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2.4: Procedimientos de laboratorio: preparación de medios sólidos, técnica aséptica, rayado en T: biología

2.4: Procedimientos de laboratorio: preparación de medios sólidos, técnica aséptica, rayado en T: biología


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Resultado de aprendizaje

  • Para familiarizarlo con los dos tipos de medios de cultivo, Caldo de nutrientes y Agar nutriente.
  • Familiarizarte con la técnica aséptica.
  • Aprender a aislar un cultivo puro.
  • Observar la ubicuidad y diversidad de microorganismos.

Técnica aséptica

El ser humano promedio se compone de aproximadamente 1013 células animales eucariotas y 1014células microbianas eucariotas y procariotas asociadas. Esto significa que el 90% de "sus" células no son humanas.

El propósito de este ejercicio es familiarizarlo con las técnicas asépticas. La técnica aséptica se puede considerar como la manipulación de instrumentos o medios de cultivo estériles de tal manera que se mantenga la esterilidad.

En la naturaleza, los microorganismos casi siempre existen como poblaciones mixtas de muchos tipos muy diferentes. Sin embargo, antes de poder determinar la mayoría de las propiedades y características de un organismo en particular, el organismo debe aislarse primero en cultura pura. Un cultivo puro es aquel que contiene una única cepa de microorganismo. Por ejemplo, un cultivo puro de la bacteria. Escherichia coli contiene solo Escherichia coli células de una cepa particular: no hay otros microorganismos vivos presentes. El término cepa se refiere a una población de células que descienden todas de una sola célula. El aislamiento y mantenimiento de cultivos puros es uno de los procedimientos más importantes en microbiología, y uno con el que todos los estudiantes deben estar familiarizados.

Como todos los demás organismos, los microorganismos requieren nutrientes y un ambiente favorable para crecer y multiplicarse. Los microbios generalmente se cultivan en una medio cultural que contiene nutrientes esenciales y proporciona un entorno adecuado (por ejemplo, pH adecuado). Los microbios se cultivan esencialmente en un medio líquido., caldo, o en un medio sólido, agar.

Dado que la mayoría de los estudios de laboratorio se realizan con cultivos puros, es necesario esterilizar medios de cultivo, es decir, eliminar completamente todos los organismos vivos. Este medio debe mantenerse en un estéril condición, libre de organismos vivos, hasta que sea inoculado con un cultivo puro.

Para desarrollar un cultivo microbiano en un medio esterilizado, varias células, el inóculo, se transfieren, inoculan al medio o sobre él, con precauciones especiales para mantener la pureza del cultivo. Los procedimientos utilizados en el laboratorio de microbiología para prevenir la contaminación de cultivos puros se denominan comúnmente técnica aséptica.

Las reglas generales para seguir una técnica aséptica son: 1) no coloque nada en material estéril que no sea estéril en sí mismo, excepto el organismo específico que está estudiando y, 2) no exponga los materiales estériles a fuentes de contaminación, por ejemplo, aire de laboratorio.

Después de la inoculación, se cultiva un cultivo microbiano. (incubado) en un entorno específico favorable al crecimiento. El crecimiento de microbios generalmente se define en términos de población crecimiento, un aumento en el número de células en la población, a diferencia de celular crecimiento, un aumento en el tamaño de una celda individual. El crecimiento resultante es visible como nubosidad, turbidez, en un medio líquido o como una masa aislada., colonia, en un medio sólido.

Materiales:

Culturas

Escherichia coli (cultivo de caldo)

Serratia marcescens

cultivo de caldo mixto de Escherichia coli y Serratia marcescens

Medios de comunicación

un frasco de agar nutritivo estéril

tres tubos de caldo nutritivo estéril

tres placas de agar nutritivo, presecadas durante 2 días a temperatura ambiente

Suministros

cuatro placas de Petri de plástico estériles

hisopos de algodón esterilizados

El propósito de este ejercicio es familiarizarlo con las técnicas asépticas. Todos los procedimientos se han diseñado para minimizar la contaminación. Observe la demostración de su instructor de laboratorio y siga exactamente los procedimientos descritos en el manual. Coloca el bacticinerador frente a ti y coloca todos los tubos y demás equipos en un lugar adecuado que te permita alcanzarlos sin ninguna dificultad y sin quemarte.

Al principio, estos procedimientos para manipular el asa, los tubos y las tapas serán difíciles, pero con la práctica, estas manipulaciones se volverán más rápidas y menos engorrosas.

Funcionamiento del Bacticinerator:

El bacticinerator es un esterilizador de calor sin gas y sin llama para usar con bucles de inoculación, agujas, bocas de tubo / pipeta de vidrio y varios instrumentos de vidrio de borosilicato y metal. La esterilización se realiza mediante calor infrarrojo. OPERACIÓN: Encienda el interruptor de palanca a la "Posición alta; la luz indicadora roja se encenderá cuando el interruptor esté en la posición correcta. El esterilizador debe calentarse durante 15 minutos antes de su uso. Sosteniendo el asa de inoculación por el mango, inserte suavemente el asa de inoculación que se va a esterilizar en el área de esterilización cilíndrica (vea la imagen a continuación). Asegúrese siempre de que el artículo se sostenga con un material aislante. No toque directamente el artículo esterilizado. No "estacione" el bucle allí sin querer, se DERRETIR. Evite raspar los lados del elemento para asegurar la longevidad del bucle y el elemento calefactor. Mantenga el bucle durante 5 segundos. No es necesario que el bucle brille. La protección exterior de metal del elemento calefactor puede alcanzar temperaturas de hasta 400 ° F. No toque el escudo metálico exterior o introducir cualquier material inflamable o volátil en el área que rodea al esterilizador.

Apague el bacticinerator después de que haya terminado de usarlo para los ejercicios de laboratorio del día.

A. Preparación de medios sólidos

El medio sólido generalmente se prepara agregando un agente solidificante a un medio de caldo. El agente solidificante más común es el agar, una sustancia obtenida de las algas marinas y disponible en forma seca y purificada. Aunque los diferentes agares varían considerablemente en sus propiedades físicas, el punto de fusión habitual es 97-100 ° C. Por tanto, se puede añadir agar sólido a medios de cultivo líquidos y fundir durante la esterilización por calor. Después de la esterilización, este medio líquido se puede verter en tubos de ensayo, botellas o placas de Petri. Al enfriar, este medio que contiene agar solidifica a aproximadamente 42 ° C. Una vez solidificado, el medio de agar se puede incubar en todo el rango de temperaturas que probablemente use un bacteriólogo (hasta 70 ° C, quizás) sin derretirse.

Un agar inclinado resultados cuando se deja endurecer el medio de agar fundido caliente en un tubo de ensayo mantenido en una posición inclinada. Verter un medio de agar fundido en placas de Petri de plástico o vidrio hace placas de agar.

1. Coloque las cuatro placas de Petri estériles con el lado derecho hacia arriba frente a usted.

La parte inferior de una placa de Petri es más pequeña y más profunda que la parte superior, a menudo llamada tapa. Por lo tanto, el lado derecho hacia arriba es cuando la parte inferior está en contacto con el banco y la tapa más grande cubre la parte inferior.

2. Encienda su bacticinerator.

3. Debe trabajar rápidamente ahora para evitar que el agar se solidifique antes de que termine de verter las placas. Retire una botella de medio de agar nutritivo derretido del baño de agua a 55 ° C. Limpie con cuidado el agua adherida a la botella para que, cuando la incline, esta agua contaminada no entre en el plato.

4. Afloje la tapa de la botella pero no la quite. Cuando la tapa esté completamente aflojada, retírela rodeando la tapa con su dedo meñique derecho o izquierdo y el borde exterior de su palma. Vea la Figura 1-1 a. No coloque la tapa sobre la mesa.

5. Mientras todavía sostiene la tapa, agarre la botella firmemente con el pulgar y el índice de su mano derecha. Consulte la Figura 1. Pase ligeramente el borde de la botella frente al bacticinerator para quemar el polvo adherido y también para crear una corriente de aire negativa. El borde de la botella quedaría estéril por el procedimiento de esterilización en autoclave.

6. Levante la tapa de una placa de Petri con la mano izquierda o derecha lo suficiente para permitirle verter un poco del medio de agar en el fondo de la placa de Petri. Vea la Figura 1-1b.

7. Vierta suficiente medio en el fondo de la placa de Petri para cubrir solo la superficie del fondo. (Debería poder verter fácilmente cuatro platos y posiblemente cinco con 100 ml de medio).

8. Vuelva a colocar la tapa para cubrir la parte inferior de la placa de Petri.

9. Deslice con cuidado y lentamente los platos vertidos a una parte no perturbada (trasera) de su mesa de trabajo para enfriar y solidificar. No mueva estas placas durante al menos 20 minutos.

10. Estas placas se utilizarán en la parte D de este ejercicio.

B. Transferencias asépticas

Para el microbiólogo, la transferencia de cultivos de un tubo a otro y de las placas de agar a los tubos es un procedimiento común y simple, pero requiere una cuidadosa atención a ciertos detalles. La transferencia de microorganismos a menudo se realiza mediante un bucle de alambre. El uso adecuado de este asa de inoculación ayudará a asegurar el mantenimiento de un cultivo puro.

1. Etiquete los 3 tubos de caldo nutritivo estéril. Etiquete un "control estéril", una "transferencia de caldo" y una "transferencia de colonias".

2. Los cultivos de caldo de Escherichia coli y cultivo en placa de Serratia marcescens están al final de su banco.

3. Sosteniendo su lazo como un lápiz, inserte el lazo en el área cilíndrica del bacticinerator. Caliente solo el alambre en el esterilizador, NO el soporte de alambre. Si se hace correctamente, solo debe tomar 5 segundos para que toda la longitud del alambre sea estéril. Una vez que esto haya ocurrido, elimine el bucle. El cable ahora será estéril y muy caliente. Deje que el bucle se enfríe durante varios segundos en el aire antes de usarlo. Esto evita matar las células a transferir y salpicaduras que pueden conducir a la producción de aerosoles contaminantes.

3a. Ahora tome el tubo que contiene el cultivo puro. de Escherichia coli con la otra mano, sin dejar de sostener el estéril círculo. Con la mano que sostiene el lazo, retire la tapa del tubo de cultivo rodeándolo con el dedo meñique y el borde exterior de la palma. Ver Figura l. NO pon la gorra en tu banco. Pase ligeramente el borde del tubo por delante del bacticinerator.

4. Ahora inserte el lazo en el E. coli caldo de cultivo y luego retírelo, realizando un loopful de cultivo del tubo. Ver Figura 2. Vuelva a colocar la tapa del tubo y devuelva el tubo a la rejilla de almacenamiento.

5. Levante y retire la tapa del tubo de caldo nutritivo estéril etiquetado como "transferencia de caldo" de la misma manera que se describe en el paso 3a anterior.

6. Incline el tubo en un ángulo de aproximadamente 45 ° e inserte el asa que contiene el cultivo en el tubo abierto. Sumerja el bucle en el caldo, gírelo suavemente y luego retírelo. Pase el tubo por delante del bacticinerador y vuelva a colocar la tapa y devuelva el tubo a la rejilla de almacenamiento.

7. Esterilice el asa antes de colocarlo repitiendo el paso 3. Esto es necesario para evitar la contaminación del banco con el cultivo.

8. Ahora, con la otra mano, levante la tapa de la placa de Petri que contiene un cultivo puro del Serratia marcescens. Obtenga un inóculo SOLO TOCAR UNO de las colonias individuales aisladas en la superficie del agar. No excave en el agar. No raspe el lazo por la superficie de la placa. Reemplace la tapa del plato inmediatamente.

9. Levante y retire la tapa del tubo de caldo nutritivo estéril etiquetado como "transferencia de colonias" de la misma manera que se describe en el paso 3a anterior.

10. Repita los pasos 6 y 7.

11. Para probar su capacidad para esterilizar adecuadamente su asa, elija un asa del cultivo del E. coli tubo de cultivo de caldo siguiendo los procedimientos descritos en los pasos 3, 3a, 4. Esterilice adecuadamente el asa que contiene el cultivo bacteriano, como en el paso 7.

12. Levante y retire la tapa del tubo de caldo nutritivo estéril etiquetado como "control estéril" de la misma manera que se describe en el paso 3a anterior e inserte el asa en el caldo como se describe en el paso 6.

13. Repita los pasos 11 y 12 varias veces con el mismo tubo de "control estéril".

C. Placas de racha

La técnica de la placa de rayas es un método rápido y simple de aislar bacterias extendiéndolas mecánicamente sobre la superficie de agar de una placa de Petri. El propósito es obtener colonias bien aisladas, cada uno derivado de una sola bacteria, de modo que se pueda establecer un cultivo puro de cada especie deseada en una mezcla. El rayado adecuado de las placas es una habilidad relativamente simple pero indispensable que se requiere de cualquier microbiólogo.

El método básico para la preparación de una placa de rayas consiste en esparcir un solo asa de inóculo sobre la superficie del medio de agar. Hay muchas técnicas diferentes que se utilizan para rayar placas. La elección de una técnica es una cuestión de preferencia y criterio individual. Se puede utilizar cualquier método siempre que se logre el objetivo, la producción de colonias bien aisladas y no exista evidencia de contaminación. El procedimiento que se describe a continuación se denomina comúnmente "raya en T", después de la marca realizada en la parte inferior de la placa.

1. Dibuje una línea, aproximadamente un tercio del camino hacia abajo, a lo largo de todo FONDO del plato. Luego dibuja una segunda línea desde el medio de la primera a través del centro hasta el otro lado del plato. Esto debería hacer una gran "T" en su plato, dividiéndolo en tres sectores. Vea la Figura 1-4.

2. Etiquete el fondo de cada una de las 3 placas de agar nutritivo preparadas con su nombre o iniciales, la sección de su laboratorio y la especie bacteriana que se utilizará. Además, marque uno "de caldo", uno "de agar" y un "cultivo mixto".

3. Utilice las técnicas asépticas que aprendió en la parte B. Esterilizar el lazo y dejar que se enfríe..

Obtenga un inóculo de células bacterianas de:

• el tubo de caldo que contiene un cultivo puro de Escherichia coli

• la placa de agar de Serratia marcescens

• el tubo de caldo que contiene un cultivo mixto proporcionado por su instructor.

Al obtener muestras de colonias que crecen en placas de agar, es SOLAMENTE necesario y se advierte que el bucle SOLO TOCA LA SUPERFICIE de UNO colonia.

Al obtener muestras de cultivos de caldo, asegúrese de MEZCLA el contenido para asegurar una distribución uniforme de los microorganismos.

4. Inocular la superficie de las placas de agar usando el patrón que se muestra en la figura 1-5 y la técnica que se describe a continuación.

a) depositar el inóculo tocando el asa en la superficie de la placa cerca
el borde, en el sector superior del plato. Dibuja el bucle ligeramente a través de
superficie del agar durante 2 cm, desde el borde hacia el centro.

El manejo de la placa se puede lograr de varias formas, todas las cuales intentan minimizar la posible contaminación. Su instructor de laboratorio le demostrará una o varias técnicas posibles. Para todo lo siguiente, no mantenga la superficie de agar de la placa sin cubrir innecesariamente, solo exponga la superficie durante el proceso de rayado.

• El plato permanece con el lado derecho hacia arriba en el banco y la tapa se levanta pero se mantiene sobre el plato mientras se raya. Vea la figura l-6a.

• La placa se invierte y mientras la tapa permanece en el banco, la parte inferior se levanta y la superficie del agar se raya desde abajo. Vea la figura l-6b.

Luego esterilice el asa y déjela enfriar en el aire durante unos segundos. Toque el asa en un borde no utilizado (área estéril) de la superficie del agar para enfriarlo por completo antes de continuar.

b) Comenzando en el borde de la placa cerca del depósito de inóculo inicial, haga
varias (10-20) rayas paralelas que atraviesan el inóculo original
depositar. Cubra un tercio de la placa, comenzando por el borde y moviéndose
hacia el centro del plato. Haga esto girando el soporte de bucle hacia atrás
y hacia adelante en la superficie del agar con una presión muy suave y uniforme,
utilizando sólo un movimiento de muñeca. El bucle casi debería volver sobre su camino con
cada oscilación a medida que se mueve hacia abajo de la superficie del agar desde el borde hacia el
centro del plato. Intente mantener el bucle, el cable y el soporte de bucle en un plano
paralelo a la superficie del agar a lo largo de la racha. Trate de no levantar el
bucle fuera del agar. Trate de mantener el bucle en contacto con la superficie de
el principio de la racha hasta el final. No excave el asa en el agar.
medio,

* Esterilice el lazo y déjelo enfriar como se describe arriba.

c) Gire la placa 90 °.

Jale el bucle a través de un borde de las rayas anteriores 2 o 3 veces para volver a inocular el bucle. Ahora raye el segundo tercio de la placa con varias (10-20) rayas más paralelas de nuevo comenzando en un borde y moviéndose hacia el centro de la placa. Después de la reinoculación inicial, Evite tocar el primer tercio ya rayado de la placa.

* Esterilice el lazo y déjelo enfriar como se describe arriba.

d) Gire la placa 90 °.

Jale el bucle a través de un borde de las rayas en el segundo tercio de la placa para volver a inocular el bucle. Ahora raye el último tercio de la placa como se indica arriba, teniendo cuidado de Evite los primeros y segundos tercios ya rayados del plato.

* Esterilizar el lazo después de la última raya..

D. Ubicuidad de los microorganismos

Los microorganismos están en todas partes. El laboratorio está poblado con muchos tipos diferentes de microbios, en el aire, en los bancos, en el piso y en su ropa y cuerpo. Esta omnipresencia de microorganismos es una de las razones por las que ha aprendido buenas técnicas asépticas en las partes A, B y C de este ejercicio. Esta parte del ejercicio está diseñada para darle una idea del tipo y la cantidad de microbios que están presentes en el laboratorio. También hay cierta libertad que le permite satisfacer su curiosidad acerca de los microorganismos que lo rodean. Finalmente, se le pedirá que aísle una de las especies bacterianas que obtenga de este ejercicio para utilizarla en los dos ejercicios siguientes.

1. Verifique que el agar se haya solidificado en sus placas de la parte A inclinando cuidadosamente las placas y buscando movimiento. Si el agar es sólido, puede trabajar con las placas. Etiquete una placa en la parte inferior como "control estéril". No abra esta placa en ningún momento. Esto se usa para verificar si tiene una buena técnica aséptica cuando vertió sus platos.

2. Utilice una placa para probar la contaminación natural de los artículos en su entorno. Etiquete esto como su "placa de prueba" y con la fuente "dedo, teléfono celular, etc." Los experimentos sugeridos incluyen: ligeramente frotar los dedos (sin guantes) sobre la superficie de agar de la placa, llamar a esto "placa de prueba, dedo", o abrir un plato al aire durante 15-20 minutos, o toser en un plato, o limpiar suavemente la superficie del agar con un objeto de su bolsillo o mochila. También es posible tomar muestras de una superficie, como la mesa, el piso, el fregadero, la ropa o la piel. Si desea hacerlo, limpie la superficie con un hisopo de algodón estéril y luego raye el completo superficie de agar de la placa con el hisopo. Usa un toque ligero. Los hisopos están empaquetados individualmente y son estériles hasta que los contamines con algo de tu elección. Asegúrese de que la punta de algodón del hisopo no entre en contacto con nada más que la superficie que está probando. Un hisopo húmedo funciona mejor para recolectar muestras de una superficie seca. Puede humedecer un hisopo en la superficie de la placa de agar nutritivo (en una esquina), luego muestrear el área de interés.

3. Deje las dos placas restantes sin etiquetar y sin abrir en el banco, estas son placas adicionales para que el TA las recoja y las use en la siguiente clase.

4. Recuerde etiquetar la parte inferior de su placa de muestra. Incluya su nombre o iniciales, la sección de su laboratorio, la fecha, el tipo de medio (NA para agar nutritivo) y lo que se muestreó (fuente).

MI. Incubación

Para que los microorganismos crezcan necesitan un entorno adecuado. Uno de los parámetros ambientales más críticos que afectan el crecimiento de microorganismos es la temperatura. Esto se discutirá en la conferencia y es parte de un ejercicio posterior. Para la mayoría de los organismos utilizados en este laboratorio,

30 ° C es una temperatura aceptable para el crecimiento. Las temperaturas de crecimiento constantes se mantienen incubando cultivos microbianos en habitaciones controladas termostáticamente o en pequeños hornos llamados incubadoras.

1. Incube todos los tubos de la parte B en la incubadora a 30 ° C. Asegurarse etiquetado de su tubos es claro y completo. Coloque los tubos en las rejillas provistas por su instructor.

2. Incube todas las placas de las partes C y D en la incubadora a 30 ° C. Asegurarse etiquetado de tus platos es clara y completa.

Debido a la alta concentración de agua en el medio de agar, se forma algo de condensación de agua en las placas de Petri durante la incubación. Si las placas se incubaron con el lado derecho hacia arriba, la humedad probablemente gotearía desde la cubierta hasta la superficie del agar y se esparciría. Esto interrumpiría la formación de colonias individuales y resultaría en una masa de crecimiento confluente. Para evitar esto, placas de petri se invierten de forma rutinaria (el lado inferior hacia arriba) durante la incubación.

F. Observación

Las observaciones detalladas son la clave para realizar, comprender y diseñar experimentos científicos. Un buen ojo y una atención a las diferencias sutiles le ayudarán a completar con éxito las hojas de informe del laboratorio. Después de la incubación, las placas y los tubos deben observarse en busca de evidencia de crecimiento microbiano. Registre sus observaciones en las hojas de informe resumidas proporcionadas. Estos son solo una guía, no dude en modificarlos o agregarlos, según lo considere necesario. Recuerde que estas hojas de informes constituyen su cuaderno de laboratorio y son la base para las calificaciones y evaluaciones de laboratorio. Deben mantenerse actualizados y llevarse al laboratorio en todo momento.

NO DESECHE SUS MUESTRAS HASTA QUE ESTÉ SEGURO DE LOS RESULTADOS Y ESTÁN SEGUROS QUE LAS MUESTRAS NO SE NECESITAN PARA EL SIGUIENTE EJERCICIO.

Ver video 1: Técnicas asépticas Caldo de inoculación, tubos inclinados y de punción

Ver video 1: Técnicas asépticas Caldo de inoculación, tubos inclinados y de punción. URL: https://youtu.be/nMoM8Ku5-8A

Vea el video 2: Cómo realizar una racha en T para colonias aisladas.

Ver video 2: Cómo realizar una racha en T para colonias aisladas. Este video fue filmado en los laboratorios de microbiología en NC State. URL: https: //youtu.be/NsQv7QOmdXo


Rayado (microbiología)

En microbiología, rayado es una técnica utilizada para aislar una cepa pura de una sola especie de microorganismo, a menudo bacterias. A continuación, se pueden tomar muestras de las colonias resultantes y se puede cultivar un cultivo microbiológico en una nueva placa para que el organismo pueda identificarse, estudiarse o analizarse.

El método moderno de placas de rayas ha progresado a partir de los esfuerzos de Robert Koch y otros microbiólogos para obtener cultivos microbiológicos de bacterias con el fin de estudiarlas. El método de dilución o aislamiento por rayas fue desarrollado por primera vez por Loeffler y Gaffky en el laboratorio de Koch, que implica la dilución de bacterias esparciéndolas sistemáticamente sobre el exterior del agar en una placa de Petri para obtener colonias aisladas que luego crecerán en cantidad de células. , o colonias aisladas. Si en la superficie del agar se desarrollan microorganismos que son todos genéticamente iguales, el cultivo se considera un cultivo microbiológico.


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