Nobel Prize in Chemistry. Thomas Kornberg, one of Arthur&rsquos sons later found two more of DNA polymerases! All DNA polymerases require a template strand against which to synthesize a new complementary strand. They all grow new DNA by adding to the 3&rsquo end of the growing DNA chain in successive condensation reactions. And finally, all DNA polymerases also have the odd property that they can only add to a pre-existing strand of nucleic acid, raising the question of where the &lsquopreexisting&rsquo strand comes from! DNA polymerases catalyze the formation of a phosphodiester linkage between the end of a growing strand and the incoming nucleotide complementary to the template strand. The energy for the formation of the phosphodiester linkage comes in part from the hydrolysis of two phosphates (pyrophosphate) from the incoming nucleotide during the reaction. While replication requires the participation of many nuclear proteins in both prokaryotes and eukaryotes, DNA polymerases perform the basic steps of replication, as shown in the illustration below.

Although DNA polymerases replicate DNA with high fidelity with as few as one error per 107 nucleotides, mistakes do occur. The proofreading ability of some DNA polymerases corrects many of these mistakes. The polymerase can sense a mismatched base pair, slow down and then catalyze repeated hydrolyses of nucleotides until it reaches the mismatched base pair. This basic proofreading by DNA polymerase is shown below.

After mismatch repair, DNA polymerase resumes forward movement. Of course, not all mistakes are caught by this or other repair mechanisms (see DNA Repair, below). Mutations in the eukaryotic germ line cells that elude correction can cause genetic diseases. However, most are the mutations that fuel evolution. Without mutations in germ line cells (egg and sperm), there would be no mutations and no evolution, and without evolution, life itself would have reached a quick dead end! Other replication mistakes can generate mutations somatic cells. If these somatic mutations escape correction, they can have serious consequences, including the generation of tumors and cancers.


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The diagram must show four nucleotides shown with two on each side showing phosphate-sugar backbones and nitrogen base pairs bonded between them.

Award [1] for each of the following clearly drawn and correctly labelled.
phosphate – shown connected to deoxyribose
deoxyribose – shown connected to phosphate
(nitrogenous) bases – shown bonded to deoxyribose
base pairs – shown with labels adenine/A bonded to thymine/T and cytosine/C bonded to guanine/G
hydrogen bonds – shown connecting bases
covalent bonds – shown connecting deoxyribose to phosphates
nucleotide – clearly identified by the candidate
Award [4 max] if diagram is not shown double stranded.

DNA samples are taken from crime scene, suspects and victims
polymerase chain reaction/PCR used to increase the amount of DNA
restriction enzymes used to cut DNA
electrophoresis involves electric field/placing sample between electrodes
used to separate DNA fragments according to size
creating DNA profiles/unique patterns of bands
comparison is made between the patterns
criminals/victims can be identified in this way
DNA is (quite) stable / DNA can be processed long after the crime

DNA codes for a specific sequence of amino acids/polypeptide
the DNA code for one polypeptide is a gene
DNA is transcribed into mRNA
mRNA moves to a ribosome
where mRNA is translated into a polypeptide
originally it was thought that one gene always codes for one polypeptide
some genes do not code for a polypeptide
some genes code for transfer RNA/tRNA/ribosomal RNA/rRNA
some sections of DNA code for regulators that are not polypeptides
antibody production does not follow this pattern (of simple transcription-translation) (allow other examples)
change in the gene/mutation will affect the primary structure of the polypeptide


Lesson Explainer: DNA Replication Biología

In this explainer, we will learn how to describe the process of semiconservative DNA replication, including the role of different enzymes, and recall how errors made during DNA replication can be corrected.

One of the key characteristics of any living organism is its ability to grow and reproduce. Both of these processes, at the cellular level, involve simple cell division, or the splitting of one cell into two. We know that every living cell carries genetic material in the form of DNA (deoxyribonucleic acid). The genetic material controls every characteristic of a living cell, from its size and appearance to the functions it performs.

When one cell divides into two, therefore, each new cell must contain a copy of the DNA in its nucleus for it to be able to function properly. For example, when a liver cell divides into two new liver cells, each new cell must receive a copy of the original cell’s DNA, so that it can perform its role to support the natural functions of the liver.

Key Term: Deoxyribonucleic acid (DNA)

DNA is the molecule that carries the genetic instructions for life. It is composed of two strands of deoxynucleotides that coil around each other to form a double helix.

DNA replication is the process by which a dividing cell generates a copy of its DNA. As we know, in eukaryotes, a molecule of DNA resides in the nucleus and is made of two individual strands that coil around one another to form a “twisted ladder” shape called the double helix as we can see in Figure 1. The process of DNA replication takes place in the nucleus of the cell and is controlled by a set of enzymes, each of which performs a specific function. In this explainer, we will learn how DNA replication takes place and understand the roles played by each of the enzymes involved.

Key Term: Double Helix

A double helix is a “twisted ladder” shape, specifically the shape of a molecule of DNA.

Key Term: DNA Replication

DNA replication is the process by which two identical DNA molecules are produced from a single original DNA molecule.

Before we begin learning about DNA replication, let’s quickly go over the basic structure of a DNA molecule.

As we mentioned earlier, a molecule of DNA contains two strands coiled around one another. These two strands are called polynucleotide chains, and they are made of repeating smaller units called nucleotides. As we can see in Figure 1, each nucleotide has three components: a pentose sugar, a phosphate group, and a nitrogenous base. Each nucleotide links to the next through covalent bonds called phosphodiester bonds.

Key Term: Nucleotide

A nucleotide is a monomer of a nucleic acid polymer. Nucleotides consist of a pentose sugar, a phosphate group, and a nitrogenous base.

The two polynucleotide chains connect to one another through the pairing of the nitrogenous bases facing each other on the inside of the ladder. In DNA, there are four different types of nitrogenous bases: adenine (A), guanine (G), thymine (T), and cytosine (C).

When the nitrogenous bases on one strand pair with the nitrogenous bases on the opposite strand, they follow certain base-pairing rules. In a molecule of DNA, adenine can only bind to thymine on the opposite strand, and guanine can only bind to cytosine. This rule is called “complementary base-pairing” and is one of the defining features of DNA. Adenine binds to thymine through two hydrogen bonds, while guanine binds to cytosine through three hydrogen bonds, as shown in Figure 2.

Key Term: Complementary Base-Pairing

DNA bases can pair according to specific rules, where adenine (A) binds to thymine (T), while guanine (G) binds to cytosine (C). In RNA, uracil (U) is substituted for thymine (T). These rules of complementary base-pairing are critical for DNA replication and transcription.

Another important feature of DNA is its antiparallel nature. Each DNA strand has two ends: one end is called the

end, and the other end is called the

fin. These two ends are named for the last carbon atoms of the nucleotide at each end. The two strands are antiparallel as one strand runs in the

direction, while the other runs in the

direction, as shown in Figure 3.

carbon atom of every nucleotide is bonded to a hydroxyl group (

end of a strand of DNA, therefore, ends with a hydroxyl group, as you can see in Figure 3. The

carbon atom of every nucleotide is bonded to a phosphate group. los

end of a strand of DNA, therefore, ends with a phosphate group, represented by the yellow circles in Figure 3.

A molecule of DNA carries genetic information in the form of a genetic code, formed by the sequence of nitrogenous bases. A type of RNA called messenger RNA or mRNA is synthesized according to the sequence of DNA. This sequence encodes the information needed for the synthesis of proteins, which then go on to control the cell’s functions and characteristics.

Key Term: Genetic Code

The genetic code is formed by the sequence of nitrogenous bases in a strand of messenger RNA (mRNA) molecule that is synthesized from the DNA and codes for the information needed for a cell to synthesize specific proteins.

So how is this genetic code read? When we read English, we always read from left to right. Similarly, when a cell “reads” the sequence of nitrogenous bases to interpret the genetic code, it is read from the

end of the DNA strand to the

In 1953, when James Watson and Francis Crick proposed the double helix model of DNA that we are familiar with today, they also made an interesting observation about DNA replication. Their model was based on the base pair specificity of the two strands in a DNA molecule. They realized that the two strands carry complementary versions of the same sequence. Because of this feature, both strands of DNA in a molecule could potentially be used as templates to synthesize complementary strands creating two new double helices with the same information! The sequence of nitrogenous bases on each strand is used as a guide for the sequence of new, complementary bases required to make up the new strand.

In eukaryotes, which are organisms with a well-organized nucleus, the DNA within the nucleus is present in the form of highly coiled, linear structures called chromosomes. Each chromosome contains one molecule of DNA, and within each molecule, replication begins at several different points.

In prokaryotes, on the other hand, the genetic material is present in the form of a single, circular molecule of DNA in the central area of the cell but is not surrounded by a nuclear membrane. In this case, replication begins at one point, called the origin of replication.

Now that we have had a quick recap of the structure of a molecule of DNA, let’s take a look at the mechanism of DNA replication. This process is controlled by three main enzymes. Let’s walk through the steps of this process and learn about each of the enzymes as we go along.

In order for the two strands of a DNA molecule to be used to make two new DNA molecules in the nucleus, the two strands must unwind and separate, making their nitrogenous bases accessible. We know that the strands are held together by hydrogen bonds between the nitrogenous bases of the two strands. In order for the strands to separate, these hydrogen bonds must be broken. This is accomplished by an enzyme called DNA helicase.

Key Term: DNA Helicase

DNA helicase is the enzyme responsible for separating or unwinding two complementary strands of DNA by breaking the hydrogen bonds between them, creating the replication fork in preparation for DNA replication.

Figure 4 shows how the strands of DNA separate through the action of DNA helicase. As the hydrogen bonds between the two strands are broken, a “replication fork” is formed, which is so named because the two unwinding strands of DNA have a forked appearance. The replication fork is the point at which the DNA molecule unwinds into two separate strands. You can picture the DNA helicase enzyme “unzipping” the molecule of DNA, beginning at the replication fork.

Key Term: Replication Fork

The replication fork is formed by the two separated or unwound strands of DNA in preparation for DNA replication.

Example 1: Understanding the Role of DNA Helicase

In the process of DNA replication, what is the primary role of DNA helicase?

  1. DNA helicase detects and repairs any errors that are made by incorrect base-pairing during DNA replication.
  2. DNA helicase breaks the hydrogen bonds between base pairs, separating the two strands of DNA.
  3. DNA helicase forms phosphodiester bonds between nucleotides to form a strand of DNA.
  4. DNA helicase adds nucleotides to a growing DNA chain, synthesizing a strand of DNA complementary to the template strand.
  5. DNA helicase joins the gaps in the backbone between newly formed DNA fragments.

Respuesta

When a cell undergoes division, its DNA replicates itself, so as to provide each new cell with a copy of DNA, which can control the cell’s characteristics and functions. We know that a single molecule of DNA is composed of two complementary polynucleotide strands. Each of these strands is made up of multiple individual units called nucleotides that form a sequence of nitrogenous bases. The order or sequence of nitrogenous bases along a strand of DNA encodes the “genetic information” that needs to be replicated when a cell divides.

When two strands of DNA bind together to form the familiar double helix shape, they do so by pairing their nitrogenous bases according to the rules of complementary base-pairing, in which adenine binds to thymine through two hydrogen bonds and guanine binds to cytosine through three hydrogen bonds.

The sequence of nitrogenous bases on each strand of DNA in the double helix acts as a template for the formation of a new strand of DNA. In order for this to happen, the two strands of DNA must unwind and separate, so that their nitrogenous bases are accessible. This function is carried out by the enzyme DNA helicase. DNA helicase breaks the hydrogen bonds between the nitrogenous bases on each strand, “unzipping” the DNA and separating the two strands.

Now that we have this information, let’s take a look through the options in the question. The one that best fits what we have learned is “DNA helicase breaks the hydrogen bonds between base pairs, separating the two strands of DNA,” and therefore, this is the correct option.

Once the strands have unwound, new strands of DNA that are complementary to each of the original strands can be synthesized. This is where an enzyme called DNA polymerase comes into play. The word “polymerase” is used to describe an enzyme that binds individual small units (nucleotides, in the case of DNA) together to form a long, repeating chain or polymer (a DNA strand). As we have learned, a molecule of DNA is a polymer made of multiple individual units called nucleotides.

Key Term: DNA Polymerase

DNA polymerase is an enzyme that adds nucleotides complementary to the template strand to synthesize a new strand. This enzyme plays an essential role in DNA replication.

DNA polymerase generates a new strand of DNA along each original strand by adding nucleotides to the new strand, ensuring that the rules of complementary base-pairing, which we learned about earlier, are followed. To build the new strand of DNA, the DNA polymerase uses a pool of free-floating nucleotides that remain available in the cell. Figure 5 represents a simple diagram of the action of DNA polymerase.

The DNA polymerase enzyme is a highly efficient one it synthesizes complementary strands very rapidly and with a high level of accuracy. Another important feature of this enzyme is that it can only synthesize a new strand of DNA in the

dirección. This feature poses a problem in a dividing cell. You might be wondering how! Well, let’s take a look at a replication fork in a strand of DNA. As we know, the two strands of DNA run antiparallel to one another. As you can see in Figure 6, the strand at the top of the image has a

open end at the fork, while the strand at the bottom has a

As new strands of DNA are synthesized, they must also run antiparallel to their complementary original strand. Although the two new strands are synthesized simultaneously, let’s first consider the formation of a new strand along the strand at the top of the figure, bearing in mind the fact that DNA polymerase can only synthesize a new strand in the

dirección. In this case, a new strand is able to form continuously, without any interruptions or breaks.

Let’s now consider the strand at the bottom. As the DNA molecule unwinds, DNA polymerase encounters the

end of this strand. This would require a new complementary strand to be synthesized in the

direction, which DNA polymerase cannot do!

The DNA polymerase works around this problem by moving further along the strand, as shown in the figure, and synthesizing a short fragment of new DNA in the

direction, toward the open end of the replication fork. It then moves further along, behind this fragment, and does the same, synthesizing another short fragment. As the enzyme progresses along the strand, a discontinuous complementary strand begins to take shape. In Figure 8, you can see how this happens.

These fragments are called Okazaki fragments. If you now take a look at the molecule of DNA, you can see that along one template strand, a new strand is formed continuously, in the same direction as the opening fork, with no breaks. This template strand is therefore called the “leading strand.” The opposite template strand is called the “lagging strand,” since the new strand of DNA is synthesized discontinuously in fragments.

Key Term: Leading Strand

In DNA replication, the leading strand is the strand of DNA along which the new strand is synthesized continuously, in the same direction as the fork.

Key Term: Lagging Strand

In DNA replication, the lagging strand is the strand of DNA along which the new strand is synthesized discontinuously, in fragments.

Key Term: Okazaki Fragments

Okazaki fragments are the short fragments of DNA that are synthesized discontinuously along the lagging strand during DNA replication.

Another enzyme, DNA ligase, is responsible for joining these fragments together along the lagging strand. As you can see in Figure 9, DNA ligase moves along the fragmented strand, joining or “ligating” the fragments together by forming new phosphodiester bonds between one fragment and the next.

Key Term: DNA Ligase

DNA ligase is an enzyme that can join the gaps between the sugar–phosphate backbone of DNA by forming a phosphodiester bond.

Example 2: Understanding the Role of DNA Ligase

In semiconservative DNA replication, what is the primary role of DNA ligase?

  1. DNA ligase adds nucleotides to a growing DNA chain to synthesize a strand of DNA complementary to the template strand.
  2. DNA ligase joins the backbones of fragments formed on a complementary strand during replication.
  3. DNA ligase catalyzes the breaking of phosphodiester bonds in the sugar–phosphate backbone, so the DNA can be split into fragments that are ready for replication.
  4. DNA ligase breaks the hydrogen bonds between base pairs, separating the two strands of DNA that are ready for replication.
  5. DNA ligase joins RNA primers to the

Respuesta

When a molecule of DNA replicates, it unwinds so as to separate the two individual strands. Along each of these strands, a new strand of DNA is synthesized by the enzyme DNA polymerase, following the rules of complementary base-pairing.

We know that each strand of DNA has a

end and that the two strands of DNA in a DNA molecule must always run antiparallel, or in opposite directions, to one another. When synthesizing a new strand of DNA, DNA polymerase is only capable of adding nucleotides in the

Because of this feature of DNA polymerase, the two DNA strands in the molecule are replicated using two different methods. Along the “leading strand,” whose

end is at the opening of the replication fork, DNA polymerase can synthesize a continuous, unbroken complementary DNA strand. Along the “lagging strand,” whose

end is at the opening of the replication fork, DNA polymerase must instead synthesize short fragments of DNA in the

direction, as shown in the figure.

The fragments formed along the lagging strand are called Okazaki fragments. In order for the fragments to be functional, they must be joined together to form one long, continuous strand of newly synthesized DNA. This function is accomplished by DNA ligase that joins the sugar–phosphate backbones of adjacent fragments through phosphodiester bonds.

Let’s now take a look at the options provided in the question. The sentence that best fits the information we now have about DNA ligase is “DNA ligase joins the backbones of fragments formed on a complementary strand during replication.” This is therefore the right answer.

We have now been over the roles of the three important enzymes involved in DNA replication and have understood the mechanism of this process. Figure 10 shows a simple overview of how the whole process takes place and what the result of this process will be.

Let’s take a close look at each of the new DNA molecules on the right side of Figure 10. You may notice that each new DNA molecule contains one original strand and one newly synthesized strand. Because of this feature, the process of DNA replication is called “semiconservative replication”: the older strands of DNA are conserved as the molecule of DNA replicates.

Key Term: Semiconservative Replication

Semiconservative replication describes the mechanism of DNA replication in all living cells, in which each new DNA molecule is composed of one original strand of DNA and one newly synthesized strand of DNA.

Earlier on in this explainer, we talked about the genetic code formed by the sequence of nitrogenous bases along a strand of mRNA, which is synthesized from DNA. When a cell “reads” the sequence, it can interpret this information to produce specific proteins, which then go on to control the characteristics of the organism. Sections of DNA that contain a sequence of bases that code for a specific protein are called genes, which is a word you might have heard before.

Although the process of DNA replication is accurate and highly efficient, it is not completely error free. What would happen if, during DNA replication, the DNA polymerase were to make an error in adding a new nucleotide to the new strand? At one point, instead of adding a complementary nucleotide according to rules of base-pairing, what if a different nitrogenous base were accidentally added? Can you think about what this would mean?

On the newly synthesized DNA strand, this specific point in the strand would change the genetic code. You can think of this as something similar to a spelling mistake in a sentence. These errors, which are called mutations, can sometimes have serious consequences. Let’s consider a quick example. You might remember learning about hemoglobin, the molecule that carries oxygen in our blood. If the gene that codes for hemoglobin is mutated, the hemoglobin protein will be produced incorrectly. This can cause a condition called sickle cell anemia, which distorts the shape of the red blood cells in the body.

Key Term: Mutation

A mutation is an error or an alteration in a sequence of nucleotides.

In order to prevent such errors from arising during DNA replication, the enzyme DNA polymerase performs another crucial function. As it adds nucleotides to the growing new strand, it also “proofreads” or checks its own work. In this way, if the wrong nucleotide has accidentally been added, DNA polymerase will identify the error and swap the wrong nucleotide for the right one! It does this through exonuclease activity, which means it removes incorrect nucleotides and replaces them with correct ones. You can see an example of this in Figure 11.

As we learned earlier, DNA ligase is an enzyme that joins fragments of DNA together by forming new phosphodiester bonds, linking the fragments. When DNA is physically damaged, causing breaks in the strands, DNA ligase can function as a DNA repair enzyme. It uses the complementary strand of the DNA double helix as a template to form new phosphodiester bonds.

DNA repair, therefore, depends on the presence of two strands carrying the genetic information. When one strand is damaged, the intact information on the complementary strand can be used by DNA repair enzymes to replace the damaged sections. This is why it is so important for DNA replication to be an accurate, error-free process!

Example 3: Understanding how Proofreading Eliminates Errors During DNA Replication

When errors in DNA replication occur, the newly formed strand can be proofread and be recognized as not being complementary to the original strand. Which enzyme is responsible for correcting these errors during replication?

Respuesta

When a cell undergoes division, its DNA replicates itself, so as to provide each new cell with a copy of DNA which can control the cell’s characteristics and functions. We know that a single molecule of DNA is composed of two complementary polynucleotide strands. Each of these strands is made up of multiple individual units called nucleotides, which form a sequence of nitrogenous bases. The order or sequence of nitrogenous bases along a strand of DNA encodes the “genetic information” that needs to be replicated when a cell divides.

The enzyme DNA polymerase synthesizes new strands of DNA that are complementary to each of the original strands, by following the rules of complementary base-pairing: adenine binds to thymine through two hydrogen bonds, and guanine binds to cytosine through three hydrogen bonds.

The genetic information carried in these strands is crucially important to the normal functioning of a cell, as it forms a genetic code that provides the cell with instructions for the production of proteins. The process of DNA replication, though accurate, is not foolproof, which means that sometimes errors can arise in the new sequence, when a noncomplementary nitrogenous base is accidentally added.

Every word in the English language has a specific meaning. If a word is written down with a spelling mistake in it, the meaning of this word would be lost! This is similar to what happens when errors arise in a DNA sequence, which are also called mutations. Mutations in DNA can lead to several different diseases and disorders.

In order to prevent mutations during DNA replication, the enzyme DNA polymerase “proofreads” its own work, checking that each new nucleotide is complementary to the original strand as it goes along. If it detects an error, or a noncomplementary nucleotide, it quickly replaces this with the correct one!

The answer to this question is, therefore, DNA polymerase.

Let’s summarize the key points we have learned from this explainer.

Puntos clave

  • When a living cell divides, its DNA must replicate so that each new cell receives a copy of DNA.
  • DNA replication is a semiconservative process.
  • In order for a molecule of DNA to replicate, the two strands must first unwind. DNA helicase is responsible for this and “unzips” the DNA molecule by breaking the hydrogen bonds between the nitrogenous bases.
  • DNA polymerase synthesizes new strands of DNA along each template strand by adding complementary nucleotides to the chain.
  • DNA polymerase can only synthesize DNA in the


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