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Estimación de la constante de difusión de una proteína en función del número de aminoácidos.

Estimación de la constante de difusión de una proteína en función del número de aminoácidos.


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¿Hay alguna forma de estimar la constante de difusión de una proteína en función de la cantidad de aminoácidos que la componen? Sé que la forma de la proteína influye en la constante de difusión, pero no sabía si había alguna estimación que todavía pudiera utilizarse con una buena aproximación.

Si esto no existe, ¿todavía hay una manera de aproximar la constante de difusión de ciertas proteínas? Estoy tratando de hacer un modelo aproximado basado en ecuaciones de reacción-difusión y quería estimar las constantes de difusión de ciertas especies en el modelo.


Preguntas sobre la hemoglobina (con respuestas)

(a) Tipo I, (b) Tipo II, (c) Tipo III, (d) Todas las anteriores.

6. La mayor abundancia que se encuentra en la naturaleza es

(a) Serie Tipo I, (b) Serie Tipo II, (c) Serie Tipo III, (d) Ninguna de las anteriores.

7. En la biosíntesis de porfirinas, la activación de la glicina necesita la coenzima.

8. La anemia se ha observado en la deficiencia de vitamina

(a) Biotina, (b) Inositol, (c) Niacina, (d) Ácido pantoténico.

9. Los compuestos de dipirrilo son de dos tipos

(a) A y B, (b) B y C, (c) A y C, (d) B y D.

10. Se produce una porfirina de tipo III con la condensación y la timidez de los componentes.

(a) Dos de (A), (b) Uno (A) y uno (B), (c) Dos de (B), (d) Uno (A) y uno (C).

11. La enzima coproporfirinógeno oxidasa puede actuar sobre el coproporfirinógeno.

(a) Tipo I, (b) Tipo II, (c) Tipo III, (d) Todas las anteriores.

12. En el hígado de los mamíferos, la reacción de conversión de corpoporfirinógeno en protoporfirina es necesaria.

(a) Oxígeno molecular, (b) Agua, (c) ATP, (d) B6-P04.

13. El hemo se sintetiza mediante la incorporación de iones ferrosos (Fe ++) en la protoporfirina III catalizada por la enzima.

(a) Ferroxidasa, (b) Ferroreductasa, (c) Ferroquelatasa, (d) Ninguna de las anteriores.

14. La globina de la hemoglobina es una proteína compuesta de cadenas polipeptídicas densamente empaquetadas

(a) 6 capas paralelas, (b) 4 capas paralelas, (c) 3 capas paral y shylel, (d) 2 capas paralelas.

15. Dos cadenas a de globina tienen una composición de aminoácidos idéntica de

16. El número total de aminoácidos en la globina.

17. La hemoglobina absorbe la cantidad de moléculas de oxígeno.

18. La carboxihemoglobina está formada por

19. Un mol de hemoglobina contiene residuos de histidina.

20. La metahemoglobina se forma como resultado de la oxidación y timidez de la hemoglobina por un agente oxidante.

(a) Oxígeno del aire, (b) Peróxido de hidrógeno, (c) Ferricianuro de po y shytassium, (d) Permanga y shynato de potasio.

21. La metahemoglobina se puede reducir a hemoglobina mediante

(a) Eliminación de hidrógeno, (b) Vitamina C, (c) Glu y timtatión, (d) Creatinina.

22. El color de la cianomehemoglobina.

(a) Amarillo, (b) Rosa, (c) Marrón, (d) Rojo brillante.

23. El hierro del hemo está coordinado en cadenas β en las posiciones

(a) 43 y 72, (b) 53 y 82, (c) 63 y 92, (d) 73 y 102.

24. La mioglobina contiene el número de átomos gramo de hierro por mol

25. Las catalasas contienen el número de átomos gramo de hierro por mol.

Rellenar los espacios en blanco:

1. Las mioglobinas son los pigmentos _____________ que se encuentran en las células_________ de los vertebrados e invertebrados y tímidos.

Resp. Músculo respiratorio.

2. El peso molecular de las catalasas es aproximadamente ____________.

3. La pirrolasa de triptófano cataliza la oxidación de ____________ a ____________.

Resp. Triptófano Formyl Kynurenine.

4. El papel fundamental de los citocromos está en ____________.

Resp. Respiración celular.

5. El citocromo C tiene un peso molecular de aproximadamente ____________ y ​​contiene ____________ hierro.

Resp. 13000 0,43 por ciento.

6. La cadena de péptidos del citocromo C del corazón humano contiene ____________ aminoácidos.

7. Las citocromo oxidasas pueden llevar tres tipos generales de reacciones, por ejemplo, transferencia de oxígeno ____________, ____________.

Resp. Oxidación de función mixta Transferencia de electrones.

8. La hemoglobina A tiene un peso molecular de _________ y ​​contiene _________ pares de cadenas de péptidos.

9. Las cadenas α de la hemoglobina A contienen__________ y ​​la cadena β contiene_________ aminoácidos.

10. La hemoglobina A fetal contiene_____________ y ​​la cadena β contiene ________ aminoácidos.

11. La hemoglobina fetal comprende el _________ por ciento de la hemoglobina total en el recién nacido.

12. La hemoglobina fetal absorbe __________ más leída y tímidamente a baja tensión de oxígeno y libera ____________ más fácilmente que la hemoglobina adulta (A).

13. La hemoglobina F se reemplaza gradualmente por___________ durante los primeros 6 meses de vida extrauterina.

Resp. Hemoglobina A.

14. La hemoglobina fetal es más resistente a la desnaturalización y timidez por ____________ y ​​es más susceptible a la conversión a meta-hemoglobina por ____________.

Resp. Nitritos alcalinos.

15. Algunas de las hemoglobinas anormales se diferencian fácilmente por sus movilidades electroforéticas y han dado lugar al concepto de ____________.

Resp. Enfermedad molecular.

16. El aminoácido ácido se reemplaza por un _____________ o ________ aminoácido para la formación de hemoglobina anormal y tímida a partir de la hemoglobina normal.

Resp. Neutro básico.

17. La anomalía de la hemoglobina C se encuentra en la cadena β en la posición_________, el aminoácido ácido glutámico se reemplaza por___________.

18. La hemoglobina C se caracteriza por ____________ leve con tendencia a ____________.

Resp. Infarto de anemia.

19. En la hemoglobina S__________ se desarrolla anemia y el________ se vuelve largo y en forma de bote.

Resp. RBC de células falciformes.

20. La anomalía en la hemoglobina S ocurre en la cadena ____________, el ácido glutámico en la posición 6 es reemplazado por ____________.

21. Si la HbF está presente en grandes cantidades en la sangre de los adultos, se vuelve ___________ produciendo ________ rápidamente.

Resp. Talasemia mayor hemolizada.

22. La anomalía de la hemoglobina M se encuentra en la cadena α, los residuos de histidina en las posiciones___________ y ​​_________ se reemplazan por______________.

Resp. 58 87 Tirosina.

23. Los agentes ____________ no reducen la metahemoglobina a __________.

Resp. Reductor de hemoglobina.

24. La tripsina divide los péptidos de la hemoglobina en puntos donde solo ocurren ____________ y ​​________.

Resp. Lisina Arginina.

25. Met-hemoglobina es una _____________ hemoglobina ____________ está en la combinación firme.

Resp. Oxígeno oxidado.

26. Cuando la concentración de metahemoglobina alcanza________ por 1000 ml de sangre, generalmente se desarrolla __________.

Resp. 3 gramos de cianosis.

27. La metahemoglobina está presente en _____________ normal aproximadamente el _________ por ciento de la hemoglobina total.

Resp. Eritrocitos 0.4.

28. La hemoglobina __________ se combina con ___________ para formar sulfhemoglobina.

Resp. H reducido2S.

29. La sulfhemoglobina también se observa en sujetos con marcada __________ en presencia de bacterias ____________ pro y reductoras de la timidez en el intestino.

Resp. Nitrito de estreñimiento.

30. La carboxihemoglobina está formada por la combinación de ____________ con ____________ en la molécula de hemoglobina.

31. La carboxihemoglobina es producida por la exposición excesiva a ____________ de iluminación artificial y a __________ de automóvil en habitaciones cerradas o mal ventiladas.

Resp. Gas Gases de escape.

32. Se dice que la condición por la cual aumenta la excreción de coproporfirina y uroporfirina es ____________.

33. La profiria eritropoyética tiene tendencia a ____________ y ​​____________ defectuosa.

Resp. Eritropoyesis por hemólisis

34. En la protoporfiria eritropoyética, hay un aumento de ____________ y ​​____________ en los eritrocitos circulantes, el plasma y las heces.

Resp. Protoporfirina Uroporfirina.

35. La porfiria aguda intermitente se debe a un marcado aumento de la ____________ hepática.

Resp. ALA sintasa.

36. En la porfiria aguda ____________ se produce un aumento de la PBI sérica y la hipercolesterolemia.

Resp. Intermitente.

37. En la porfiria variegata hay un aumento de la ____________ hepática.

Resp. ALA sintasa.

38. La coproporfiria hereditaria provoca un aumento de la producción de ____________ y ​​____________ uri y shynary durante los ataques agudos.

Resp. Porfobilinógeno ALA.

39. La porfiria adquirida es causada por enfermedades ___________ graves y la ingestión de ciertas ___________.

Resp. Toxinas hepáticas.

40. En la porfiria adquirida, aumenta la excreción y la timidez de ____________ en la orina.

Resp. Uroporfirina.

41. La porfiria cutánea tarda muestra un aumento frecuente de la ____________ sérica.

42. Las porfirinas son compuestos___________ con estructura __________.

Resp. Tetrapirrol cíclico.

43. El hierro en estado _________ está unido al átomo _________ de los anillos pirrol.

Resp. Nitrógeno ferroso.

44. El hierro también está unido internamente al nitrógeno del anillo __________ de _________ de las cadenas polipeptídicas.

Resp. Imidazol histidina.

45. El ácido propiónico de __________ y ​​________ posición del hemo de los pirroles III y IV también están ligados a los aminoácidos __________ y ​​_______ de la cadena polipeptídica respectivamente.

Resp. Sexta Séptima ariginina lisina.

46. ​​La globina de la hemoglobina es una___________ que está compuesta de___________ capas paralelas de cadenas ___________ muy compactas.

Resp. Polipéptido de la proteína 4.

47. Cada una de las dos cadenas alfa de globina tiene___________ aminoácidos y cada una de las dos cadenas restantes tiene ________ aminoácidos. Por lo tanto, el número total de aminoácidos en la globina es __________.

Resp. 141 146 574.

48. La molécula de hemoglobina y sus subunidades contienen ________ aminoácidos internamente y ______________ aminoácidos en sus superficies. Entonces forman ____________.

Resp. Bolsillos hidrofóbicos hidrofóbicos & # 8220heme & # 8221.

49. En & # 8220heme bolsillos & # 8221 las subunidades permiten la entrada de la molécula _________ pero la misma entrada en la subunidad está bloqueada por residuos___________.

Resp. Valina de oxígeno.

50. La cantidad de hemoglobina que se rompe cada día en un adulto normal es aproximadamente____________ que contiene ________ de hierro.

Resp. 8 g 27 mg.

51. La protoporfirina produce aproximadamente _________ de bi y shilirrubina.

52. Cuando la hemoglobina se cataboliza en el cuerpo, la globina se reutiliza__________ o en la forma de su constituyente__________ y ​​el hierro ingresa_________ para su reutilización.

Resp. Como tales aminoácidos ferritina & # 8220pool & # 8221

53. La coleglobina se forma a partir de la hemoglobina por ____________ en presencia de ____________.

Resp. Ácido ascórbico de oxígeno.

54. La bilirrubina se forma a partir de biliverdina por_______ en presencia de__________ o____________.

Resp. Bilirrubina reductasa NADP + NAD *.

55. La bilirrubina se conjuga con UDP-ácido glucurónico por la enzima__________ para formar___________ que puede atravesar__________.

Resp. Filtro glomerular UDP-glucuroniltransferasa bilirrubina diglucurónido.

56. La actividad de la glucuroniltransferasa es inhibida por ____________.

Resp. Novobiocina.

57. El urobilinógeno al exponerse al oxígeno se oxida a ____________ lo que da la ____________ de las heces.

Resp. Oscurecimiento de la urobilina.

58. En la anemia de células falciformes, la hemoglobina____ aparece debido a una anomalía de la cadena donde ________ se reemplaza por ____________ en la posición ________.

Resp. δ β ácido glutámico valina 6.

59. Las células falciformes son más ________ y ​​provocan _____________ y__________.

Resp. Ictericia por anemia hemolítica frágil.

60. Las personas que padecen anemia de células falciformes muestran una mayor resistencia a_________ y_________, la infección se encuentra más en esta enfermedad.

Resp. Paludismo por Salmonella.

Indique & # 8220True & # 8221 o & # 8220False & # 8221 de los siguientes:

1. La clorofila es pórfido y shyrin que contiene magnesio y el pigmento fotosintético de las plantas.

2. La clorofila y el hemo de la hemoglobina se sintetizan en las células vivas por diferentes vías.

3. La condensación de succinato activo y glicimicina es catalizada por la enzima Amlev sintetasa.

4. Dos moles de Amlev se condensan para formar porfo y timibilinógeno catalizados por la enzima Amlev deshidrasa.

5. El tripirrilmetano se forma mediante la condensación de 2 moles de porfobilinógeno.

6. En baja tensión de oxígeno, la oxihemoglobina absorbe más oxígeno.

7. La histidina contenida en la hemoglobina ejerce su acción abrillantadora y escalofriante a través de su anillo de imidazol básico para el cual la hemoglobina juega un papel importante en la regulación del equilibrio ácido-base de la sangre.

8. La metahemoglobina puede transportar oxígeno en sangre.

9. La sulfemoglobina formada por la administración de ciertos medicamentos continúa en la sangre y puede convertirse en hemoglobina.

10. La hemoglobina reducida en los espectros de absorción muestra una única banda ancha en la región verde.

11. La oxihemoglobina en los espectros de absorción muestra tres bandas.

12. La biosíntesis de la hemoglobina tiene lugar en las células a del páncreas.

13. El hierro en estado ferroso se incorpora a la proytimtoporfirina para formar hemo.

14. El hierro del hemo está coordinado con 2 nitrógeno imidazol de histidina en las posiciones 36 y 85.

15. La función de las eritrocruorinas es diferente a la de la hemoglobina.

16. Las catalasas son enzimas porfirinas de zinc.

17. En las plantas, las actividades de las catalasas son significativas.

18. Los citocromos son porfirinas de hierro y actúan como agentes de transferencia de electrones en las reacciones de oxidación y reducción.

19. La forma reducida del citocromo C es autooxidable.

20. Citocromo Q3 se encuentra en el riñón.

21. La metahemoglobina también funciona como vehículo de oxígeno y shyrier.

22. Las porfirias son de dos tipos: congénitas y adquiridas.

23. La porfiria eritropoyética provoca una excreción muy aumentada de uroporfirina I y una excreción menor de coproporfirina I tanto en la orina como en las heces.

24. La coproporfiria eritropoyética muestra grandes cantidades de coproporfirina II en los eritrocitos.

25. La porfiria aguda intermitente causa ataques periódicos de dolor abdominal que se asocian con fiebre y leucocitosis.


Un renacimiento de las técnicas clásicas

La degradación de Edman, la EM y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se han utilizado ampliamente para la secuenciación e identificación de proteínas / péptidos durante varias décadas, por lo que no es de extrañar que se estén buscando nuevas mejoras de estas tecnologías clásicas. La comunidad de la biofísica ha estado desarrollando métodos para aumentar el rendimiento 5 y la sensibilidad 6 del ELISA de una sola molécula, la degradación de Edman, la EM de una sola partícula, la EM nanomecánica de partículas neutras y la electropulverización de una sola partícula. Incluso las herramientas establecidas comúnmente utilizadas en la ciencia de los materiales, como los túneles eléctricos y las mediciones de corriente continua, pueden reutilizarse para la secuenciación de proteínas.

Degradación de Edman masivamente paralela

La degradación de Edman 7 fue el primer método para determinar la secuencia de aminoácidos de un péptido purificado. El método implica la modificación química del aminoácido N-terminal, la escisión de este aminoácido del péptido y la determinación de la identidad del aminoácido marcado escindido usando cromatografía líquida de alta resolución. Hasta hace poco, realizar una secuenciación de este tipo de forma masivamente paralela no era factible porque el método requiere péptidos altamente purificados. Sin embargo, las estrategias multiplex recientes que utilizan matrices de péptidos y secuencian péptidos marcados químicamente ("secuenciación fluorada") o detectan sucesivamente el aminoácido N-terminal están logrando avances.

La fluorosecuenciación combina la química de Edman, la microscopía de una sola molécula y la química del fluoróforo sintético estable (Fig. 2a). Las proteínas se digieren en péptidos más cortos y se inmovilizan en una superficie de vidrio utilizando el terminal C 8. Millones de péptidos individuales marcados con fluorescencia se pueden visualizar en paralelo, y las intensidades de fluorescencia cambiantes se controlan a medida que los aminoácidos N-terminales se eliminan secuencialmente a través de múltiples rondas de degradación de Edman. Las firmas de fluorescencia resultantes sirven para identificar de forma única los péptidos individuales 8. Este método permite secuenciar en paralelo millones de moléculas de péptidos distintas, identificarlas y cuantificarlas digitalmente en una escala de zeptomol 9. Los aminoácidos específicos se marcan covalentemente con fluoróforos distinguibles espectralmente, y la huella del péptido proviene de medir la disminución de la fluorescencia de los péptidos después de la degradación de Edman 9. Al igual que en la EM, la secuencia parcial se asigna de nuevo a un proteoma de referencia dentro de un marco probabilístico.

a,B, Fluorosecuenciación de alto rendimiento por degradación de Edman con modificación química específica de aminoácidos de péptidos con fluoróforos (a) y reconocimiento de aminoácidos N-terminales utilizando una pluralidad de sondas (B). CLa MS de partículas neutras es una técnica prometedora para caracterizar proteoformas. Actualmente, la tecnología se puede utilizar para caracterizar grandes complejos a escala de megalton utilizando nanosensores basados ​​en silicio. Los nanosensores de grafeno y otros desarrollos pueden impulsar la tecnología hacia proteínas cada vez más pequeñas y potencialmente conducir a una mayor cobertura de secuencia en la proteómica global. ESI, ionización por electropulverización. DLa electropulverización de nanoporos es una combinación de nanoporos, electropulverización clásica y técnicas de detección de partículas individuales para secuenciar proteínas individuales midiendo los aminoácidos de uno en uno. Panel a adaptado con permiso de la ref. 9, Springer Nature.

La tecnología no está exenta de desafíos, ya que los reactivos utilizados para la química de degradación de Edman conducen a mayores tasas de destrucción del tinte fluorescente, lo que a su vez limita la longitud de lectura. Estos reactivos incluyen estructuras ligeramente básicas como piridina, ácidos fuertes como ácido trifluoroacético y el electrófilo fenil isotiocianato. Además, la dependencia del etiquetado químico conduce a la secuenciación parcial del péptido, y el resto no identificado se infiere por comparación con un proteoma de referencia. Además, el etiquetado ineficaz puede conducir a errores que deben modelarse en la comparación de proteoma de referencia, lo que estimula el desarrollo de nuevos protocolos para aumentar los rendimientos [10]. Nuevas y emocionantes propuestas podrían agregar la dimensión de la secuenciación basada en protonación. La pKa del aminoácido N-terminal podría utilizarse para la identificación mediante la observación e interpretación de la señal de protonación-desprotonación del péptido a pH fijo a través del proceso de degradación de Edman 11. Al igual que la secuenciación fluorada, la señal observada sería para el péptido completo y el patrón de desintegración se interpretaría para derivar una pKa para cada aminoácido N-terminal.

Varias proteínas naturales y moléculas de ARN reconocen aminoácidos específicos como aminoácidos libres o como parte de una cadena polipeptídica 12. Estas proteínas y ácidos nucleicos proporcionan diferentes soluciones para el reconocimiento de aminoácidos N-terminales. Cada sonda de unión de aminoácidos N-terminal (NAAB) identifica selectivamente un aminoácido N-terminal específico o un derivado de aminoácido N-terminal. Con cada ciclo, se revela otro aminoácido en la secuencia del péptido. Sin embargo, se requiere una mayor evolución e ingeniería dirigidas de las sondas NAAB para cumplir con los estrictos requisitos de afinidad, selectividad y estabilidad para aplicaciones de secuenciación sin errores. Además, tales sondas necesitarían discriminar entre todos los aminoácidos, incluido el mismo aminoácido en posiciones alternativas en la secuencia de péptidos. Las sondas que se unen a una clase de aminoácidos N-terminales (por ejemplo, residuos alifáticos cortos) también podrían ser útiles pero introducirían ambigüedad en el proceso de secuenciación. También se podrían diseñar diferentes sondas para reconocer terminales N cortos k-mers, que aumentarían el número de sondas necesarias pero reducirían la ambigüedad en la información de secuenciación resultante.Para sortear esta limitación, puede ser posible secuenciar el aminoácido N-terminal mediante reconocimiento selectivo utilizando una pluralidad de sondas en cada ciclo de degradación de Edman 13,14 (Fig. 2b).).

Espectrometría de masas de una sola molécula

MS es un método centenario que mide la masa-carga (metro/z) relación de iones, en particular, péptidos / proteínas cargados y sus ensamblajes. La detección de iones únicos ha sido posible desde la década de 1990, por ejemplo, en los instrumentos de resonancia de ciclotrón de iones de transformada de Fourier 15. La MS de detección de carga (CDMS) es un método de ion único en el que la asignación de carga de cada ion individual se determina directamente, lo que permite la conversión de la relación masa-carga en el dominio de masa neutra. Este enfoque se ha centrado en el análisis de grandes complejos biomoleculares, especialmente virus en el rango de 1 a 100 MDa [16]. Mientras que anteriormente el CDMS se limitaba a la instrumentación especializada, el año pasado se han producido avances basados ​​en trabajos iniciales de producción de espectros de masas de iones individuales en los analizadores de masas Orbitrap 17,18,19. Hoy en día, estos analizadores de masas se pueden utilizar para derivar directamente los estados de carga de proteínas individuales e incluso sus iones de fragmentos 20. Los instrumentos Orbitrap son particularmente útiles porque la lectura de iones individuales se puede multiplexar de 100 a 1000 veces en CDMS 20 basado en Orbitrap. La MS de iones individuales ya ha mostrado la resolución de mezclas con aproximadamente 1,000 proteoformas que no proporcionaron datos usando MS estándar 20,21. Esto ha ampliado enormemente el enfoque de arriba hacia abajo para confirmar las secuencias de proteínas completas inferidas por el ADN, incluida la localización de sus modificaciones postraduccionales 20,21,22. Por lo tanto, sin una gran alteración, los analizadores de masas Orbitrap pueden medir decenas de miles de proteínas en cuestión de minutos. Con estas tecnologías de rápida evolución, ya se ha comenzado a trazar el atlas completo de proteoformas humanas 23, avanzando hacia un proyecto integral de proteoformas humanas. Sin embargo, la ionización es un requisito crítico para la EM de proteínas y péptidos, y no todos los péptidos se ionizan y transmiten de manera eficiente a través del espectrómetro de masas. Esto podría restringir algunos de los esfuerzos de mapeo de proteoformas, proporcionando un nicho para las otras tecnologías en la Fig.1.

Para especies de mayor peso molecular, la ionización de proteínas y complejos produce una mezcla de macro iones con estados de carga variables, lo que resulta en una reducción neta de la sensibilidad a medida que la señal se distribuye sobre múltiples picos en la dimensión masa-carga. Además, las distribuciones del estado de carga pueden superponerse por encima de una cierta masa o en el caso de mezclas, creando desafíos en la identificación de especies. Desde sus inicios 24, los sensores de masa nanomecánicos han avanzado enormemente hacia la caracterización de proteínas 25. Dichos dispositivos, que toman la forma de voladizos o vigas con dimensiones laterales en el rango de cientos de nanómetros, pueden detectar partículas individuales que se acumulan en su superficie activa a través de cambios en la frecuencia de vibración. Es importante destacar que, como la masa inercial de una partícula se determina directamente a partir del cambio de frecuencia, estos dispositivos son insensibles a los estados de carga 26. Este descubrimiento impulsó el desarrollo de nuevos diseños de instrumentos de EM sin guías de iones, que ya no dependen de campos electromagnéticos para recolectar y transmitir analitos (Fig. 2c). Se ha demostrado recientemente que un sistema de EM basado en resonador nanomecánico de este tipo tiene la capacidad de caracterizar conjuntos de proteínas grandes, como cápsides virales individuales por encima de 100 MDa de tamaño 27. Fuera de la proteómica, se ha demostrado una resolución de 1 Da con nanotubos de carbono 28. Además, informes recientes sugieren la posibilidad de determinar otros parámetros físicos como la rigidez o la forma del analito mediante la monitorización de múltiples modos vibracionales 29,30. Estas métricas previamente inaccesibles pueden abrir nuevas vías para discriminar péptidos, proteínas y sus complejos. No obstante, uno de los desafíos del espectrómetro de masas con nanoresonador radica en idear formas eficientes de llevar proteínas individuales a la superficie activa del resonador para la detección de masas.

La ionización se logra comúnmente mediante la ionización por electropulverización de una solución que contiene el compuesto o compuestos de interés. El uso de aberturas de fuente de iones de electropulverización cada vez más pequeñas ha conducido a mejoras sustanciales en la sensibilidad de MS 31,32. Se han desarrollado espectrómetros de masas con una fuente de iones de nanoporos con el fin de secuenciar proteínas individuales 33 (Fig. 2d). Un electropulverizador de nanoporos puede potencialmente entregar iones de aminoácidos individuales directamente en una fase gaseosa de alto vacío, donde los iones pueden detectarse de manera eficiente por sus proporciones de masa a carga. Esto abre un camino para secuenciar los péptidos un aminoácido a la vez. El concepto hace uso de nanoporos para guiar una proteína en una configuración lineal de modo que sus monómeros puedan ser entregados al espectrómetro de masas secuencialmente 34. Los aminoácidos individuales deben escindirse de la molécula de proteína a medida que transita por el nanoporo, lo que potencialmente podría lograrse con métodos de fotodisociación 35 o digestión química. El ancho de banda de 100 MHz de los detectores de ion único channeltron utilizados en esta configuración también es suficiente para resolver el orden de llegada de los iones. La alta resolución de masa hace que esta técnica sea prometedora para identificar modificaciones postraduccionales, que cambian las masas de aminoácidos particulares en cantidades predecibles. Un desafío en el camino de esta tecnología será lograr un alto rendimiento, lo que podría requerir una estrategia para paralelizar el análisis de masas.

Mediciones de conductancia de tunelización

La aparición del microscopio de túnel de barrido en la década de 1980 introdujo una nueva forma de analizar moléculas. Las pequeñas moléculas orgánicas pueden quedar atrapadas transitoriamente entre dos electrodos metálicos con una separación subnanométrica, y las corrientes de efecto túnel entre los electrodos informan sobre la firma molecular del analito. Recientemente, se han realizado varios avances técnicos para avanzar hacia el análisis de proteínas y aminoácidos de una sola molécula. La extracción de información perspicaz de la tunelización de electrones se complica por el ruido resultante del agua y los contaminantes que llegan a las superficies de los electrodos. Para superar este problema, se ha desarrollado un túnel de reconocimiento en el que los electrodos se modifican covalentemente con moléculas adaptadoras que forman enlaces transitorios pero bien definidos con la molécula diana 36. Las señales de la corriente del túnel que fluctúan rápidamente se procesan utilizando algoritmos de aprendizaje automático, lo que hace posible distinguir aminoácidos individuales y péptidos pequeños 37. Además, se han introducido huecos de electrodos más pequeños para obtener señales distintas de diferentes aminoácidos y modificaciones postraduccionales 38. Un mayor desarrollo de la tecnología dependerá de una fuente confiable de uniones de túnel con un espacio definido para reemplazar la incómoda microscopía de túnel de barrido, pero está claro que se pueden determinar tanto la secuencia como las modificaciones postraduccionales de péptidos pequeños 37. Actualmente, la conductancia de túnel es una tecnología de prueba de concepto para secuenciar completamente péptidos cortos que algún día podrían usarse para el análisis de digestiones de proteínas y expandirse al análisis de modificaciones postraduccionales (Fig. 1).

Recientemente, se descubrió que las cargas eléctricas pueden transmitirse a través de una proteína si los electrodos están puenteados por una proteína a través de la formación de enlaces químicos o la unión de ligandos 39. Específicamente, los cambios en la conformación de la proteína tras la adición de nucleótidos podrían seguirse en tiempo real a partir de las corrientes directas que pasan a través de una ADN polimerasa 40. Aunque la observación fue preliminar, las firmas electrónicas fueron distintivas cuando la polimerasa se asoció con diferentes secuencias de ADN, lo que permitió un nuevo enfoque para la secuenciación de ADN de una sola molécula sin etiquetas. Se podría usar un enfoque similar para la secuenciación de proteínas con enzimas como proteasas o glicopeptidasas que procesan sustratos secuencialmente.


Abstracto

Se ha utilizado una parametrización estructural de las energéticas de plegamiento para predecir el efecto de mutaciones de un solo aminoácido en ubicaciones expuestas en hélices α. Los resultados se han utilizado para derivar una escala termodinámica basada en la estructura de las propensiones de hélice α para los aminoácidos. El análisis termodinámico basado en la estructura se realizó para cuatro sistemas diferentes para los que se dispone de datos termodinámicos estructurales y experimentales: lisozima T4 [Blaber et al. (1994) J. Mol. Biol. 235, 600-624], barnasa [Horovitz et al. (1992) J. Mol. Biol. 227, 560-568], una cremallera de leucina sintética [O'Neil & amp Degrado (1990) Ciencia 250, 646-651] y un péptido sintético [Lyu et al. (1990) Ciencia 250, 669-673]. Estos estudios han permitido la optimización del conjunto de áreas superficiales accesibles al solvente (ASA) para todos los aminoácidos en el estado desplegado. Se muestra que un solo conjunto de parámetros de estructura / termodinámicos explica bien todos los conjuntos de datos experimentales de propensiones a hélice. Para la lisozima T4, el valor medio de la diferencia absoluta entre el Δ previsto y el experimentalGRAMO Los valores son 0.09 kcal / mol, para barnasa 0.14 kcal / mol, para la bobina en espiral sintética 0.11 kcal / mol y para el péptido sintético 0.08 kcal / mol. Además, este enfoque predice bien la estabilidad general de las proteínas y racionaliza las diferencias en las propensiones de hélice α entre los aminoácidos. La excelente concordancia observada entre Δ prevista y experimentalGRAMO Los valores de todos los aminoácidos validan el uso de esta parametrización estructural en los cálculos de energía libre para el plegado o la unión.

Con el apoyo de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (RR04328 y GM51362). ILLINOIS. es un estudiante visitante de la Universidad de Granada, Granada, España, parcialmente apoyado por una beca del Ministerio de Educación y Ciencia (PB93-1163).

La correspondencia debe dirigirse a este autor. Voz: (410) 516-7743. Fax: (410) 516-6469. Correo electrónico: [email & # 160protected]


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Espectros de absorbancia de moléculas biológicas.

Proteinas

Las proteínas no se absorben en la longitud de onda visible a menos que tengan un grupo protésico (por ejemplo, Fe 2+) o un aminoácido no natural. Sin embargo, los aminoácidos triptófano, tirosina y cisteína absorben la luz en la longitud de onda UV:

Figura 5.3.1:Absorción de triptófano

  • El triptófano tiene un pico de absorción a 280 nm en el rango UV
  • Esta es una longitud de onda útil para cuantificar la absorción de triptófano.
  • Dado que la absorción es proporcional a la concentración, esta es una forma útil de cuantificar la concentración de proteínas (para proteínas que contienen Trp)

Ácidos nucleicos

Los anillos aromáticos en las bases de los ácidos nucleicos también absorben en el rango UV:

Figura 5.3.2: Absorción de AMP

  • Cada base de ADN y ARN tiene un espectro de absorción ligeramente diferente.
  • 260 o 280 nm es una longitud de onda típicamente útil para controlar la concentración de ácidos nucleicos

Tenga en cuenta que las muestras de ácidos nucleicos y proteínas pueden absorberse a 280 nm, por lo tanto, las muestras de moléculas biológicas deben ser puro para cuantificar usando espectroscopia de absorción UV (cualquier ácido nucleico contaminante en una muestra de proteína aumentará la absorbancia aparente, al igual que para las proteínas contaminantes en una muestra de ácido nucleico).


Métodos

Covariación entre frecuencias de equilibrio

Para la covariación entre las frecuencias de equilibrio que se muestran en la Figura 1, se seleccionaron sitios aleatorios de la base de datos Pfam 29.0 30 conjunto de alineaciones de proteínas. Para cada uno de estos estados, se extrajeron las frecuencias de equilibrio para cada par de aminoácidos empleando la ponderación de secuencia desarrollada por Henikoff y Henikoff. 54 Sólo se consideraron alineaciones mayores de 100 sitios con más de 100 secuencias, y se excluyeron los sitios con espacios en más del 50% de las secuencias (ponderadas). Estas frecuencias de equilibrio se utilizaron para calcular intercambiabilidades (Fig. 2) utilizando la Ec. (5).

Número efectivo de aminoácidos accesibles y tasa de sustitución correspondiente

Para los modelos de sustitución estándar (por ejemplo, Dayhoff, WAG, JTT, Blossum62, LG), se utilizaron las frecuencias de equilibrio publicadas para calcular el número efectivo de aminoácidos accesibles utilizando la Ec. (6). La tasa de sustitución general en relación con la tasa neutral. También se calculó utilizando estas frecuencias de equilibrio utilizando (7) donde se calcula con la ecuación. (3) usando el número de codones que codifican cada aminoácido (DX) calcular , y se calcula basándose en el modelo de nucleótidos K80 ( ). 55 Los cálculos con los modelos CAT 36 se realizaron de manera similar, promediando el conjunto de modelos de clase de sitio. Cada punto del conjunto de Pfam 30 representa el promedio de una única alineación de proteína.

Simulaciones evolutivas

(8)

Comenzando con una secuencia aleatoria de codones (excluyendo los codones de terminación), se calculó la tasa de todas las posibles sustituciones de una sola base usando la Ec. 2, utilizando el modelo de nucleótidos K80 ( ). 55 El tiempo se adelantó en una cantidad elegida de una distribución exponencial basada en la suma de las tasas de sustitución, mientras que se aceptó una sustitución proporcional a las tasas relativas. Se permitió que las simulaciones alcanzaran un estado de equilibrio de selección-deriva mutacional, en el que la presión selectiva para una mayor estabilidad estaba en equilibrio con el número mucho mayor de mutaciones desestabilizadoras. Después de este punto, todos los resultados se obtuvieron con simulaciones en las que la aptitud de la proteína experimentó fluctuaciones aleatorias sin sesgo. Las simulaciones fueron completamente transparentes, lo que significa que el momento y la naturaleza de cada sustitución, las tasas de sustitución instantánea y las frecuencias de equilibrio instantáneo en cada ubicación eran accesibles.


Estimación de la constante de difusión de una proteína en función del número de aminoácidos - Biología

A pesar de los esfuerzos realizados durante el último medio siglo, todavía se necesitan métodos y datos armonizados internacionalmente. De hecho, como se describe en el Capítulo 1, el desarrollo de nuevos métodos para analizar componentes específicos de los macronutrientes que producen energía ha aumentado la complejidad y ha hecho que esta necesidad sea mayor que nunca.

Este capítulo discute los métodos analíticos comúnmente usados ​​para proteínas, grasas y carbohidratos, y hace recomendaciones con respecto a los métodos preferidos para el estado actual de la técnica y la tecnología disponible. También se indican los métodos que siguen siendo aceptables cuando no se pueden utilizar los métodos preferidos. Los métodos analíticos para el alcohol, que puede ser una fuente importante de energía en algunas dietas, los polioles y los ácidos orgánicos no se discutieron y, por lo tanto, no se hicieron recomendaciones sobre los métodos.

2.1 MÉTODOS ANALÍTICOS PARA LAS PROTEÍNAS EN LOS ALIMENTOS

Durante muchos años, el contenido de proteínas de los alimentos se ha determinado sobre la base del contenido de nitrógeno total, mientras que el método Kjeldahl (o similar) se ha aplicado casi universalmente para determinar el contenido de nitrógeno (AOAC, 2000). Luego, el contenido de nitrógeno se multiplica por un factor para llegar al contenido de proteínas. Este enfoque se basa en dos supuestos: que los carbohidratos y las grasas de la dieta no contienen nitrógeno, y que casi todo el nitrógeno de la dieta está presente como aminoácidos en las proteínas. Sobre la base de las primeras determinaciones, se encontró que el contenido medio de nitrógeno (N) de las proteínas era de aproximadamente el 16 por ciento, lo que llevó al uso del cálculo N x 6,25 (1 / 0,16 = 6,25) para convertir el contenido de nitrógeno en contenido de proteínas.

Este uso de un solo factor, 6.25, se ve confundido por dos consideraciones. En primer lugar, no todo el nitrógeno de los alimentos se encuentra en las proteínas: también está contenido en cantidades variables de otros compuestos, como aminoácidos libres, nucleótidos, creatina y colina, donde se lo conoce como nitrógeno no proteico (NPN). Solo una pequeña parte de NPN está disponible para la síntesis de aminoácidos (no esenciales). En segundo lugar, el contenido de nitrógeno de aminoácidos específicos (como porcentaje del peso) varía según el peso molecular del aminoácido y el número de átomos de nitrógeno que contiene (de uno a cuatro, según el aminoácido en cuestión). Con base en estos hechos, y las diferentes composiciones de aminoácidos de varias proteínas, el contenido de nitrógeno de las proteínas en realidad varía entre un 13 y un 19 por ciento. Esto equivaldría a factores de conversión de nitrógeno que oscilan entre 5,26 (1 / 0,19) y 7,69 (1 / 0,13).

En respuesta a estas consideraciones, Jones (1941) sugirió que se abandonara N x 6.25 y se reemplazara por N x, un factor específico para el alimento en cuestión. Estos factores específicos, ahora denominados & # 147 Jones factores & # 148, han sido ampliamente adoptados.Los factores de Jones para los alimentos que se consumen con mayor frecuencia oscilan entre 5,18 (nueces, semillas) y 6,38 (leche). Sin embargo, resulta que la mayoría de los alimentos con una alta proporción de nitrógeno como NPN contienen cantidades relativamente pequeñas de N total (Merrill y Watt, 1955 y 1973). [4] Como resultado, el rango de factores de Jones para las principales fuentes de proteína en la dieta es más estrecho. Los factores de Jones para las proteínas animales como la carne, la leche y los huevos se encuentran entre 6,25 y 6,38, los de las proteínas vegetales que aportan cantidades sustanciales de proteína en las dietas a base de cereales / legumbres se encuentran generalmente en el rango de 5,7 a 6,25. El uso del factor de gama alta (6,38) en relación con 6,25 aumenta el contenido aparente de proteína en un 2 por ciento. El uso de un factor específico de 5.7 (Sosulski e Imafidon, 1990) en lugar del factor general de 6.25 disminuye el contenido aparente de proteína en un 9 por ciento para alimentos específicos. En términos prácticos, el rango de diferencias entre el factor general de 6.25 y los factores de Jones es más estrecho de lo que parece a primera vista (alrededor del 1 por ciento), especialmente para las dietas mixtas. La tabla 2.1 da ejemplos de los factores de Jones para una selección de alimentos.

Debido a que las proteínas están formadas por cadenas de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos, pueden hidrolizarse a los aminoácidos que las componen, que luego pueden medirse mediante cromatografía de intercambio iónico, gas-líquido o líquida de alta resolución. La suma de los aminoácidos representa el contenido de proteínas (en peso) del alimento. Esto a veces se denomina & # 147proteína verdadera & # 148. La ventaja de este enfoque es que no requiere suposiciones ni conocimientos sobre el contenido de NPN del alimento o las proporciones relativas de aminoácidos específicos, eliminando así los dos problemas con el uso de N total x un factor de conversión. Su desventaja es que requiere un equipo más sofisticado que el método Kjeldahl y, por lo tanto, puede estar más allá de la capacidad de muchos laboratorios, especialmente aquellos que solo realizan análisis intermitentes. Además, la experiencia con el método es importante, algunos aminoácidos (por ejemplo, los aminoácidos que contienen azufre y el triptófano) son más difíciles de determinar que otros. A pesar de las complejidades del análisis de aminoácidos, en general ha habido un acuerdo razonablemente bueno entre laboratorios y métodos (King-Brink y Sebranek, 1993).

TABLA 2.1
Factores específicos (Jones) para la conversión del contenido de nitrógeno en contenido de proteínas (alimentos seleccionados)

Fuente: Adaptado y modificado de Merrill y Watt (1973).

  • alimentos utilizados como única fuente de nutrición, como la fórmula infantil
  • alimentos / fórmulas diseñadas específicamente para condiciones dietéticas especiales
  • nuevos alimentos.

2.2 MÉTODOS ANALÍTICOS PARA LAS GRASAS EN LOS ALIMENTOS

Quizás haya más acuerdo sobre los métodos estandarizados de análisis de grasas que de proteínas y carbohidratos. La mayor parte de la grasa de la dieta se encuentra en forma de triglicéridos (tres ácidos grasos esterificados en una estructura de molécula de glicerol). También hay componentes que no son glicéridos como esteroles, p. Ej. colesterol. Si bien existe un interés considerable en las funciones que estos componentes no glicéridos pueden desempeñar en el metabolismo, no son fuentes importantes de energía en la dieta (FAO, 1994).

Existen métodos gravimétricos de la AOAC aceptados para la grasa cruda, que incluye fosfolípidos y ésteres de cera, así como cantidades menores de material no graso (AOAC, 2000). La grasa total se puede expresar como equivalentes de triglicéridos determinados como la suma de ácidos grasos individuales y expresados ​​como triglicéridos (FAO, 1994). Este método es satisfactorio para la determinación de grasas en una amplia variedad de alimentos.

1) Con fines energéticos, se recomienda que las grasas se analicen como ácidos grasos y se expresen como equivalentes de triglicéridos, ya que este enfoque excluye las ceras y el contenido de fosfato de los fosfolípidos, ninguno de los cuales puede usarse para generar energía (James, Body y Smith, 1986 ).

2) Un método gravimétrico, aunque menos deseable, es aceptable para fines de evaluación energética (AOAC, 2000).

2.3 MÉTODOS ANALÍTICOS PARA LOS CARBOHIDRATOS EN LOS ALIMENTOS

La FAO / OMS celebró una consulta de expertos sobre carbohidratos en 1997. El informe de esta reunión (FAO, 1998) presenta una descripción detallada de los diversos tipos de carbohidratos y una revisión de los métodos utilizados para el análisis, que se resume conceptualmente en los siguientes párrafos. Otras recomendaciones de la consulta de 1997, p. Ej. la nomenclatura de los carbohidratos, fueron considerados por los participantes del actual taller técnico.

Durante muchos años, el contenido total de carbohidratos de los alimentos se ha calculado por diferencia, en lugar de analizarse directamente. Según este enfoque, los demás componentes del alimento (proteínas, grasas, agua, alcohol, cenizas) se determinan individualmente, se suman y se restan del peso total del alimento. Esto se conoce como carbohidratos totales por diferencia y se calcula mediante la siguiente fórmula:

100 - (peso en gramos [proteína + grasa + agua + ceniza + alcohol] en 100 g de comida)

Debe quedar claro que los carbohidratos estimados de esta manera incluyen fibra, así como algunos componentes que no son carbohidratos estrictamente hablando, p. Ej. ácidos orgánicos (Merrill y Watt, 1973). Los carbohidratos totales también se pueden calcular a partir de la suma de los pesos de los carbohidratos individuales y la fibra después de que cada uno se haya analizado directamente.

Los carbohidratos disponibles representan la fracción de carbohidratos que pueden ser digeridos por las enzimas humanas, se absorben y entran en el metabolismo intermedio. (No incluye fibra dietética, que puede ser una fuente de energía solo después de la fermentación; consulte las siguientes subsecciones). Se puede llegar a los carbohidratos disponibles de dos maneras diferentes: se pueden estimar por diferencia o analizar directamente. [6] Para calcular los carbohidratos disponibles por diferencia, la cantidad de fibra dietética se analiza y se resta del carbohidrato total, así:

100 - (peso en gramos [proteína + grasa + agua + ceniza + alcohol + fibra dietética] en 100 g de comida)

Esto produce el peso estimado de carbohidratos disponibles, pero no da ninguna indicación de la composición de los diversos sacáridos que comprenden carbohidratos disponibles. Alternativamente, los carbohidratos disponibles se pueden derivar sumando los pesos analizados de los carbohidratos disponibles individuales. En cualquier caso, los carbohidratos disponibles se pueden expresar como el peso del carbohidrato o como equivalentes de monosacáridos. Para obtener un resumen de todos estos métodos, consulte la Tabla 2.2.

La fibra dietética es un concepto fisiológico y nutricional relacionado con los componentes carbohidratos de los alimentos que no se digieren en el intestino delgado. La fibra dietética pasa sin digerir del intestino delgado al colon, donde puede ser fermentada por bacterias (la microflora), y el resultado final son cantidades variables de ácidos grasos de cadena corta y varios gases como dióxido de carbono, hidrógeno y metano. Los ácidos grasos de cadena corta son una importante fuente directa de energía para la mucosa colónica; también se absorben y entran en un metabolismo intermedio (Cummings, 1981).

TABLA 2.2
Carbohidrato total y disponible

Por diferencia: 100 - (peso en gramos [proteína + grasa + agua + ceniza + alcohol] en 100 g de comida)
Por análisis directo: peso en gramos (mono- + disacáridos + oligsacáridos + polisacáridos, incluida la fibra)

Por diferencia: 100 - (peso en gramos [proteína + grasa + agua + ceniza + alcohol + fibra] en 100 g de comida)
Por análisis directo: peso en gramos (mono- + disacáridos + oligosacáridos + polisacáridos, excluida la fibra) *

* Puede expresarse en peso (forma anhidra) o como equivalentes de monosacáridos (forma hidratada, incluida el agua).

Químicamente, la fibra dietética puede comprender: celulosa, hemicelulosa, lignina y pectinas de las paredes de las células, almidón resistente y varios otros compuestos (ver Figura 2.1). A medida que se ha aprendido más sobre la fibra, se han desarrollado una variedad de métodos de análisis. Muchos de estos miden diferentes componentes de la fibra y, por lo tanto, producen diferentes definiciones y valores de la misma. Tres métodos han tenido suficientes pruebas colaborativas para ser generalmente aceptados por organismos como AOAC International y el Bureau Communautaire de Reference (BCR) de la Comunidad Europea (CE) (FAO, 1998): el método enzimático gravimétrico AOAC (2000) - Prosky (985.29) el método químico enzimático de Englyst y Cummings (1988) y el método químico enzimático de Theander y Aman (1982). Monro y Burlingame (1996) han señalado, sin embargo, que se aplican al menos 15 métodos diferentes para determinar los valores de fibra dietética utilizados en las tablas de composición de alimentos. Su publicación, y el informe de la FAO / OMS sobre los carbohidratos en la nutrición humana (FAO, 1998), discuten estos temas con más detalle. El efecto de tener tal variedad de métodos para la fibra dietética, cada uno con un valor algo diferente, afecta no solo los valores en las tablas de composición de alimentos para la fibra dietética per se, sino también los de los carbohidratos disponibles por diferencia.

1) Los carbohidratos disponibles son un concepto útil en la evaluación energética y deben conservarse. Esta recomendación está en desacuerdo con la opinión de la consulta de expertos en 1997, que aprobó el uso del término & # 147 carbohidrato glucémico & # 148 para significar & # 147 que proporciona carbohidratos para el metabolismo & # 148 (FAO, 1998). El grupo actual expresó su preocupación de que el & # 147 carbohidrato glucémico & # 148 pueda confundirse o incluso equipararse con el concepto de & # 147 índice glucémico & # 148, que es un índice que describe la respuesta relativa de la glucosa en sangre a diferentes & # 147 carbohidratos disponibles & # 148. El término & # 147available & # 148 parece transmitir adecuadamente el concepto de & # 147proporcionar carbohidratos para el metabolismo & # 148, evitando al mismo tiempo esta confusión.

2) Los carbohidratos deben analizarse mediante un método que permita determinar tanto los carbohidratos disponibles como la fibra dietética. Para fines de evaluación energética, se prefiere el análisis directo y estandarizado de los carbohidratos disponibles mediante la suma de los carbohidratos individuales (Southgate, 1976 Hicks, 1988) a la evaluación de los carbohidratos disponibles por diferencia, es decir, carbohidratos totales por diferencia menos fibra dietética. Esto permite la separación de mono y disacáridos de los almidones, lo cual es útil para determinar el contenido de energía, como se discutió en el Capítulo 3.

3) La determinación de los carbohidratos disponibles por diferencia se considera aceptable a los efectos de la evaluación energética para la mayoría de los alimentos, pero no para los alimentos nuevos o para los que se debe hacer una declaración de contenido energético reducido. En estos casos, se debe realizar un análisis directo y estandarizado de los carbohidratos disponibles.

4) & # 147Fibra dietética & # 148 es un concepto útil que es familiar para los consumidores y debe mantenerse en el etiquetado de los alimentos y en las tablas de alimentos. Debido a que la característica física de solubilidad / insolubilidad no se correlaciona estrictamente con la fermentabilidad / no fermentabilidad, la distinción entre fibra soluble e insoluble no tiene valor en la evaluación energética, ni tiene valor para el consumidor.

5) El análisis AOAC (2000) - Prosky (985.29) o un método similar debe usarse para el análisis de fibra dietética.

6) Debido a que la fibra dietética se puede determinar mediante varios métodos que producen resultados diferentes, cuando no se utiliza el método Prosky, se debe indicar el método utilizado y el valor debe identificarse mediante etiquetas INFOODS [7] (Klensin et al., 1989 ). Además, el método debe identificarse con el nombre de etiqueta en las tablas de composición de alimentos.

7) Se necesitan más investigaciones y consenso científico para desarrollar métodos estandarizados de análisis del almidón resistente.

Figura 2.1 - Fibra dietética: constituyentes y fracciones de polisacáridos asociadas


2 RESULTADOS

Investigamos el comportamiento de mezclas polyR / polyU y polyK / polyU utilizando como modelos moleculares péptidos de lisina y arginina de cinco residuos largos (R5 y K5, respectivamente) junto con fragmentos de ARN de ácido poliuridílico de cinco residuos de largo (U5). Esta elección se justifica por varios factores: (a) la buena precisión de los campos de fuerza de última generación en la reproducción del conjunto estructural de oligonucleótidos pequeños, 22 (b) las posibles dificultades de muestreo asociadas a una dinámica conformacional más lenta de péptidos / oligonucleótidos largos 23 y, lo más importante, (c) la observación experimental de que el comportamiento diferencial de polyR / polyU y polyK / polyU no depende del tamaño molecular. dieciséis

Primero caracterizamos la afinidad relativa de R5 y K5 contigo5 en condiciones altamente diluidas mediante la realización de simulaciones de MD no sesgadas de una única cadena de péptidos junto con una cadena de oligonucleótidos. Las trayectorias MD (ver Métodos) revelaron múltiples eventos de unión / desvinculación, aunque los cuellos de botella cinéticos impiden una determinación precisa de la estabilidad termodinámica de los complejos péptido / nucleótido, especialmente en el caso de R5/ U5 sistema, en la escala de tiempo de microsegundos (Figura 1 (a), (b)). Para superar estas dificultades de muestreo, nos basamos en el método de intercambio de réplicas hamiltoniano REST2 (ver Métodos) que se ha demostrado que acelera en gran medida el muestreo conformacional de biomoléculas solvatadas. 24 Adoptando este enfoque, podríamos evaluar de manera confiable la estabilidad de los complejos péptido / oligonucleótido determinando el perfil de energía libre (FEP) en función de la superficie de interacción intermolecular para ambos R5/ U5 y K5/ U5 (Figura 1 (c)). Ambos perfiles muestran un mínimo de energía libre correspondiente a estados libres (superficie de interacción = 0) y una gran cuenca asociada a una variedad de complejos estructuralmente heterogéneos, como se esperaba para una interacción dinámica impulsada electrostáticamente entre dos biomoléculas flexibles. La comparación de los FEP indica que en condiciones altamente diluidas R5 se une a U5 más fuerte que K5 y forma complejos caracterizados por una mayor superficie de interacción, como ya se insinuó en las simulaciones insesgadas. Un análisis más cuantitativo de las simulaciones REST proporcionó una estimación aproximada de las constantes de disociación complejas, que difieren en más de un orden de magnitud (KD = 23 μM para R5/ U5y KD = 850 μM para K5/ U5, consulte Métodos).

Luego buscamos caracterizar las interacciones moleculares en condiciones que imitan los coacervados de proteína densa / ARN. Desafortunadamente, la composición molecular real de las fases condensadas polyK / polyU o polyR / polyU, en términos de relación ARN / proteína y contenido de agua, aún no se ha determinado experimentalmente. Las simulaciones de coexistencia de fases 25, 26 podrían, en principio, proporcionar acceso a esta información, pero sus aplicaciones a nivel atomístico requerirían un esfuerzo computacional prohibitivo incluso en el caso de pequeños péptidos / oligonucleótidos. Para sortear esta dificultad, decidimos centrarnos aquí en R5/ U5 y K5/ U5 mezclas con una relación molecular 1: 1 y caracterizar su comportamiento en un rango de concentraciones comparables a las determinadas para condensados ​​biomoleculares modelo in vitro. Por esta razón, simulamos mezclas de péptidos / oligonucleótidos con densidades biomoleculares de aproximadamente 125, 250 y 500 mg / ml, que corresponden a fracciones de empaquetado de diversos volúmenes (Figura 2 (a) - (c), Tabla S1). Incluso en estas condiciones muy concurridas, los péptidos y nucleótidos forman contactos intermoleculares dinámicos, sin formación de complejos irreversibles (Figura S1). Primero inspeccionamos la disposición general de las biomoléculas en los diversos sistemas determinando la función de distribución radial (RDF) de las distancias intermoleculares entre todos los átomos pesados ​​biomoleculares (Figura 2 (d) - (f)). La comparación de estos RDF intermoleculares con las distribuciones correspondientes a disposiciones aleatorias reveló atracciones notables entre las biomoléculas, independientemente de la concentración y la naturaleza de los péptidos. Estas interacciones favorables dan como resultado un aumento de la densidad local promedio en la escala nanométrica que es particularmente evidente en concentraciones más bajas y más pronunciada para R5/ U5 sistemas, lo que sugiere una unión intermolecular más fuerte. Con el fin de diseccionar las fuerzas impulsoras moleculares, luego analizamos el número promedio de contactos proteína-proteína, proteína-ARN y ARN-ARN por molécula (ver Métodos y Figura 2 (g) - (i)). En todos los sistemas, las interacciones heterotípicas entre péptidos y oligonucleótidos representan la mayor contribución a los contactos intermoleculares, como se esperaba debido a la atracción electrostática entre los restos con carga opuesta. En consecuencia, las interacciones homotípicas juegan un papel más limitado. En particular, los contactos proteína-proteína son extremadamente limitados en todas las mezclas, debido a las repulsiones electrostáticas entre los péptidos cargados positivamente. Este efecto es menos pronunciado en el caso de las interacciones ARN-ARN, que representan una fracción considerable de los contactos intermoleculares, posiblemente debido a la menor densidad de carga de U5 oligonucleótidos que son más grandes y tienen una carga neta más pequeña que R5/ K5 péptidos. Sin embargo, las interacciones electrostáticas no pueden explicar la mayor propensión a la interacción de polyR con respecto a polyK. Los contactos homotípicos de polyR-polyR son de hecho más frecuentes que los de polyK-polyK en todas las concentraciones, como se esperaba debido a la tendencia bien reconocida de las cadenas laterales de arginina a formar interacciones de apilamiento favorables. Aún más sorprendente, R5 Los péptidos muestran una propensión significativamente mayor a unirse a los oligonucleótidos U5 en todas las concentraciones, incluso si la diferencia entre el número de contactos heterotípicos se mitiga en sistemas más densos y concurridos (

50% de aumento relativo a 125 mg / ml con respecto a

25% a 500 mg / ml). A continuación, evaluamos la movilidad de las cadenas de péptidos y oligonucleótidos en los sistemas estudiados mediante la estimación de los coeficientes de difusión para las diversas especies a diferentes concentraciones (Figura 2 (j) - (l)). Los resultados indican que la difusión molecular depende en gran medida de la concentración, ya que los coeficientes de difusión disminuyen aproximadamente en dos órdenes de magnitud entre las mezclas a 125 mg / ml y las de 500 mg / ml. Más allá de esta tendencia general, el análisis sugiere que los oligonucleótidos son ligeramente menos móviles que los polipéptidos, de manera consistente con su mayor tamaño y peso molecular. Las interacciones intermoleculares más fuertes y las densidades locales más altas observadas en R5/ U5 Los sistemas ralentizan la difusión de todos sus componentes en un factor de

2 con respecto a K5/ U5 a una concentración equivalente.

Para obtener una visión más profunda de los determinantes microscópicos de las interacciones proteína-ARN y para dilucidar el comportamiento diferente entre los residuos de arginina y lisina, primero analizamos las contribuciones de los grupos de la cadena principal y la cadena lateral al número de contactos proteína-ARN (Figura 3 (a), (b)). Este análisis indicó que las interacciones heterotípicas mediadas por la columna vertebral son similares para R5 y K5 y que la diferente propensión a la interacción con los oligonucleótidos se origina principalmente a partir de contactos con las cadenas laterales estructuralmente diversas. Por lo tanto, nos enfocamos en este último y determinamos el RDF entre las cadenas laterales del péptido y los diversos grupos químicos en los oligonucleótidos, es decir, fosfato, ribosa y base (ver Métodos). En general, los RDF correspondientes a R5/ U5 y K5/ U5 Los sistemas exhiben diferencias significativas tanto en la posición como en la intensidad de los picos, sugiriendo inmediatamente distintos modos de unión para las cadenas laterales de arginina y lisina. En ambos sistemas, la interacción directa con el grupo fosfato se caracteriza por un pico principal a & lt0.5 nm (Figura 3 (c), (d) panel superior), que corresponde a la formación de enlaces de hidrógeno (enlaces H) entre oxígenos de fosfato y los grupos básicos de las cadenas laterales (Figura 3 (c), (d) inserciones y panel inferior). Sorprendentemente, el número medio de enlaces H simultáneos formados por la arginina es aproximadamente el doble que los formados por la lisina. La interpretación de las interacciones de la cadena lateral con la ribosa (Figura 3 (e), (f) panel superior) es menos sencilla. El pico ancho entre 0,4 y 0,7 nm observado tanto para polyK como para polyR indica una variedad de modos de unión caracterizados por distancias similares, que pueden atribuirse a la forma compleja del grupo de azúcar. Para ambas cadenas laterales, una fracción de estas interacciones implica la formación de enlaces H con el grupo hidroxilo del azúcar (Figura 3 (e), (f) recuadros y panel inferior). Por el contrario, las RDF sugieren que las interacciones de la arginina y la lisina con las bases de ARN difieren significativamente (Figura 3 (g), (h) panel superior): mientras que la lisina presenta un solo pico a una distancia de

0.6 nm, correspondiente a la unión de H con los oxígenos de carbonilo del anillo de la nucleobase, las cadenas laterales de arginina también exhiben un modo de unión alternativo a distancias más bajas, lo que representa una disposición de apilamiento de la nucleobase y el grupo guanidinio planar (Figura 3 (g), ( h) recuadros y panel inferior) que recuerda las interacciones de apilamiento entre la arginina y los aminoácidos aromáticos.

El análisis anterior destacó que tanto las cadenas laterales de arginina como de lisina pueden formar una variedad de enlaces H con los diversos grupos químicos de oligonucleótidos. Para racionalizar el comportamiento diferente de polyR y polyK, calculamos el número promedio de enlaces H formados simultáneamente por un solo aminoácido, limitando el promedio a los residuos que están en contacto directo con poliU para reducir su dependencia de la densidad del sistema. (Figura 4 (a)). Este análisis revela que cada arginina forma aproximadamente el doble de enlaces H que las cadenas laterales de lisina. Este resultado no depende de la concentración general del sistema y puede atribuirse a las diferencias estructurales entre las cadenas laterales de aminoácidos y a la disponibilidad de más átomos donantes de hidrógeno en las cadenas laterales de arginina. Además, los grupos guanidinio pueden contribuir a la red de contacto intermolecular también a través de interacciones de apilamiento con las bases de nucleótidos como sugiere RDF. El número medio de estas interacciones formadas por cada arginina es significativamente menor que el número de enlaces H, pero está lejos de ser insignificante (Figura 4 (b)). Por lo tanto, la cadena lateral de arginina planar y de dos puntas permite la formación simultánea de un conjunto más grande y más diversificado de interacciones proteína-ARN que la cadena lateral de lisina. Esta multivalencia se ejemplifica gráficamente por algunas conformaciones representativas extraídas de trayectorias MD donde los grupos de guanidinio coordinan múltiples bases a través de enlaces H e interacciones de apilamiento (Figura 4 (c), panel izquierdo) o puente. De hecho, se pueden identificar varios ejemplos de grupos de guanidinio que coordinan múltiples bases a través de enlaces de hidrógeno e interacciones pi-pi (Figura 4 (c), panel izquierdo), o que forman interacciones puente entre grupos fosfato y base (Figura 4 (c), centro y panel derecho).


Explica la evidencia bioquímica de la ascendencia común de los organismos de la Tierra.

todos los organismos usan el ADN como material genético

Las mismas cuatro bases (nucleótidas) forman el ADN en todos los organismos.

El número de mutaciones refleja las diferencias entre organismos.

todos los organismos usan el mismo código genético / diferencias menores

el código genético está degenerado /OWTTE

todos los organismos usan los mismos 20 aminoácidos

función de proteínas constante entre especies

ejemplos de proteínas / moléculas (por ejemplo, hemoglobina, citocromo, clorofila)

solo se han observado aminoácidos zurdos en organismos vivos

aunque habrá disponibles aminoácidos para diestros

solo glucosa / carbohidratos para diestros utilizados en organismos

similitudes en la glucólisis / vías metabólicas

todos usan ARN / mismas enzimas en la transcripción / traducción


Ensayo de fluorescencia en biología y medicina

Biología molecular: una serie internacional de monografías y libros de texto: ensayo de fluorescencia en biología y medicina, el volumen II cubre las muchas aplicaciones de la fluorescencia y la fosforescencia. Este libro analiza los principios de la polarización de la fluorescencia, la comparación de los métodos de análisis de luminiscencia y la medición directa de los tiempos de caída de la fluorescencia. También se delibera sobre la fotodescomposición, los compuestos de sulfhidrilo, la determinación de la estructura primaria y la tinción fluorescente. Este texto también cubre el análisis de purinas en hidrolizados de ácidos nucleicos, formiltetrahidrofolato sintetasa y hormonas ováricas. Este volumen es valioso para los químicos, físicos y biofísicos que deseen utilizar la fluorescencia para estudiar los mecanismos de reacción y dilucidar la estructura de biopolímeros complejos.

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Ver el vídeo: Proteínas: estructura, clasificación, función y desnaturalización (Octubre 2022).