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¿Por qué es limitado el número de ciclos de PCR?

¿Por qué es limitado el número de ciclos de PCR?


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Me han dicho que el número máximo de ciclos en la PCR está entre 20 y 30.

¿Es esto cierto y cuáles son las razones de esta limitación?


Trazaría la línea más allá de los 35, pero eso es un poco cosmético. Las razones son muchas:

  • debido a la forma exponencial de la amplificación (idealmente) los reactivos se agotan en algún momento
  • los reactivos se degradan, esto es especialmente cierto para los dNTP
  • la actividad de la enzima, a pesar de ser termoestable, está disminuyendo con el tiempo
  • más allá de los 35 ciclos, la curva exponencial se aplana (ver las razones más arriba)
  • Si ejecuta la PCR durante demasiado tiempo, obtendrá más y más productos secundarios (principalmente dímeros de cebadores, pero los cebadores mal alineados también pueden causar problemas), esto es más un problema para la PCR en tiempo real que para los que se ejecutan en un gel

Si necesita una mayor sensibilidad con más ciclos, puede utilizar la técnica denominada "PCR anidada". Allí se realiza una primera ronda con un par de cebadores específicos para la región de interés y luego se realiza una segunda ronda con cebadores que se encuentran ligeramente hacia el interior del ADN amplificado. Esto se hace para evitar la amplificación de contaminaciones no deseadas. Dado que realiza entre 50 y 70 rondas de amplificación por PCR en total, este método es extremadamente sensible (también a las contaminaciones). Consulte la imagen del artículo de Wikipedia para obtener más detalles:


¿Cuántos ciclos de PCR antes de que se agoten los dNTP?

Suponga una reacción de 25 μl.

Suponga dNTP de 200 μM.

DNTP 200 μM = 200 pmol μl -1

por lo que en una reacción de 25 μl, hay 5000 pmol de dNTP

= 5000 x 10-12 x 6 x 1023 moléculas

= 3 x 1015 moléculas dNTP

Suponga que comenzamos con 1 molécula de una plantilla de 1000 pb, 50% GC

1 kb = 2000 nucleótidos

Entonces, ¿cuántas de estas moléculas podemos construir usando 3 x 1015 moléculas dNTP?

= 3 x 1015/2000

= 1,5 x 1012 Moléculas de ADN

¿Cuántos ciclos de PCR para producir tantos a partir de una única molécula molde?

2norte = 1,5 x 1012

nlog2 = log (1.5) + log (1012)

nlog2 = 12,18

n = 12,18 / log2 = 41 ciclos

Por supuesto, esto en un límite superior absoluto. La estimación asume que comienza con una molécula de plantilla de 1 kb y que los dNTP no se hidrolizan ni degradan de otra manera.


En mi propia investigación, descubrí que la cantidad de producto de PCR aumentaba a medida que aumentaba los ciclos a 50 veces. Esto fue para un solo par de cebadores utilizados para amplificar el ADN genómico extraído con un kit en particular, ya que no se aplica a otras reacciones que he realizado. Lo que algunas personas parecen olvidar es que los productos de PCR no necesariamente se duplican en cada ciclo en ningún momento de la PCR porque algunos cebadores no funcionan tan bien como otros y las condiciones de reacción pueden ser subóptimas (p. Ej., Presencia de contaminantes o concentración de Iones Mg).

En resumen, siempre que no obtenga productos de calidad reducida (p. Ej., Productos para untar o imprimaciones no específicas), creo que está bien aumentar el número de ciclos mucho más allá de los 30; es algo que debe probar empíricamente con sus imprimaciones particulares. , plantilla, polimerasa, tampón, etc.


Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una versión de tubo de ensayo del mismo proceso de replicación del ADN que se encuentra en la célula viva. Es una forma rápida y económica de amplificar o hacer muchas copias de pequeños segmentos de ADN. Esto es necesario porque los métodos utilizados para analizar el ADN (determinar la secuencia del par de bases del ADN) requieren más ADN del que puede haber en una muestra típica. Una característica particularmente útil de la PCR es que permite que el proceso de amplificación se limite a segmentos específicos de la mezcla de ADN, como los marcadores del cromosoma Y utilizados en las pruebas genealógicas.

Cuando los viales de células de las mejillas o saliva llegan al laboratorio para su análisis, el ADN se extrae y se purifica. Primero se mezclan con un detergente que hace que las células se abran de golpe y liberen su ADN junto con otros contenidos celulares. A continuación, la mezcla se lava con una solución tampón (sal suave) que contiene fosfato para diluir los restos celulares. Con una preparación mínima, la muestra está lista y el ADN en el área objetivo de un cromosoma se puede amplificar.


Acerca de esas pruebas de RT-PCR

Su caso se basa principalmente en el uso inadecuado de la prueba de RT-PCR. Un colega mío ha accedido gentilmente a que reproduzca sus evaluaciones de esta prueba; no está solo. Sombrero Tip Gerry @ http://boomfinanceandeconomics.com/#/

La PCR es una tecnología difícil de comprender porque hay muchos aspectos sutiles. La tecnología de PCR existe desde 1987 cuando Kary Mullis la inventó. Ganó el Premio Nobel por hacerlo. No es una prueba que los médicos soliciten a la ligera. En la práctica médica clínica normal, se ordena solo cuando se trata de pacientes muy enfermos. Se necesita una consideración cuidadosa y una interpretación muy cuidadosa y la situación clínica es crítica.

Todos deberían ver los videos de Kary Mullis en YouTube y Bitchute. Desafortunadamente, era un genio y un científico brillante, murió recientemente, justo antes del brote de Covid. https://www.bitchute.com/video/8KsH34IGgqBw/

Cita de Kary Mullis, premio Nobel e inventor de las pruebas de PCR:

“Los tipos como Fauci suben y empiezan a hablar, ya sabes, él no sabe nada realmente sobre nada y yo le diría eso en la cara. Nada. El hombre cree que puede tomar una muestra de sangre y meterla en un microscopio electrónico y si tiene un virus, lo sabrá. No comprende la microscopía electrónica y no comprende la medicina y no debería estar en una posición en la que él está. La mayoría de los tipos que están en la cima son personas totalmente administrativas y no saben nada sobre lo que está sucediendo. en el cuerpo.

Sabes, esos muchachos tienen una agenda, que no es lo que nos gustaría que tuvieran, ya que les pagamos para que se ocupen de nuestra salud de alguna manera. Tienen una agenda personal. Ellos crean sus propias reglas sobre la marcha. Los cambian cuando quieren. Y con aire de suficiencia, como a Tony Fauci, no le importa salir en televisión frente a la gente que paga su salario y miente directamente a la cámara ”.

El número de ciclos de PCR puede tener consecuencias dramáticas.

Este es el núcleo del problema, aunque hay muchos, muchos más factores. Las pruebas de PCR no pueden distinguir entre microorganismos vivos (viables) y muertos. Ambos contienen material genético. Esta es la razón por la que usar pruebas de PCR con números de Ct altos (números de ciclo de amplificación) en una situación de detección es ridículo. Nunca debe usarse en personas asintomáticas para "diagnosticar" una enfermedad.

Debido a este problema, nunca se puede considerar como una pura "prueba de diagnóstico". Ningún médico que se precie jamás considerará una prueba de PCR independiente como diagnóstico. Contamos con más de 20 años de experiencia clínica con esta tecnología. Si realiza más de 30 ciclos de amplificación, tiene la garantía de encontrar restos virales o contaminantes no viables (muertos). Muchas naciones han estado haciendo entre 40 y 45 ciclos durante el fenómeno Covid. Se garantiza que el número de ciclo producirá una alta tasa de pruebas positivas que, de hecho, son falsas. Los llamamos "falsos positivos" en el mundo de la medicina clínica.

Una prueba positiva para SARS CoV2 (con menos de 25 ciclos de amplificación) combinado con un paciente enfermo que muestra los síntomas de viremia aguda y una tomografía computarizada que muestra opacidades en vidrio esmerilado (especialmente bilateralmente) más hallazgos hematológicos de ataque viral agudo pueden entonces ser parte de la evidencia para un diagnóstico preliminar (provisional) de Covid 19. Si el El curso clínico de la enfermedad progresa como era de esperar, entonces ese diagnóstico puede volverse más firme con el tiempo.

Así es como se practica la medicina clínica. Los “epidemiólogos” y los “asesores médicos” de los servidores públicos de nuestros gobiernos son casi TODOS los que no son clínicos. Ellos Nunca ver a un paciente enfermo. Ellos Nunca asumir la responsabilidad del tratamiento de una sola persona que está peligrosamente enferma de Covid 19. Pueden sorprenderse al saber que los médicos generalmente los ignoran y tratan a sus pacientes enfermos con zinc, esteroides (tanto inhalados, por vía oral como intravenosa), vitamina D, ivermectina y Hidroxicloroquina antes de vuelve el resultado de la prueba de PCR.

Los diagnósticos moleculares están revolucionando la práctica clínica de las enfermedades infecciosas. Sus efectos pueden ser significativos en entornos de cuidados intensivos donde las herramientas de diagnóstico oportunas y precisas son fundamentales para las decisiones y los resultados del tratamiento del paciente. Los entornos de cuidados intensivos NO son un cribado de la población general de los no sintomáticos. Y la PCR no es la única prueba u observación que utilizará un médico en un entorno de cuidados intensivos.

Con la evolución de nuevas herramientas de diagnóstico de biología molecular (PCR), han surgido preguntas difíciles sobre el papel de tales pruebas en la evaluación de enfermedades infecciosas clínicas. A medida que los diagnósticos moleculares continúan fluyendo de la mesa a la cabecera de la cama, los médicos deben adquirir un conocimiento práctico de los principios, el valor diagnóstico y las limitaciones de diversos ensayos en entornos hospitalarios.

El método se basa en saber al menos secuencias parciales del ADN diana a priori y utilizándolos para diseñar cebadores oligonucleotídicos que hibridan específicamente con la secuencia diana. Una secuencia parcial no es una secuencia completa, esto es un problema potencial para la interpretación de los resultados de la prueba.

A través de múltiples ciclos de calentamiento y enfriamiento en un termociclador para producir rondas de desnaturalización del ADN objetivo, hibridación de cebadores y extensión de cebadores, el ADN diana se amplifica exponencialmente“.

En teoría, este método tiene el potencial de generar miles de millones de copias de ADN diana a partir de una sola copia en menos de una hora. Por lo tanto, un diminuto El fragmento de material genético muerto (no viable) se puede encontrar mediante la metodología de amplificación por PCR. Por lo tanto, debe tener mucho cuidado con los resultados. No representan “casos” excepto en la BBC, ABC y CNN et al.

Limitaciones de la PCR:

Las principales deficiencias en la aplicación de los ensayos de PCR al entorno clínico incluyen:

  • Resultados falsos positivos de la contaminación del ADN de fondo
  • El potencial de resultados de pruebas falsos negativos
  • Sensibilidad de detección que excede la importancia clínica
  • Espacio de detección limitado del ensayo o plataforma para la identificación simultánea de múltiples especies, factores de virulencia o resistencia a fármacos.

Falsos positivos:

El uso generalizado de la PCR en entornos clínicos puede verse obstaculizado en gran medida por la contaminación de fondo de fuentes exógenas de ADN. En la mayoría de los ensayos específicos de patógenos, la fuente predominante de contaminación se deriva de los productos "remanentes" de reacciones de PCR anteriores que se pueden albergar y transmitir a través de reactivos de PCR, tubos, pipetas y superficies de laboratorio. Junto con el robusto poder de amplificación de la PCR, incluso cantidades muy pequeñas de contaminación residual pueden servir como sustratos para la amplificación y dar lugar a resultados falsos positivos.

Las medidas de control meticulosas, como las buenas prácticas de laboratorio y la separación física de las áreas de preamplificación y posamplificación, pueden reducir los riesgos de contaminación, pero no son infalibles. El uso de inactivación enzimática del ADN remanente (es decir, uracil N-glicosilasa) puede reducir aún más el riesgo de contaminación.

Para los médicos de atención aguda de primera línea o los médicos que trabajan en situaciones de desastre, un ensayo rápido de PCR universal o paneles de ensayos de PCR dirigidos a categorías de patógenos involucrados en síndromes específicos como meningitis, neumonía o sepsis, pueden permitir una clasificación rápida y temprana. terapia dirigida agresiva.

Debido a la legítima preocupación con respecto a la transmisión de enfermedades de casos asintomáticos y presintomáticos, no se está siguiendo este consejo. Como resultado, la gran cantidad de pruebas no es diagnóstica.

Una forma de reducir los resultados falsos positivos es repetir la prueba utilizando una prueba con un formato diferente (fabricante diferente). Debido a las instalaciones de prueba limitadas, la confirmación no se realiza de forma rutinaria y solo unos pocos positivos se confirman mediante un segundo ensayo de rRT-PCR. Es probable que con la prevalencia activa actual de la enfermedad, los resultados positivos de la rRT-PCR de muchas personas asintomáticas sean falsos positivos. Ya sabemos que el número es del 90% como mínimo y puede llegar al 99%, especialmente si el número Ct supera el 40.


si los dos son iguales o casi iguales).

El número de moléculas de cebador libres en la muestra A después del ciclo 4.

El número de moléculas de cebador libres en la muestra A después del ciclo 10.

El número de moléculas de cebador libres en la muestra A después del ciclo 10.

El número de moléculas de cebador libres en la muestra B después del ciclo 10.

El número de moléculas de sonda TaqMan libres en la muestra A después del ciclo 10.

El número de moléculas de sonda TaqMan libres en la muestra B después del ciclo 10.

El número de moléculas de sonda TaqMan libres en la muestra A después del ciclo 18.

El número r de moléculas de sonda TaqMan libres en la muestra B después del ciclo 18.

El número de complejos de mononucleótido / colorante indicador en la muestra A después del ciclo 18.

El número de complejos de colorante indicador / mononucleótido en la muestra B después del ciclo 18.

El número de amplificados HER2 fragmentos en la muestra A después del ciclo 20.

El número de amplificados HER2 fragmentos en la muestra B después del ciclo 20.

El número de amplificados HER2 fragmentos en la muestra A después del ciclo 30.

El número de amplificados HER2 fragmentos en la muestra B después del ciclo 30.


Acerca de esas pruebas de RT-PCR

Reiner Fuellmich está a punto de iniciar un proceso judicial contra los perpetradores de la estafa Covid-19: covid-abogados-expertos-médicos-en-fraude-inician-procedimientos-legales-contra la OMS Su caso se basa principalmente en el uso inadecuado de la prueba de RT-PCR. Un colega mío ha accedido gentilmente a que reproduzca sus evaluaciones de esta prueba; no está solo. Sombrero Tip Gerry @ http://boomfinanceandeconomics.com/#/

La PCR es una tecnología difícil de comprender porque hay muchos aspectos sutiles. La tecnología de PCR existe desde 1987 cuando Kary Mullis la inventó. Ganó el Premio Nobel por hacerlo. No es una prueba que los médicos soliciten a la ligera. En la práctica médica clínica normal, se ordena solo cuando se trata de pacientes muy enfermos. Se necesita una consideración cuidadosa y una interpretación muy cuidadosa y la situación clínica es crítica.

Todos deberían ver los videos de Kary Mullis en YouTube y Bitchute. Desafortunadamente, era un genio y un científico brillante, murió recientemente, justo antes del brote de Covid. https://www.bitchute.com/video/8KsH34IGgqBw/

Cita de Kary Mullis, premio Nobel e inventor de las pruebas de PCR: “Los tipos como Fauci suben y empiezan a hablar, ya sabes, él no sabe nada realmente sobre nada y yo le diría eso en la cara. Nada. El hombre cree que puede tomar una muestra de sangre y meterla en un microscopio electrónico y si tiene un virus, lo sabrá. No comprende la microscopía electrónica y no comprende la medicina y no debería estar en una posición en la que él está. La mayoría de los tipos que están en la cima son personas totalmente administrativas y no saben nada sobre lo que está sucediendo. en el cuerpo. Sabes, esos muchachos tienen una agenda, que no es lo que nos gustaría que tuvieran, ya que les pagamos para que se ocupen de nuestra salud de alguna manera. Tienen una agenda personal. Ellos crean sus propias reglas sobre la marcha. Los cambian cuando quieren. Y con aire de suficiencia, como a Tony Fauci, no le importa salir en televisión frente a la gente que paga su salario y miente directamente a la cámara ”.

El número de ciclos de PCR puede tener consecuencias dramáticas. Este es el núcleo del problema, aunque hay muchos, muchos más factores. Las pruebas de PCR no pueden distinguir entre microorganismos vivos (viables) y muertos. Ambos contienen material genético. Esta es la razón por la que usar pruebas de PCR con números de Ct altos (números de ciclo de amplificación) en una situación de detección es ridículo. Nunca debe usarse en personas asintomáticas para "diagnosticar" una enfermedad.

Debido a este problema, nunca se puede considerar como una pura "prueba de diagnóstico". Ningún médico que se precie jamás considerará una prueba de PCR independiente como diagnóstico. Contamos con más de 20 años de experiencia clínica con esta tecnología. Si realiza más de 30 ciclos de amplificación, tiene la garantía de encontrar restos virales o contaminantes no viables (muertos). Muchas naciones han estado haciendo entre 40 y 45 ciclos durante el fenómeno Covid. Se garantiza que el número de ciclo producirá una alta tasa de pruebas positivas que, de hecho, son falsas. Los llamamos "falsos positivos" en el mundo de la medicina clínica.

Una prueba positiva para SARS CoV2 (con menos de 25 ciclos de amplificación) combinado con un paciente enfermo que muestra los síntomas de viremia aguda y una tomografía computarizada que muestra opacidades en vidrio esmerilado (especialmente bilateralmente) más hallazgos hematológicos de ataque viral agudo pueden entonces ser parte de la evidencia para un diagnóstico preliminar (provisional) de Covid 19. Si el El curso clínico de la enfermedad progresa como era de esperar, entonces ese diagnóstico puede volverse más firme con el tiempo.

Así es como se practica la medicina clínica. Los “epidemiólogos” y los “asesores médicos” de los servidores públicos de nuestros gobiernos son casi TODOS los que no son clínicos. Ellos Nunca ver a un paciente enfermo. Ellos Nunca asumir la responsabilidad del tratamiento de una sola persona que está peligrosamente enferma de Covid 19. Pueden sorprenderse al saber que los médicos generalmente los ignoran y tratan a sus pacientes enfermos con zinc, esteroides (tanto inhalados, por vía oral como intravenosa), vitamina D, ivermectina y Hidroxicloroquina antes de vuelve el resultado de la prueba de PCR.

Los diagnósticos moleculares están revolucionando la práctica clínica de las enfermedades infecciosas. Sus efectos pueden ser significativos en entornos de cuidados intensivos donde las herramientas de diagnóstico oportunas y precisas son fundamentales para las decisiones y los resultados del tratamiento del paciente. Los entornos de cuidados intensivos NO son un cribado de la población general de los no sintomáticos. Y la PCR no es la única prueba u observación que utilizará un médico en un entorno de cuidados intensivos.

Con la evolución de las nuevas herramientas de diagnóstico de biología molecular (PCR), han surgido preguntas difíciles con respecto al papel de tales pruebas en la evaluación de enfermedades infecciosas clínicas. A medida que los diagnósticos moleculares continúan fluyendo de la mesa a la cabecera de la cama, los médicos deben adquirir un conocimiento práctico de los principios, el valor diagnóstico y las limitaciones de diversos ensayos en entornos hospitalarios.

El método se basa en saber al menos secuencias parciales del ADN diana a priori y utilizándolos para diseñar cebadores oligonucleotídicos que hibridan específicamente con la secuencia diana. Una secuencia parcial no es una secuencia completa, esto es un problema potencial para la interpretación de los resultados de la prueba.

A través de múltiples ciclos de calentamiento y enfriamiento en un termociclador para producir rondas de desnaturalización del ADN objetivo, hibridación de cebadores y extensión de cebadores, el ADN diana se amplifica exponencialmente“.

En teoría, este método tiene el potencial de generar miles de millones de copias de ADN diana a partir de una sola copia en menos de una hora. Por lo tanto, un diminuto El fragmento de material genético muerto (no viable) se puede encontrar mediante la metodología de amplificación por PCR. Por lo tanto, debe tener mucho cuidado con los resultados. No representan “casos” excepto en la BBC, ABC y CNN et al.

Limitaciones de la PCR: Las principales deficiencias en la aplicación de los ensayos de PCR al entorno clínico incluyen:

  • Resultados falsos positivos de la contaminación del ADN de fondo
  • El potencial de resultados de pruebas falsos negativos
  • Sensibilidad de detección que excede la importancia clínica
  • Espacio de detección limitado del ensayo o plataforma para la identificación simultánea de múltiples especies, factores de virulencia o resistencia a fármacos.

Falsos positivos: El uso generalizado de la PCR en entornos clínicos puede verse obstaculizado en gran medida por la contaminación de fondo de fuentes exógenas de ADN. En la mayoría de los ensayos específicos de patógenos, la fuente predominante de contaminación se deriva de los productos "remanentes" de reacciones de PCR anteriores que se pueden albergar y transmitir a través de reactivos de PCR, tubos, pipetas y superficies de laboratorio. Junto con el robusto poder de amplificación de la PCR, incluso cantidades muy pequeñas de contaminación residual pueden servir como sustratos para la amplificación y dar lugar a resultados falsos positivos.


¿Por qué es limitado el número de ciclos de PCR? - biología

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

PCR comienza con una mezcla que contiene un dsDNA plantilla , un par de pantalones cortos cebadores de oligonucleótidos de ssDNA , un grupo de los cuatro dNTP y un ADN polimerasa resistente al calor, Taq Enzima . La reacción se lleva a cabo en un bloque calefactor regulado por ordenador, a termociclador , que permite un calentamiento y enfriamiento rápido y controlado. los imprimaciones se eligen de modo que sean complementarias en base a los extremos opuestos de cualquiera de las cadenas de un tramo corto de ADN que contiene la región del gen de interés: PCR por tanto, requiere algún conocimiento previo del gen.

La reacción se calienta primero a 95 o C para fundir (desnaturalizar) los dsDNA en hebras separadas. La reacción luego se enfría a

50 o C, a que temperatura el imprimaciones encontrará regiones de base complementaria en el ssDNA, a la que se pegaránrecocer). La reacción finalmente se calienta a 72 o C, a que temperatura el Taq enzima replica el cebado ssDNA (extensión). Al final de un ciclo, la región entre los dos cebadores se ha copiado una vez, produciendo dos copias de la región del gen original. [Esto está un poco simplificado: consulte detalles].

Debido a que se usa una polimerasa resistente al calor, la reacción se puede repetir continuamente sin la adición de más enzima. Cada ciclo dobles el número de copias del gen amplificado: diez ciclos idealmente producen 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1.024 (2 10) copias. Por lo tanto, 30 ciclos produce un (2 10x3) = 10 amplificación de 9 veces. Esto produce una cantidad suficiente de la región génica de interés para el análisis directo, por ejemplo, por secuencia ADN.


Tinte de unión al ADN:

Para una persona sin experiencia y sin experiencia, el método de tinción de unión al ADN es la mejor técnica para la detección en tiempo real.

El tinte tiene su propia fluorescencia. Una vez que el tinte se une al ADN de doble hebra, la fluorescencia emitida por el tinte aumenta de 100 a 1000 veces que la señal original.

Sin embargo, la fluorescencia del colorante original se toma como base para la detección.

El método es rápido, fiable y rentable. Además, la posibilidad de error en los experimentos es menor y la configuración de la reacción es simple y fácil de usar.

El resultado del experimento depende de la especificidad de los cebadores utilizados en la reacción de PCR.

Debido a que, aunque los cebadores se unen de forma no específica, el tinte de unión al ADN se une a la secuencia no específica y da las señales fluorescentes.

Debido a que el tinte detecta que el ADN bicatenario se une, incluso si el dsDNA no es específico, el tinte debe unirse a él.

Por lo tanto, la probabilidad de detección no específica es alta en el método basado en colorante verde SYBR.

El verde SYBR es uno de los tintes más utilizados en la PCR en tiempo real.

La sensibilidad del experimento es limitada. De nuevo surge una pregunta en la mente,

¿Es adecuado para la determinación de plantillas sensibles?

Podemos identificar las uniones no específicas en la reacción haciendo el análisis de la curva de fusión.

Análisis de la curva de fusión:

Una vez que se completa la reacción de amplificación y se registran las señales de fluorescencia, la plantilla se funde para la determinación de las uniones no específicas.

La plantilla se funde mediante calentamiento, el tinte se disocia y las señales de fluorescencia se reducen.

La transición disminuida de una fluorescencia de amplio rango se informa para el producto específico, mientras que se registra una transición de calor diferente para diferentes bandas cortas no específicas.

"Las secuencias más grandes requieren más tiempo y una temperatura más alta para fundirse, mientras que las bandas no específicas se funden a una temperatura más baja y tienen diferentes curvas de temperatura de fusión".

Los datos se representan en el gráfico de fluorescencia frente a temperatura de fusión a continuación.

El gráfico de fluorescencia frente a temperatura de fusión también se denomina curva de disociación y el método se denomina análisis de curva de disociación.

Imagen: La imagen muestra la curva de disociación para productos específicos y dímeros de cebadores, mientras que otra imagen muestra diferentes curvas de disociación para dos homocigotos y un heterocigoto.

SYBR green y EvaGreen son dos tintes principales utilizados en la PCR cuantitativa en tiempo real. Los experimentos se utilizan en la validación de los ensayos como el microarray de ADN.

La química de la sonda TaqMan se utiliza ampliamente en la PCR cuantitativa, el nombre TaqMan se toma del & # 8220Taq & # 8221 Taq DNA polimerasa (porque la química de la sonda depende de la actividad de Taq DNA polimerasa) y & # 8220Hombre & # 8221 del juego PacMan. Sí, el nombre se toma del juego. ¿Recuerdas lo que hace PacMan?


Diferentes tipos de técnica de PCR basada en termociclado (pasos de calentamiento y enfriamiento)

Las técnicas de termociclado utilizan ciclos de temperatura para impulsar ciclos repetidos de síntesis de ADN.

PCR multiplex

La PCR multiplex es un tipo de técnica de PCR que permite la amplificación de muchas secuencias diana al mismo tiempo en la misma mezcla de reacción.

Una única mezcla de reacción incluye conjuntos de pares de cebadores para diferentes dianas de ADN. Reduce el consumo de Reactivos de PCRy, al mismo tiempo, impone restricciones a los cebadores usados.

Para que funcione correctamente dentro de una reacción, se deben optimizar los conjuntos de cebadores. Deben tener temperaturas de recocido similares y producir amplicones de diferentes tamaños para formar bandas de electroforesis en gel distintas para el análisis de PCR seguido.

PCR anidado

La PCR anidada se utiliza para aumentar la especificidad de una amplificación de ADN reduciendo productos inespecíficos.

Esta técnica utiliza dos juegos de cebadores.

El primer conjunto permite una primera reacción en cadena de la polimerasa. El producto de esta reacción sirve como fuente de ADN diana para una segunda PCR utilizando el segundo conjunto de cebadores.

PCR de arranque en caliente

Este tipo de reacción en cadena de la polimerasa sirve para reducir la amplificación inespecífica durante las etapas iniciales de configuración.

La técnica de PCR de inicio en caliente mantiene la ADN polimerasa en un estado inactivo a temperaturas inferiores a la temperatura de hibridación.

Esta modificación evita la amplificación durante la configuración de la reacción cuando los cebadores se unen a secuencias de ADN con baja homología.

Dos variantes de esta técnica son la PCR de arranque en caliente mecánica y no mecánica.

PCR mecánica de arranque en caliente realizado calentando la mezcla de reacción a la temperatura de fusión del ADN antes de añadir la polimerasa Taq.

PCR de arranque en caliente no mecánico utiliza sistemas enzimáticos especializados que inhiben la activación de la ADN polimerasa a temperatura ambiente.

PCR de contacto

Touchdown PCR es otra técnica para reducir la amplificación inespecífica.

Se logra elevando la temperatura de recocido por encima de la temperatura de fusión de los cebadores usados ​​en los ciclos iniciales y disminuyéndola en los ciclos posteriores.

Las temperaturas más altas durante los ciclos iniciales ayudan a los cebadores a unirse a las plantillas de ADN con mayor especificidad, mientras que las temperaturas más bajas permiten una amplificación más eficiente de los amplicones producidos.

Reacción en cadena de ligasa (LCR)

Este tipo de técnica de PCR utiliza cuatro cebadores para la amplificación del ADN (dos cebadores para cada hebra del ADN diana).

Los cebadores de reacción en cadena de ligasa son mucho más largos que los cebadores de PCR habituales y están diseñados para cubrir toda la secuencia a amplificar.

Durante el primer paso de hibridación, los cebadores se sellan mediante una ADN ligasa termoestable.

Esto genera un fragmento que es tan largo como la longitud total de cada par de cebadores que sirve como plantillas de ADN para los ciclos posteriores.

La principal ventaja de la reacción en cadena de la ligasa es que una mutación de un solo punto cerca de la unión en el ADN molde original puede prevenir la reacción y la ausencia de producto puede ser un indicador de mutaciones.

PCR cuantitativa (qPCR)

La cantidad de producto que se sintetiza durante un número determinado de ciclos de una reacción en cadena de la polimerasa depende del número de moléculas de ADN que están presentes en la mezcla de partida. Esto permite utilizar la PCR para cuantificar el número de moléculas de ADN presentes en un extracto.

En la PCR cuantitativa, la cantidad de producto sintetizado durante una prueba de PCR se compara con las cantidades sintetizadas durante las PCR con cantidades conocidas de ADN de partida.

PCR en tiempo real

Hoy en día, la cuantificación se lleva a cabo mediante PCR en tiempo real, una modificación de la técnica de PCR estándar en la que la síntesis del producto se mide a lo largo del tiempo.

Con mayor frecuencia, este método se usa para medir cantidades de ARN.

Por ejemplo, para determinar la expresión de un gen particular en células cancerosas. Este método permite monitorear el desarrollo del cáncer.

PCR de transcripción inversa

Para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa donde el ARN es el material de partida, este método utiliza la transcriptasa inversa, un proceso llamado RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa).

El primer paso de este método es convertir las moléculas de ARN en ADN complementario monocatenario (ADNc). Después de este paso, el experimento procede como en la técnica estándar.

Algunas polimerasas termoestables, como Tth, tienen una actividad de transcriptasa inversa en determinadas condiciones de tampón y son capaces de hacer copias de ADN de moléculas de ADN y ARN.

PCR TaqMan

TaqMan PCR es una de las técnicas de PCR en tiempo real.

Utiliza una sonda de oligonucleótidos que es complementaria a una secuencia interna dentro de las cadenas amplificadas.

Tiene un grupo fluorescente en un extremo y un extintor en el otro. Mientras tanto el fluoróforo como el extintor permanezcan dentro de la sonda de oligonucleótidos, no se emite fluorescencia.

Durante la amplificación del ADN, la sonda oligonucleotídica y los cebadores se unirán a las hebras recién sintetizadas. La polimerasa destruirá la sonda debido a la actividad exonucleasa intrínseca 5 '→ 3' y liberará el fluoróforo.

La intensidad de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de producto generado.

PCR de montaje

Ensamblaje El ensamblaje de ciclo de polimerasa o PCR se desarrolló para producir nuevas secuencias largas de ácidos nucleicos.

La principal diferencia con la reacción en cadena de la polimerasa tradicional es la longitud y la cantidad de cebadores.

Para sintetizar oligonucleótidos artificiales, la PCR de ensamblaje se realiza en cebadores largos de hasta 50 nucleótidos. Estos cebadores tienen segmentos cortos superpuestos y alternan entre direcciones sentido y antisentido que cubren la secuencia diana completa.

Durante ciclos sucesivos, los cebadores se hibridan mediante segmentos complementarios y luego la polimerasa aumenta la longitud de los fragmentos produciendo la secuencia de ácido nucleico larga final.

Normalmente, la fase de ensamblaje va seguida de una reacción en cadena de la polimerasa regular con cebadores finales para aumentar la cantidad de producto final.


Solución de problemas de su PCR

¿Qué debe hacer cuando su PCR falla? Las preguntas frecuentes a continuación pueden encaminarlo hacia un PCR exitoso.

Para obtener consejos sobre cómo rescatar sus experimentos de la contaminación por PCR, consulte este artículo de blog.

Si no se obtienen productos de amplificación, ¿qué parámetros deben considerarse primero al solucionar problemas?

Considera lo siguiente:

  • Primero, asegúrese de que todos los componentes de la PCR estén incluidos en las reacciones. Siempre debe incluirse un control positivo para garantizar que cada componente esté presente y sea funcional.
  • Si no hubo problemas con la configuración experimental, aumente el número de ciclos de PCR (3 & ndash5 ciclos a la vez), hasta 40 ciclos. El aumento del número de ciclos puede solucionar problemas con una plantilla de baja abundancia o inaccesibilidad de la plantilla debido a impurezas o una baja eficiencia de cebado de los cebadores.
  • Si el aumento del número de ciclos no mejora los resultados, las condiciones de la PCR pueden ser demasiado estrictas para el conjunto de cebadores o la plantilla en particular. Considere modificar las condiciones de PCR de la siguiente manera:
    • Baje la temperatura de recocido en incrementos de 2 grados.
    • Aumente el tiempo de extensión.
    • Aumente la cantidad de plantilla. Consulte las pautas proporcionadas con la enzima para determinar la cantidad óptima de plantilla.

    Tenga en cuenta estas posibles razones adicionales para la falla de PCR:

    • Inhibidores de la PCR en la muestra de plantilla
      Si hay inhibidores de la PCR, el uso de una plantilla diluida puede aumentar la eficacia de la PCR. Alternativamente, es posible que sea necesario purificar la plantilla con un kit como el NucleoSpin Gel y el kit de limpieza de PCR. Si no es posible purificar la plantilla, una enzima que tenga una mayor tolerancia a las impurezas, como la polimerasa Terra PCR Direct, puede mejorar los resultados.
    • La plantilla tiene & gt65% de contenido de GC.
      Cuando amplifique a partir de plantillas con alto contenido de GC, use una enzima formulada para esta condición. Visite nuestra guía de selección de PCR para encontrar una enzima adecuada.
    • Los cebadores no son óptimos
      Revise sus imprimaciones y rediseñe cuidadosamente si es necesario. Además, considere volver a amplificar el producto de PCR primario usando diluciones de 10 veces (1: 100 a 1: 10,000) usando cebadores anidados.

    Cuando utilice PrimeSTAR HS DNA Polymerase, considere:

    • Usando una cantidad adecuada de plantilla. Si la plantilla es ADN genómico humano o una biblioteca de ADNc, no use más de

    Cuando use PrimeSTAR Max DNA Polymerase, considere:

    • Ajustar el tiempo de extensión si la mezcla de reacción contiene exceso de plantilla. Si la cantidad de plantilla excede los 200 ng en una mezcla de reacción de 50 y microlitros, establezca el tiempo de extensión entre 30 seg / kb y 1 min / kb.
    • Incrementando la concentración de los cebadores.

    Cuando utilice SpeedSTAR HS DNA Polymerase, tenga en cuenta:

    • Aumentando el tiempo de extensión. Aunque el tiempo de extensión estándar es de 10 seg / kb, el tiempo de extensión se puede aumentar a

    Si hay bandas de amplificación inespecíficas, ¿qué se puede hacer para mejorar la especificidad?

    Todas las polimerasas Takara Bio PCR

    Asunto:

    Solución:

    Utilice la alineación BLAST para determinar si los extremos 3 'de los cebadores son complementarios a sitios distintos de los sitios objetivo. Rediseñe los cebadores si es necesario o modifique las condiciones de la PCR.

    Asunto:

    Las condiciones de la PCR no son lo suficientemente estrictas.

    Soluciones:

    • Aumente la temperatura de recocido en incrementos de 2 grados.
    • Utilice PCR de contacto.
    • Utilice un protocolo de PCR de dos pasos.
    • Reducir el número de ciclos de PCR.

    Asunto:

    Se utilizó demasiada plantilla.

    Solución:

    Reduzca la cantidad en 2 & ndash5 veces.

    PrimeSTAR HS y PrimeSTAR Max ADN polimerasas

    Asunto:

    El tiempo de recocido es demasiado largo.

    Solución:

    Para lograr una amplificación específica, es esencial utilizar un tiempo de hibridación corto (5 y 15 segundos) al realizar la PCR de tres pasos.

    PrimeSTAR GXL ADN polimerasas

    Asunto:

    Los cebadores tienen T subóptimametro valores.

    Solución:

    Para amplificar objetivos & lt1 kb, diseñe cebadores con Tmetro valores & gt55 & degC, y use una temperatura de recocido de 60 & degC. Si la cartilla Tmetro Los valores son & lt55 & degC, pruebe con un tiempo de extensión más corto entre 5 y 10 seg / kb.

    Takara Ex Taq y Takara LA Taq Polimerasas de ADN

    Asunto:

    Recocido de imprimación inespecífico a bajas temperaturas.

    Solución:

    Las versiones de inicio en caliente de estas enzimas pueden mejorar los resultados de algunos cebadores.

    SpeedSTAR HS ADN polimerasa

    Asunto:

    Manchado de las bandas del producto de PCR en un gel.

    Solución:

    Los tiempos de extensión excesivamente largos pueden provocar manchas. La recomendación general para el tiempo de extensión de esta enzima es 10 & ndash20 seg / kb. Si el rendimiento de la PCR es bajo, intente aumentar el número de ciclos en 5.

    Si la PCR genera un frotis después de ejecutar los productos en un gel, ¿qué se puede hacer para mejorar los resultados?

    Primero, determine la fuente del frotis usando controles positivos y negativos (sin molde). Esto puede determinar si la causa del frotis es contaminación o sobreciclado, o si el frotis es el resultado de cebadores mal diseñados o condiciones de PCR subóptimas.

    Si el control negativo está en blanco, no hay contaminación. En su lugar, las condiciones de la PCR deberán optimizarse, tenga en cuenta lo siguiente al ajustar las condiciones de la PCR:

    • Reducir la cantidad de plantilla.
    • Aumente la temperatura de recocido.
    • Utilice PCR de contacto.
    • Reducir el número de ciclos de PCR.
    • Rediseñar los cebadores.
    • Utilice imprimaciones anidadas.
    • Vuelva a amplificar el producto. (Se puede quitar un pequeño tapón del gel con una punta de micropipeta, y el ADN se puede recuperar agregando el tapón a 200 microlitros de agua y luego incubándolo a 37 ° C. Se pueden utilizar 5 microlitros de esta solución como plantilla de PCR para amplificación.)

    Si también se mancha el control negativo, hay contaminación. Deberá determinar la fuente de esta contaminación. Puede ser necesario reemplazar los reactivos de PCR y descontaminar las pipetas y su estación de trabajo (consulte las preguntas a continuación para obtener más información sobre la contaminación).

    ¿Cuáles son algunas fuentes de contaminación por PCR?

    Hay cuatro fuentes principales de contaminación por PCR:

    1. La fuente más común de contaminación es el producto de PCR de amplificaciones previas (llamado "contaminación por arrastre"). Cuando se generan grandes cantidades de producto de PCR (10 12 moléculas) repetidamente durante un período de tiempo, aumenta el potencial de contaminación.
    2. Otra fuente de contaminación es el ADN clonado previamente manipulado en el laboratorio.
    3. También puede ocurrir contaminación de muestra a muestra. Es más probable que esta fuente de contaminación se encuentre en muestras que requieren un procesamiento extenso antes de la amplificación.
    4. Las reacciones también pueden estar contaminadas con ADN exógeno en el medio ambiente, incluido el ADN presente en el equipo de laboratorio y en los reactivos utilizados para la extracción de ADN y la PCR.

    ¿Cómo se puede evitar la contaminación?

    La sensibilidad de la PCR requiere que las muestras no estén contaminadas con ningún ADN exógeno o cualquier producto previamente amplificado del entorno del laboratorio. Recomendamos que se utilicen áreas distintas para la preparación de muestras, la configuración de la PCR y el análisis posterior a la PCR.

    Se recomienda una cabina de flujo laminar equipada con una lámpara UV para preparar mezclas de reacción.Deben establecerse dos estaciones que estén físicamente separadas entre sí.

    • Establezca un "área previa a la PCR" que sea solo para la configuración de la reacción de PCR. No se deben introducir elementos del "área post-PCR" en esta área, esto incluye elementos como cuadernos y bolígrafos.
    • Establezca un "área posterior a la PCR" que se utilice para la PCR, la purificación del ADN amplificado por PCR, la medición de la concentración de ADN, el procesamiento de geles de agarosa y el análisis de los productos de la PCR.

    El equipo también debe restringirse a estas áreas. La máquina de PCR y el aparato de electroforesis deben ubicarse en el área posterior a la PCR. Se recomienda encarecidamente tener pipetas y puntas de pipeta con filtros de aerosol dedicados únicamente a la preparación de muestras de ADN y mezclas de reacción. Las recomendaciones adicionales incluyen:

    • Tener juegos separados de pipetas y puntas de pipeta, batas de laboratorio, cajas de guantes y cestas de basura para las áreas de pre-PCR y post-PCR.
    • Etiquetado de elementos previos y posteriores a la PCR, para que no se retiren de su área de trabajo designada.
    • Siguiendo la regla de oro de la PCR: NUNCA lleve ningún reactivo, equipo o pipeta que se use en un área posterior a la PCR al área previa a la PCR.
    • Preparar y almacenar reactivos para PCR por separado y usarlos únicamente para el propósito designado. Los reactivos deben dividirse en alícuotas en pequeñas porciones y almacenarse en áreas designadas dependiendo de si se utilizan para aplicaciones pre-PCR o post-PCR. Las alícuotas deben almacenarse por separado de otras muestras de ADN.

    Siempre se debe realizar una reacción de control que omita el ADN molde para confirmar la ausencia de contaminación. Además, el número de ciclos de PCR debe mantenerse al mínimo, ya que los ensayos altamente sensibles son más propensos a los efectos de la contaminación.

    ¿Cómo puedo descontaminar si tengo contaminación por PCR?

    1. Deje las pipetas bajo luz ultravioleta en la campana de cultivo celular durante la noche. La irradiación UV promueve la reticulación de los residuos de timidina, dañando el ADN residual.
    2. Rocíe las estaciones de trabajo / equipos / pipetas con lejía al 10% y luego límpielos.
    3. Las estaciones de trabajo de cambio mueven el área de pre-PCR a otra ubicación previamente limpiada.
    4. No utilice ningún instrumento o pipeta que haya utilizado antes.

    ¿Qué puedo hacer si el PCR genera errores?

    Para evitar errores durante la PCR, recomendamos utilizar una enzima de alta fidelidad (consulte la guía de selección). Además, asegúrese de evitar lo siguiente:

    1. Sobreciclaje
      Las reacciones de PCR con sobreciclado a menudo:
      • Cambia el pH de la reacción de una manera que desestabiliza el ADN.
      • Aumenta la cantidad de producto de PCR, reduciendo así la eficiencia de la polimerasa y promoviendo errores.
      • Disminuye la cantidad de dNTP, lo que aumenta la probabilidad de incorporación errónea de bases debido a la concentración de dNTP desequilibrada. (Si se utilizan las enzimas de PCR de Takara Bio, la concentración de dNTP se optimiza a 200 nM, aumentando la concentración de dNTP se produce una incorporación incorrecta).
      • Provoca acumulación de ADN monocatenario y bicatenario.
    2. Concentración alta de Mg 2+
      La concentración de Mg 2+ varía entre 1 y ndash5 mM. El uso de una concentración alta de Mg 2+ puede aumentar el rendimiento, pero también podría afectar la actividad de corrección de pruebas de las enzimas. Sin embargo, la concentración de Mg 2+ siempre debe ser mayor que la concentración de dNTP.
    3. Daño del ADN de la plantilla
      Limite el tiempo de exposición a los rayos UV cuando analice o extraiga productos de PCR de los geles.

    ¿Qué son los inhibidores de la PCR?

    Las impurezas que interfieren con la amplificación por PCR se conocen como inhibidores de la PCR. Los inhibidores de la PCR están presentes en una gran variedad de tipos de muestras y pueden provocar una disminución de la sensibilidad de la PCR o incluso resultados de PCR falsos negativos. Los inhibidores de la PCR pueden tener orígenes tanto inorgánicos como orgánicos (Schrader 2012).

    Los inhibidores de PCR inorgánicos incluyen:

    • Calcio u otros iones metálicos que compiten con el magnesio.
    • EDTA que se une al magnesio, reduciendo su concentración.

    Algunos inhibidores orgánicos de la PCR incluyen:

    • Polisacáridos y glicolípidos que imitan la estructura de los ácidos nucleicos, interfiriendo con la unión de los cebadores a la plantilla.
    • Melanina y colágeno que forman un complejo reversible con la ADN polimerasa.
    • Ácidos húmicos que interactúan con la plantilla de ADN y la polimerasa, evitando la reacción enzimática, incluso a bajas concentraciones.
    • Urea que puede provocar la degradación de la polimerasa

    Otros compuestos orgánicos que pueden inhibir la PCR incluyen:

    • Hemoglobina, lactoferrina e IgG en muestras de sangre, suero o plasma
    • Anticoagulantes como la heparina.
    • Polifenoles, pectina y xilano de plantas
    • Etanol, alcohol isopropílico, fenol o detergentes como SDS

    Si hay inhibidores presentes en la preparación de la plantilla, una dilución de 100 veces la plantilla de partida puede diluir suficientemente el inhibidor y permitir la amplificación. Alternativamente, puede ser necesaria la precipitación con etanol de la plantilla para resolver el problema.

    Referencias

    Schrader, C., et al. Inhibidores de PCR y ocurrencia, propiedades y eliminación. J Appl Microbiol. 113: 1014 y ndash1026 (2012).

    ¿Qué es el sobreciclado de PCR? ¿Cómo sé si mi producto está sobreciclado?

    El sobreciclado de la PCR ocurre cuando el ciclo va más allá de la fase exponencial de amplificación. El sobreciclado ocurre cuando ocurren los siguientes eventos durante la PCR:

    • Agotamiento de sustratos (dNTP o cebadores).
    • Los reactivos (dNTP o enzimas) ya no son estables a la temperatura de desnaturalización.
    • La polimerasa de la PCR es inhibida por el producto (pirofosfato, ADN dúplex).
    • Competencia por reactivos (dNTP y cebadores) por productos no específicos.
    • Disminución del pH de la reacción.
    • Desnaturalización incompleta / separación de hebras de productos a altas concentraciones de producto.

    El indicador de sobreciclado de la PCR es un frotis de fondo intenso con bandas indistinguibles cuando la reacción se resuelve en un gel de agarosa. Siempre se recomienda realizar una prueba preliminar para determinar el número mínimo de ciclos de PCR necesarios para producir un producto suficiente. El producto de la PCR permanece en la fase lineal de amplificación si el rendimiento del producto aumenta notablemente cada 3 & ndash5 ciclos. Encontramos eso sobreciclado El ADNc no produce una plantilla adecuada para ninguna aplicación posterior.

    ¿Qué tipos de mutaciones pueden ser causadas por la PCR?

    Las polimerasas de PCR pueden introducir diferentes tipos de mutaciones, incluidas sustituciones, deleciones e inserciones de una sola base. Las sustituciones de bases suelen estar provocadas por la incorporación errónea de un dNTP incorrecto durante la síntesis de ADN.

    Las polimerasas pueden generar mutaciones en lugares donde se pierden o se ganan uno o más nucleótidos. La frecuencia de este tipo de mutación puede depender de la secuencia y puede ser mayor en secuencias muy repetitivas. La mutación más común es la pérdida de un solo nucleótido, que podría ser el resultado de una desalineación de la plantilla-cebador dentro de una secuencia homopolimérica repetitiva. Los reordenamientos del ADN también pueden ocurrir cuando la polimerasa termina la síntesis en una hebra de ADN y continúa la síntesis después de que se produce el cebado en una hebra complementaria (es decir, PCR de salto o de cambio de hebra). Este tipo de mutación se produce cuando existe una alta homología entre diferentes regiones del ADN. El exceso de plantilla de ADN en la reacción también puede promover este tipo de mutación.

    ¿Qué factores contribuyen a las mutaciones introducidas por PCR?

    Los siguientes factores pueden contribuir a las mutaciones introducidas por PCR:

    • Concentraciones de dNTP desequilibradas
      Cantidades desiguales de los cuatro dNTP pueden aumentar la sustitución de bases hasta ocho veces. El uso de concentraciones iguales de los cuatro dNTP es fundamental para reducir la tasa de error de la polimerasa.
    • Alta concentración de enzimas
    • Tiempos de incubación prolongados
    • Falta de actividad exonucleasa 3 'y rarr5'
    • Concentración de magnesio
      La fidelidad es máxima cuando la concentración de Mg 2+ es equimolar a la concentración total de los dNTP. La fidelidad disminuye cuando aumenta la concentración de cationes divalentes libres.
    • pH de la reacción
      Bajar el pH de la reacción en tres unidades puede aumentar las sustituciones de bases hasta 60 veces. El pH bajo (& lt6.0) puede provocar una pérdida espontánea de purina.
    • Daño en el ADN
      El daño del ADN puede ocurrir a altas temperaturas, posiblemente aumentando la tasa de mutación. Una mutación frecuente es la desaminación de la citosina para producir uracilo.
    • La presencia de A se extiende en secuencias de cebadores.
    • Sobreciclaje
      La tasa de error aumenta cuando la concentración de ADN aumenta durante los ciclos finales de PCR. El número total de ciclos debe mantenerse al mínimo para producir el producto de PCR deseado sin errores.

    ¿Qué son los artefactos de PCR?

    Los siguientes son artefactos de PCR comunes:

    • Dímeros de imprimación
      Los dímeros de los cebadores se forman a través de la autocomplementariedad en el extremo 3 'de los cebadores de amplificación. Se sospecha de dímeros de cebadores si el producto se produce en una reacción sin molde (control negativo). Para evitar los dímeros de los cebadores, los cebadores no deberían tener complementariedad en sus extremos 3 '.
    • Productos de PCR quiméricos
      Los productos de PCR quiméricos pueden ser causados ​​por una plantilla extendida de forma incompleta. En otras palabras, la plantilla monocatenaria que no se ha replicado completamente debido a la terminación prematura de la polimerasa puede aparearse con una plantilla parcialmente homóloga. Esto crea productos de PCR quiméricos. Para minimizar las quimeras, utilice la menor cantidad posible de ciclos de amplificación por PCR.
    • Sesgo de PCR
      El sesgo de la PCR se produce cuando algunas secuencias se amplifican de forma más eficaz que otras debido a la unión preferencial de los cebadores de la PCR. Si una secuencia se amplifica un 10% más que otra en un ciclo, será 17,4 veces más abundante después de 30 ciclos. Para reducir el sesgo de la PCR, utilice una velocidad de rampa alta entre los pasos de desnaturalización y recocido y utilice temperaturas de recocido bajas. Deben evitarse los tiempos de extensión prolongados (& gt180 seg).
    • Deriva de PCR
      La deriva de la PCR se debe a una fluctuación estocástica en las interacciones de los reactivos de la PCR, particularmente en los primeros ciclos, cuando existe una concentración de plantilla muy baja. Este artefacto se observa en ensayos multiplex, donde la pérdida de sensibilidad es causada por las interacciones entre diferentes conjuntos de cebadores. Es importante diseñar cuidadosamente los cebadores para este tipo de ensayos.
    • La PCR genera productos de alto peso molecular que apenas migran a través del gel de agarosa
      No hay una buena explicación para este artefacto. La mayoría de los investigadores asumen que esto es causado por el sobreciclado, ya que en las últimas etapas de la PCR, se acumulan moléculas tanto monocatenarias como bicatenarias. La acumulación de tales moléculas monocatenarias puede crear heterodúplex compitiendo con los cebadores. La desnaturalización incompleta en etapas posteriores, cuando hay una alta concentración de productos de PCR, evita la separación de la cadena de ADN y, por lo tanto, un amplicón recién formado puede permanecer unido a la plantilla preparada previamente. Este proceso podría repetirse, atrapando los productos de la PCR en una red de moléculas.

    Otra explicación del origen de los frotis de alto peso molecular es la extensión parcial de las plantillas durante los ciclos iniciales de PCR. Se podrían generar extensiones parciales saltando artefactos y mdash cuando un cebador o ADN monocatenario se hibrida y se extiende desde un sitio de cebado, luego se hibrida parcialmente con un segmento homólogo en otro lugar (ver Productos de PCR quiméricos, más arriba). Las moléculas parcialmente extendidas pueden actuar como nuevos cebadores, ya que contienen un 3'-OH libre y podrían generar moléculas quiméricas que combinan el sitio de cebado inicial y el sitio de "salto".

    Finalmente, este tipo de artefacto también se puede generar cuando se usa una plantilla cruda para la PCR. Los productos amplificados directamente a partir de tejidos animales o vegetales pueden quedar atrapados en los desechos celulares, lo que evita que migren en el gel. Este problema puede resolverse mediante la digestión con proteinasa K del producto de PCR amplificado:

    • Antes de cargar sus muestras en un gel, agregue 1 & microlitro del tampón de carga que contiene Proteinasa K a 4 & microlitros de la reacción de PCR.

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    Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) | Biotecnología

    El artículo mencionado a continuación proporciona una guía para principiantes sobre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Después de leer este artículo, aprenderá sobre: ​​1. Historia del PCR 2. El principio de la reacción en cadena de la polimerasa 3. Requisitos de PCR 4. El ciclo de reacción de PCR 5. Análisis de productos de PCR 6. Aplicaciones 7. Precauciones e inconvenientes 8. Modificaciones.

    1. Historia del PCR
    2. El principio de la reacción en cadena de la polimerasa
    3. Requisitos de PCR
    4. El ciclo de reacción de la PCR
    5. Análisis de productos de PCR
    6. Aplicaciones de la PCR
    7. Precauciones e inconvenientes
    8. Modificaciones

    1. Historia del PCR:

    La idea de la PCR se le atribuye a Kary-Mullis, quien fue un científico investigador en la década de 1980 en una empresa de biotecnología de Cali & shyfornia llamada Cetus. Mullis, y otros cinco investigadores del Departamento de Genética Humana de Cetus, demostraron que los cebadores de oligonucleótidos podrían usarse para amplificar específicamente segmentos definidos de ADN genético (o ADNc). Mullis fue co-ganador del Premio Nobel de Química en 1993.

    2. El principio de la reacción en cadena de la polimerasa:

    La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una amplificación enzimática mediada por cebadores de secuencias de ADN genómicas o clonadas de forma específica. En este proceso tomamos el ADN con una secuencia diana que queremos amplificar, lo desnaturalizamos aumentando la temperatura y luego usamos un cebador específico de secuencia para la amplificación de nuestra secuencia diana con la ayuda de una ADN polimerasa ther & shymos-table.

    En esta técnica intentamos reproducir un entorno artificial en condiciones in vitro en las que la secuencia de ADN objetivo se somete a múltiples rondas de ciclo de replicación para producir una enorme cantidad de copias de nuestro gen objetivo.

    El proceso de PCR tiene tres pasos fundamentales:

    Paso 1:

    Desnaturalización del molde de ADN de doble hebra aumentando la temperatura y la temperatura a 94 & # 8211 98 ° C durante 30 segundos durante 2 minutos y 5 minutos.

    Paso 2:

    Recocido de dos cebadores de oligonucleótidos a la placa de timidez y temperatura monocatenaria bajando la temperatura a 50 - 65 ° C.

    Paso 3:

    Extensión enzimática de cebadores para producir copias que pueden servir como placas temporales en ciclos posteriores.

    3. Requisitos de PCR:

    (a) Plantilla de ADN:

    La molécula de ADN original que se va a copiar se llama plantilla de ADN y el segmento que se amplificará realmente se conoce como secuencia de alquitrán y timidez. Una pequeña cantidad de la plantilla de ADN es suficiente. Esto se puede obtener mediante cualquiera de las técnicas de aislamiento de ADN discutidas anteriormente.

    (b) Cebadores de PCR:

    Se necesitan dos cebadores de PCR para iniciar la síntesis de ADN. Estos son fragmentos cortos de ADN monocatenario que coinciden con las secuencias en cada extremo del segmento de ADN diana. Los cebadores de PCR se obtienen mediante síntesis química de ADN.

    Hay varios programas de computadora disponibles para sugerir cebadores adecuados para el proceso de PCR, y algunas de las guías generales y líneas brillantes se enumeran a continuación:

    Los cebadores más cortos tienden a aparearse y aparearse con la secuencia no diana de la plantilla de ADN. Esto dará como resultado la producción de copias de ADN que no tienen una secuencia diana. Cuanto mayor sea la complejidad de la plantilla de ADN, es más probable que esto suceda.

    Por tanto, un cebador corto puede ofrecer suficiente especificidad cuando se amplifica usando una plantilla simple, tal como un plásmido pequeño, pero puede volver a requerirse un cebador largo cuando se usa ADN genómico eucariota como plantilla. En la práctica, 20-30 nucleótidos es generalmente satisfactorio.

    No es necesario que los cebadores coincidan completamente con la plantilla, aunque el extremo 3 & # 8242 del cebador debe emparejarse correctamente con la plantilla, de lo contrario, la polimerasa no podrá extenderla. A menudo es beneficioso tener C o G como nucleótido terminal 3 & # 8242. Esto hace que la unión del extremo 3 & # 8242 de la imprimación a la placa temporal sea más estable de lo que sería con A o T en el extremo 3 & # 8242.

    3. Temperatura de fusión:

    Las temperaturas a las que los dos cebadores pueden asociarse con la plantilla deben ser relativamente similares para garantizar que ambos se unan aproximadamente al mismo tiempo que las temperaturas se reducen durante el recocido. Es probable que la similitud de las temperaturas de fusión signifique que los cebadores tienen una composición de nucleótidos similar.

    4. Estructura secundaria interna:

    Esto debe evitarse para evitar que la imprimación se doble sobre sí misma y no pueda unirse a la plantilla.

    5. Recocido Primer-Primer:

    También es importante evitar que los dos cebadores puedan recocerse entre sí. La extensión por la ADN polimerasa de dos primers y shyers auto-hibridados conduce a la formación de un dímero de cebadores.

    (c) ADN polimerasa termoestable:

    Se necesita la enzima ADN polimerasa para fabricar las copias de ADN. El fragmento de Klenow fue la primera enzima ADN polimerasa utilizada en PCR. El fragmento de Klenow es un gran fragmento de proteína producido cuando la ADN polimerasa I de E. coli es escindida enzimáticamente por la proteasa subtilisina.

    Después de la modificación enzimática, retiene la actividad polimerasa 5 & # 8242-3 & # 8242 y la actividad exonucleasa 3 & # 8242 → 5 & # 8242 para la remoción de nucleótidos pre-codificantes y la corrección y lectura, pero pierde su actividad exonucleasa 5 & # 8242 → 3 & # 8242.

    El fragmento de Klenow no pudo desempeñar un papel exitoso como enzima polimerasa por carecer de estabilidad a alta temperatura. Como sabemos que el procedimiento de PCR implica varios pasos de temperatura, en esta situación tuvimos que reponer la fragmentación de Klenow durante cada ciclo.

    Para resolver esto, se requirió ADN polimerasa resistente al calor. Esto provino originalmente de bacterias resistentes al calor que viven en aguas termales a temperaturas de hasta 90 ° C. En la actualidad, Taq poly & shymerase de Thermusaquaticus es la enzima PCR ADN polimerasa más utilizada. Generalmente se produce por expresión del gen en E. coli.

    La termoestabilidad de la enzima Taq ayuda a su purificación después de la expresión en E. coli, ya que las proteínas de E. coli contaminantes pueden activarse por calentamiento. La enzima tiene actividades 5 & # 8242-3 & # 8242 ADN polimerasa y 5 & # 8242-3 & # 8242 exonucleasa. Polimerizará alrededor de 50-60 nucleótidos por segundo. Sin embargo, la enzima enzimática tiene varias propiedades que pueden ser desventajosas.

    1. Taq Polymerase no tiene actividad de lectura de pruebas (exonucleasa 3 & # 8242-5 & # 8242):

    En consecuencia, aproximadamente un nucleótido de cada 104 en & shycorporated es incorrecto y los productos individuales de la PCR serán una población heterogénea.

    2. La polimerasa Taq tiene una procesividad relativamente baja:

    Esto significa que es probable que se disocie de la plantilla antes de que haya sintetizado un gran trozo de ADN.

    3. La polimerasa Taq no es completamente estable al calor:

    Tiene una vida media de aproximadamente 40 minutos a 95 ° C, lo que significa que habrá una pérdida significativa de actividad durante los aproximadamente 30 ciclos utilizados en un experimento típico de PCR. Por lo tanto, puede ser necesario agregar más enzima durante el transcurso de un experimento.

    4. Taq Polymerase incorpora un residuo Ex y shytra a:

    Esta se incorpora en el extremo 3 & # 8242 de la molécula sintetizada y no está codificada por molde. Hay varias polimerasas disponibles de otras especies de Thermus. Estos incluyen las enzimas Tfl y Tth de Thermusflavus y Thermusthermophilus respectivamente.

    Estos generalmente no tienen 3 & # 8242-5 & # 8242 ac y timidez de corrección de pruebas. Las polimerasas también están disponibles de otros géneros de bacterias (incluidas las arqueobacterias), y muchas de estas enzimas tienen actividad de corrección de pruebas 3 & # 8242-5 & # 8242 (lo que también significa que normalmente no añaden nucleótidos terminales que no están dirigidos por molde).

    En & shyzymes correctores incluyen Tli de Thermococcuslitoraiis y Pfu de Pyrococcusfuriosus. Estas bacterias marinas generalmente crecen a temperaturas incluso más altas que Thermusaquaticus, y las polimerasas son más termoestables que la enzima Taq.

    (d) Trifosfatos de desoxi nucleótidos:

    La polimerasa necesita un suministro de cuatro desoxinucleótidos trifos y shifatos, dATP, dCTP, dGTP y dTTP, para producir el nuevo ADN.

    (e) Máquina de PCR:

    Finalmente necesitamos una máquina de PCR para seguir cambiando la temperatura y la timidez. El proceso de PCR requiere un ciclo a través de varias temperaturas diferentes. Debido a esto, las máquinas de PCR a veces se denominan termocicladores.

    4. El ciclo de reacción de la PCR:

    La PCR es una reacción en cadena porque las cadenas de ADN recién sintetizadas actuarán como molde para una mayor síntesis de ADN en el ciclo posterior. Después de 25 ciclos de síntesis de ADN, los productos de la PCR incluirán, además del ADN inicial y tímido, aproximadamente 105 copias de la secuencia específica de destino y tímido.

    La PCR consta de una serie de ciclos de tres reacciones sucesivas:

    Paso de desnaturalización:

    Este paso es el primer evento cíclico regular y consiste en calentar la reacción a 94-98 ° C durante 20-30 segundos. Provoca la fusión de la plantilla de ADN al romper los enlaces de hidrógeno entre bases complementarias, produciendo moléculas de ADN monocatenarias.

    Paso de recocido:

    La temperatura de reacción se reduce a 50-65 ° C durante 20-40 segundos, lo que permite la hibridación de los cebadores con la plantilla de ADN monocatenario. Por lo general, la temperatura de recocido y tímido es de aproximadamente 3-5 grados Celsius por debajo de la Tmetro de los cebadores utilizados.

    La tmetro se puede determinar experimentalmente o calcular a partir de la siguiente fórmula:

    Tmetro = (4 x [G + C]) + (2 x [A + T]) ° C

    Los enlaces de hidrógeno ADN-ADN estables solo se forman cuando la secuencia del cebador coincide muy de cerca con la secuencia de la plantilla. La poli & timimerasa se une al híbrido cebador-molde y comienza la síntesis de ADN.

    Paso de extensión / alargamiento:

    La temperatura en este paso depende de la polimerasa de ADN utilizada. La polimerasa Taq tiene su temperatura de actividad opti & shymum a 75-80 ° C, y comúnmente se usa una temperatura de 72 ° C con esta enzima. En este paso, la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN complementaria a la cadena de la plantilla de ADN añadiendo dNTP que son complementarios a la plantilla en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242.

    El tiempo de extensión depende tanto de la ADN polimerasa utilizada como de la longitud del fragmento de ADN a amplificar. Como regla general, a su temperatura óptima, la ADN polimerasa polimerizará mil bases por minuto.

    En condiciones óptimas, es decir, si no existen limitaciones debido a sustratos o reactivos limitantes, en cada paso de extensión, la cantidad de ADN diana se duplica, lo que conduce a una amplificación exponencial (geométrica) del fragmento de ADN específico.

    Por ejemplo, si se comienza con una molécula de ADN de doble hebra simple, después de 20 ciclos, el número de moléculas mol y sintetizadas por PCR se convierte en 1 & # 21510 6, y después de 30 ciclos, el número de moléculas de ADN aumenta a 1 & # 21510 9.

    Este número se puede calcular con la ayuda de la siguiente fórmula:

    donde MF es el número final de moléculas de ADN producidas por PCR, MF es la cantidad inicial de moléculas de ADN y n es el número de ciclos de PCR.

    Alargamiento final:

    Este único paso se realiza ocasionalmente a una temperatura de 70-74 ° C durante 5-15 minutos después del último ciclo de PCR para asegurar que cualquier ADN monocatenario restante esté completamente extendido.

    5. Análisis de productos de PCR:

    La PCR se utiliza a menudo como una técnica para obtener información sobre la plantilla de ADN que lleva una secuencia diana específica. La investigación de la biotecnología depende en gran medida de la PCR en diversas situaciones. Por tanto, existen varios métodos para analizar los productos de la PCR.

    Las siguientes tres técnicas son importantes:

    (a) Electroforesis en gel de productos de PCR:

    Los resultados finales de la mayoría de los experimentos de PCR se confirman sometiendo una porción de la mezcla de reacción amplificada a electroforesis en gel de agarosa. Esto puede informarnos de la validez del experimento de PCR. Si no se encuentra la banda expuesta durante la visualización del gel, o si hay bandas adicionales, algo ha salido mal y se debe repetir el experimento.

    En algunos casos, la electroforesis en gel de agarosa se utiliza no solo para determinar si un experimento de PCR ha funcionado, sino también para obtener información adicional. También podemos determinar la presencia de un sitio de restricción en el ADN molde sometiendo el producto de PCR a endonucleasa de restricción antes de la electro y shiforesis.

    Este protocolo es un tipo de análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción y timidez (RFLP) que tiene una importancia inmensa en la construcción de mapas del genoma y el estudio de enfermedades genéticas. El análisis electroforético del producto de PCR también puede ayudarnos a identificar la mutación de inserción o desesquelación en la región amplificada.

    (b) Clonación de productos de PCR:

    Durante el experimento de clonación muchas veces tomamos la ayuda de la PCR directamente. Si el gen de interés y timidez está en una cantidad muy inferior, entonces necesitamos amplificarlo. Esto se hace con la ayuda de la PCR, que produce suficientes copias de nuestro ADN objetivo para que podamos permitirnos iniciar el experimento.

    (c) Secuenciación de productos de PCR:

    La secuenciación del producto de PCR se realiza con la ayuda de una máquina secuenciadora automática. No hay necesidad de radio-la, timidez y autorradiografía. Esta es una forma mejorada de secuenciar el ADN debido a su velocidad y porque puede ser analizado por computadora en lugar de una persona.

    La PCR tiene varias aplicaciones, especialmente donde la velocidad y el número de muestras a procesar son importantes o donde la cantidad de ADN disponible es muy limitada. Estas son algunas de las aplicaciones.

    Una. Secuencia ADN:

    La PCR en presencia de di-desoxinucleósido trifosfato (ddNTP), que se utiliza para la secuenciación de ADN, también permite que las reacciones de secuenciación de ADN se ejecuten con éxito con cantidades muy pequeñas de molde.

    B. Diagnóstico:

    La PCR es útil como herramienta de diagnóstico, por ejemplo, en la identificación de rasgos genéticos específicos o para la detección de patógenos y tímidos o contaminantes alimentarios. Una de las primeras aplicaciones de la PCR al diagnóstico genético fue la anemia de células falciformes.

    C. Forense:

    La capacidad de amplificar el ADN de regiones del genoma que son altamente polimórficas (y que son variables entre individuos) comenzando con muestras que contienen cantidades muy pequeñas de ADN (por ejemplo, pelos individuales o trazas de fluidos corporales, como sangre y semen) conduce a aplicaciones y timidez en el trabajo forense.

    D. Genética de poblaciones actual:

    Permite la determinación de frecuencias de alelos particulares en una gran colección de individuos. Una ventaja particular de la PCR us & shying en los estudios de genética poblacional es que, con cebadores específicos diseñados apropiadamente, puede ser posible amplificar el ADN de un organismo que no se puede separar de otros, como una cepa bacteriana particular en una población mixta.

    (Dichos cebadores se aparearán con el ADN diana del organismo de interés, pero no con el ADN de otros).

    Mi. Arqueología y Evolución:

    La PCR se puede utilizar tanto con material antiguo como con muestras más resistentes y, a menudo, es posible amplificar el ADN antiguo de especímenes de museos y restos arqueológicos. Se utiliza principalmente ADN mitocondrial o ADN de cloroplasto. Esto permite hacer inferencias sobre los orígenes de poblaciones o especies particulares.

    7. Precauciones e inconvenientes:

    I. Tamaño:

    El tamaño de los fragmentos que se pueden amplificar y reducir está limitado por la procesividad de la polimerasa utilizada. El uso de una mezcla de polimerasas que incluya una enzima de lectura y prueba aumenta el tamaño de proyducto que se puede obtener (hasta 10 kpb o más), porque los nucleótidos incorporados incorrectamente pueden eliminarse en lugar de causar la terminación de la cadena.

    Ii. Amplificando la secuencia incorrecta:

    La PCR depende de la capacidad de los cebadores para hibridar con la secuencia correcta, y esto depende de las condiciones de hibridación (concentración iónica, temperatura, etc.) y de la secuencia real (o secuencias si se incluyen sitios mixtos) de los cebadores.

    Es posible que los cebadores se hibriden con el & # 8220 incorrecto & # 8221 parte del ADN diana, mediante complementariedad al azar. Si esto sucede y los cebadores se aparean en la orientación correcta entre sí (es decir, dirigiendo la síntesis y la timidez entre sí) y en sitios que no están demasiado separados, entonces el resultado es la amplificación de una secuencia diferente a la deseada.

    La posibilidad de hibridación incorrecta puede evitarse mediante el uso de cebadores más largos, que serán más específicos en sus sitios de hibridación. Se puede aumentar la temperatura y ajustar y cambiar la concentración de iones de magnesio (que estabilizan la unión del cebador-molde) para aumentar la especificidad de la unión del cebador.

    Iii. Contaminación:

    Debido a la extraordinaria sensibilidad de la PCR, existe un peligro parcial de contaminar la muestra de ADN que se va a amplificar con material extraño. Esto es particularmente importante cuando se usa material que contiene solo pequeñas cantidades de ADN, como ocurre con el trabajo arqueológico.

    La contaminación puede ser de origen laboratorial (p. Ej., De aerosoles creados al pipetear soluciones que contienen secuencias de ADN relacionadas, incluido el material amplificado previamente mediante PCR) o de ori & shygin externo (quizás por contaminación bacteriana, fúngica o humana del tejido de la muestra).

    La contaminación del laboratorio puede minimizarse con precauciones como el uso y el diseño cuidadosos de las pipetas, la separación de las etapas pre-PCR y post-PCR de un experimento en diferentes salas. La contaminación de otras fuentes se puede reducir mediante la manipulación cuidadosa y tímida y la preparación de una muestra antes de la amplificación.

    Iv. Heterogeneidad de secuencia:

    La amplificación puede dar lugar a una mezcla de moléculas de secuencias ligeramente diferentes.

    Una mezcla puede surgir por varias razones:

    Si el ADN molde procede de un heterocigoto individual en el locus en cuestión, cada uno de los alelos presentes debería estar representado en cantidades similares en los productos de PCR.

    (b) Heterogeneidad de la población:

    Si el ADN de la placa temporal proviene de varios individuos en lugar de uno solo, la heterogeneidad y timidez en la población puede dar lugar a heterogeneidad en los productos.

    (c) Daño del ADN y error de polimerasa:

    La heterogeneidad también puede surgir del daño al ADN antes de la amplificación, especialmente si la muestra no se ha conservado cuidadosamente. Por lo tanto, es muy probable que esto sea un problema con el material arqueológico y forense.

    V. PCR de salto:

    Cuando se amplifica el ADN degradado, puede ser que cualquier molécula de muestra dada no sea lo suficientemente larga para abarcar toda la distancia entre los dos sitios de cebado. El resultado en la primera ronda de síntesis sería la extensión del cebador hasta el final de una molécula fragmentada, pero no hasta el segundo sitio del cebador.

    Sin embargo, en una ronda posterior de síntesis, el producto de amplificación truncado puede aparearse con un fragmento de ADN diferente que contiene la región restante intacta. Esto permitiría entonces la síntesis del producto de PCR completo. Esto se llama PCR de salto. Por tanto, a veces es posible generar productos de PCR que sean más largos que cualquier molécula molde individual. Esto puede ser ventajoso cuando se amplifica ADN mal degradado.

    8. Modificaciones:

    Una. PCR de inicio en caliente:

    Tan pronto como se hayan mezclado todos los reactivos de PCR, es posible que la ADN polimerasa comience la síntesis. Esto puede suceder mientras la mezcla de reacción se calienta por primera vez y está a una temperatura lo suficientemente baja como para permitir el recocido inespecífico de la imprimación a la plantilla, generando una gama de productos no específicos y no específicos.

    Este problema se evitaría si la síntesis de ADN no pudiera tener lugar hasta que el primer ciclo hubiera alcanzado su temperatura máxima. Ésta es la base de la PCR de inicio en caliente. En la forma más simple, la ADN polimerasa no se agrega a los tubos de reacción hasta que han alcanzado la temperatura de fusión del ADN del primer ciclo. Esto es satisfactorio cuando se procesan pequeñas cantidades de muestras, pero no en grandes cantidades.

    B. PCR de contacto:

    La temperatura de hibridación utilizada en la PCR convencional suele estar varios grados por debajo del máximo al que los cebadores pueden permanecer unidos a la placa de temperatura, para asegurar una unión estable. Sin embargo, este uso de una temperatura más baja permite una pequeña cantidad de desajuste entre los cebadores y la plantilla, lo que puede permitir que los cebadores se unan a sitios incorrectos y generen productos falsos.

    Los efectos de esto se pueden reducir con PCR de contacto. En esto, inicialmente se usa una temperatura de recocido alta (a la cual incluso puede que no sea posible unir y encoger correctamente). La temperatura de recocido se reduce en rondas posteriores. Por lo tanto, llegará un punto en el que el recocido de la plantilla del cebador correctamente emparejado será posible, pero el emparejamiento incorrecto no lo es y los productos deseados serán los más abundantes.

    C. PCR anidado:

    Aquí, se llevan a cabo dos PCR sucesivas. La primera PCR utiliza una plantilla convencional. Los productos de la primera PCR se utilizan luego como molde para la segunda PCR, con cebadores que están diseñados para aparearse dentro del producto deseado de la primera PCR.

    Aunque la primera PCR puede generar algunos productos no específicos además de los productos deseados, es poco probable que los productos inespecíficos también contengan sitios de hibridación para ambos cebadores usados ​​en la segunda PCR. Por tanto, es probable que sólo los productos deseados de la primera PCR sean moldes adecuados para la segunda.

    D. PCR inversa:

    Es posible disponer la amplificación de secuencias fuera de los cebadores, en una técnica llamada PCR inversa (IPCR). En esta técnica, la muestra de ADN se corta primero con una enzima fuera de la región cuya secuencia ya se conoce.

    A continuación, las moléculas lineales resultantes se circularizan mediante ligación en condiciones que favorecen las reacciones intermoleculares. Luego se realiza una segunda digestión de restricción, utilizando una enzima que corta dentro de la región de secuencia conocida.

    El resultado es ahora que el primer fragmento que contiene esta secuencia se ha dado la vuelta & # 8216 de adentro hacia afuera & # 8217, dejando la secuencia conocida en el exterior y el material que previamente lo había flanqueado por dentro. Ahora se pueden usar cebadores complementarios a la secuencia conocida en el exterior de la molécula y la molécula para amplificar la región de interés entre ellos.

    Mi. PCR con transcriptasa inversa:

    A menudo es conveniente amplificar moléculas de ARN, quizás como un precursor para clonarlas, o estimar la abundancia de un ARNm particular en una muestra. Por lo general, esto se hace mediante una ronda de transcripción inversa, utilizando una enzima transcriptasa inversa y un cebador único, para producir una sola hebra de ADNc antes de la propia PCR.

    El cebador para la transcripción inversa podría ser oligo-dT para la síntesis general de ADNc a partir de mensajes poliadenilados, o podría ser específico para un mensaje en particular.

    F. PCR in situ:

    Es posible realizar PCR utilizando tejido permeabilizado, como secciones delgadas en un portaobjetos de microscopio. Esto requiere una máquina de PCR especialmente adaptada para acomodar el portaobjetos. Si se puede detectar el producto de PCR (tal vez por hibridación y timidez, también in situ), entonces esto permite identificar en qué parte del tejido se encuentra el ácido nucleico diana.

    Gramo. PCR asimétrica:

    Al reducir la cantidad de uno de los dos cebadores, es posible disponer la amplificación preferencial de una de las hebras, lo que da como resultado una preparación de ADN monocatenario, que tiene varios usos en biología molecular. La amplificación preferencial de una hebra de esta manera se conoce como PCR asimétrica y tímida.

    H. PCR anclado:

    La PCR anclada se aplica cuando solo se conoce una parte de la secuencia (y por lo tanto, un sitio de cebado) para la región de interés. El objetivo es unir la región que se va a amplificar a un fragmento de secuencia conocida y luego usarla como segundo sitio de cebado.

    Hay dos formas en las que esto se puede hacer más fácilmente. Una es fragmentar el ADN de la muestra y ligarlo a moléculas de secuencia conocida, como un vector. Esta secuencia conocida se utiliza como base para diseñar uno de los dos cebadores de PCR. El segundo método consiste en agregar colas enzimáticamente a la muestra de ADN o las moléculas producidas después de la primera ronda de síntesis.

    I. PCR en emulsión:

    En una PCR convencional, las reacciones se llevan a cabo dentro de tubos de plástico. Es posible incorporar todos los reactivos dentro de gotitas de lípidos y realizar PCR a una escala mucho menor. Esto tiene ciertas ventajas. Es posible aumentar y disminuir la temperatura de pequeñas gotas muy rápidamente.

    Además, si cada gota contiene una única molécula de plantilla al principio, entonces todos los productos de una gota individual resultan de la multiplicación de una sola molécula de plantilla. El método también se llama PCR de gotas.

    J. Amplificación isotérmica:

    El calentamiento y enfriamiento repetidos que requiere la PCR limita la rapidez con que se puede llevar a cabo el proceso. Se ha desarrollado amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP), que permite amplificar las plantillas a una temperatura constante (normalmente alrededor de 65 ° C).

    Utiliza una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de hebras y evita la necesidad de calentar a altas temperaturas. Este método se utiliza para la detección de patógenos fuera de laboratorios especializados.

    K. PCR en tiempo real:

    Es posible utilizar la PCR para estimar la abundancia de una molécula de ácido nucleico en particular en una muestra. Esto se puede hacer mediante PCR en tiempo real. Esto se puede hacer de dos formas.

    En el primero, en la PCR está presente un colorante fluorescente de unión al ADN de doble hebra (dsDNA) (como el verde SYBR). A medida que se acumula el producto y el producto de dsDNA, la cantidad de fluorescencia del tinte aumenta, y esto puede ser detectado.

    El experimento requiere una máquina de PCR que también esté equipada con una instalación de medición de fluorescencia. Debido a que el método simplemente detecta dsDNA, mide la cantidad de producto de PCR en un momento dado independientemente de si es de la región correcta.

    El segundo enfoque para la PCR en tiempo real permite la detección de un producto específico, en lugar del dsDNA en general, y utiliza un oligonucleótido sonda especialmente sintetizado.Esta sonda está diseñada para aparearse dentro de la región que se va a amplificar y lleva un colorante indicador fluorescente en un extremo y un extintor en el otro extremo de la molécula.

    Si el atenuador y el informador están muy próximos (es decir, unidos al mismo oligonucleótido), entonces el atenuador detiene la fluorescencia del informador.

    Durante la PCR, la sonda se hibridará con el ADN monocatenario dentro de la región objetivo. Cuando la poli & timimerasa se encuentra con la sonda hibridada, la actividad exonucleasa 5 & # 8242-3 & # 8242 de la enzima degrada la sonda, liberando al informador del extintor. Por tanto, el indicador fluorescente se acumula durante el transcurso de la PCR. Este tipo de mecanismo de PCR se muestra en el diagrama anterior.


    PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

    Digamos que tiene una muestra biológica con trazas de ADN. Quiere trabajar con el ADN, quizás caracterizarlo mediante secuenciación, pero no hay mucho con lo que trabajar. Aquí es donde entra en juego la PCR. La PCR es la amplificación de una pequeña cantidad de ADN en una cantidad mayor. Es rápido, fácil y automatizado. Cantidades más grandes de ADN significan resultados más precisos y confiables para sus técnicas posteriores.

    La PCR se puede utilizar para crear una "huella digital" de ADN, que es única para cada individuo. Estas huellas dactilares de ADN pueden ser útiles en aplicaciones del mundo real relacionadas con pruebas de paternidad / maternidad, parentesco y forenses.

    La técnica fue desarrollada por el bioquímico premio Nobel Kary Mullis en 1984 y se basa en el descubrimiento de la actividad biológica a altas temperaturas de las ADN polimerasas encontradas en termófilos (bacterias que viven en aguas termales).

    La mayoría de las ADN polimerasas (enzimas que producen ADN nuevo) funcionan solo a bajas temperaturas. Pero a bajas temperaturas, el ADN está muy enrollado, por lo que las polimerasas no tienen muchas posibilidades de llegar a la mayoría de las moléculas.

    Pero estas ADN polimerasas termófilas funcionan a 100 ° C, una temperatura a la que se desnaturaliza el ADN (en forma lineal). Esta ADN polimerasa termófila se llama polimerasa Taq, que lleva el nombre de Thermus aquaticus, la bacteria de la que se deriva.

    La polimerasa Taq, sin embargo, no tiene capacidad de corrección de pruebas. Se ha descubierto que otras polimerasas térmicamente estables, como Vent y Pfu, funcionan tanto para la PCR como para la corrección de pruebas.

    Necesitará cuatro cosas para realizar la PCR en una muestra:

    1. La muestra objetivo. Esta es la muestra biológica de la que desea amplificar el ADN.

    2. Una cartilla. Hebras cortas de ADN que se adhieren al segmento objetivo. Identifican la porción de ADN que se va a multiplicar y proporcionan un punto de partida para la replicación.

    3. Taq polimerasa. Esta es la enzima que se encarga de replicar el ADN. Esta es la parte polimerasa del nombre reacción en cadena de la polimerasa.

    4. Nucleótidos. Deberá agregar nucleótidos (dNTP) para que la ADN polimerasa tenga componentes básicos con los que trabajar.

    Hay tres pasos principales para la PCR y se repiten una y otra vez, generalmente de 25 a 75 veces. Aquí es donde se aprecia más la automatización.

    1. Se calienta la muestra objetivo. Esto desnaturaliza el ADN, lo desenrolla y rompe los enlaces que mantienen unidas las dos hebras de la molécula de ADN, dejándote con ADN monocatenario (ssDNA).

    2. Se reduce la temperatura y se agrega la imprimación. Las moléculas del cebador ahora tienen la oportunidad de unirse (reasociarse) a las piezas de ssDNA. Esto marca las porciones de ADN que se amplificarán y proporciona un lugar de partida para la replicación.

    3. Se fabrican nuevas piezas de ssDNA. La polimerasa Taq cataliza la generación de nuevas piezas de ssDNA que son complementarias a las porciones marcadas por los cebadores. El trabajo de la polimerasa Taq es moverse a lo largo de la hebra de ADN y usarla como plantilla para ensamblar una nueva hebra complementaria a la plantilla. Esta es la reacción en cadena en el nombre de reacción en cadena de la polimerasa.

    La PCR es tan eficiente porque multiplica el ADN exponencialmente para cada uno de los 25 a 75 ciclos. Un ciclo toma solo un minuto más o menos y cada nuevo segmento de ADN que se crea puede servir como plantilla para otros nuevos.

    Quizás lo más importante que debe recordar es estar muy atento a la contaminación. Si, por ejemplo, sin saberlo, se quita un trozo de piel en su muestra, entonces tu El ADN puede amplificarse en la reacción de PCR. Aquí hay algunos otros factores para optimizar sus resultados con PCR:

    1. Temperatura de recocido. Comienza en el extremo inferior de lo que crees que funcionará y luego avanza según sea necesario. Si la temperatura es demasiado baja, los cebadores cometerán más errores y obtendrá demasiadas bandas cuando procese su muestra en un gel. Si la temperatura es demasiado alta, no obtendrá ningún resultado y su gel estará en blanco. Desea estar entre 3 ° C y 5 ° C por debajo de la temperatura de fusión (Tm). Una fórmula aproximada para determinar Tm es Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T).

    2. Concentración de magnesio. Desea que su concentración de Mg2 + sea de aproximadamente 1,5 mM a 3 mM. Si sube demasiado, la polimerasa cometerá más errores.

    3. Piense detenidamente en el diseño de la imprimación. Ambos cebadores deben tener aproximadamente la misma Tm para que ambos se templen a la misma temperatura. Dos de cada tres bases en el extremo 3 'deben ser G o C para obtener una buena hibridación (G y C tienen tres enlaces H, por lo que se obtiene una mejor polimerización). Por último, evite los dímeros de cebadores, que se producen cuando los cebadores tienen extremos que se aparean entre sí. Esto NO producirá ningún producto.

    4. Más no es necesariamente mejor. Más polimerasa produce un producto más inespecífico, por lo que no se limite a verter descuidadamente un montón de polimerasa. Además, las reacciones de PCR no funcionan si hay demasiado ADN.

    La polimerasa Taq no funciona en muestras de ARN, por lo que la PCR no se puede utilizar para amplificar directamente moléculas de ARN. Sin embargo, la incorporación de la enzima transcriptasa inversa (RT) se puede combinar con la PCR tradicional para permitir la amplificación de moléculas de ARN. Después de agregar su muestra de ARN a la máquina de PCR, agregue un cebador de ADN como de costumbre y permita que se hibride con su molécula objetivo. Luego agregue RT junto con dNTP, lo que alargará el cebador de ADN y hará una copia de ADNc de las moléculas de ARN y ejecutará la reacción PRC como de costumbre. El producto de la RT-PCR es una molécula de ADN bicatenaria análoga al segmento diana de la molécula de ARN.


    Ver el vídeo: PCR: Reacción en cadena de la polimerasa TEÓRICO Y PRÁCTICO (Octubre 2022).