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Antígenos sanguíneos y respuesta inmune

Antígenos sanguíneos y respuesta inmune


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En mi libro de texto, la definición de un antígeno se escribe de la siguiente manera:

Antígeno: Una sustancia que el cuerpo reconoce como extraña y que puede provocar una respuesta inmune.

La siguiente imagen también me confundió, ya que dice que, por ejemplo, una persona con sangre tipo A tiene antígenos A

Sin embargo, ¿esta afirmación y esta imagen no afirmarían que los antígenos que se encuentran en la superficie de nuestras células sanguíneas son extraños? ¿Lo que implicaría que nuestros anticuerpos atacan nuestra propia sangre que no es lo que ocurre?

¿O las sustancias que se encuentran en la superficie de las células sanguíneas (antígenos A y / y B, no antígenos) solo se reconocen como antígenos cuando se corresponden con los anticuerpos del cuerpo?

En otras palabras, si soy del grupo sanguíneo A, las moléculas rosadas en la superficie de mi sangre no se denominan antígenos porque no son extrañas, pero las moléculas verdes en la superficie de la sangre del grupo B se denominan antígenos porque son extranjeros?


El problema es en parte la definición de Antigen que cita. Se refiere a "el cuerpo" que te lleva a asumir que es un cuerpo específico, el tuyo. Estoy seguro de que hay mejores definiciones, pero simplemente tomando esta, la modificaría a: "Una sustancia que puede ser reconocidos como extraños y evocan una respuesta inmune en un organismo ".

Con esta definición, que es en realidad la forma en que se piensan los antígenos, no es necesario que un antígeno particular sea antigénico en todos los organismos a los que se presenta. Aquellos organismos o individuos para los que el antígeno aparece como 'propio' no lo reconocerán como extraño ya que son 'tolerantes' a él (por ejemplo, mediante mecanismos que eliminan las células capaces de producir anticuerpos contra el propio antígeno). Pero todavía se le conoce como antígeno.

Entonces, su comprensión de la situación es correcta, pero la del uso de la terminología no lo es. Incluso si pertenece al grupo sanguíneo A y, por lo tanto, no generará una respuesta inmune a las manchas rosadas en la imagen cuando se transfunde con sangre del grupo A, todavía se les conoce como antígenos, ya que estimulan una respuesta inmune cuando se transfunden a una persona de grupo sanguíneo B.

Si desea hablar sobre el hecho de que el antígeno A en la sangre de tipo A no provoca una respuesta inmune cuando se transfunde a personas con el grupo sanguíneo A, podría decir: “El antígeno A en los glóbulos rojos no es inmunogénico (ni siquiera antigénico) cuando transfundidos a personas del grupo sanguíneo A ”.

Nota a pie de página sobre terminología

La terminología científica nos permite describir las cosas con precisión. A medida que aumenta nuestra comprensión, es posible que la terminología deba evolucionar para permitirnos hacer distinciones de las que antes no estábamos conscientes. La palabra "antígeno" se acuñó a finales del siglo XIX, antes de que se supiera nada de la estructura de los anticuerpos, y se definió en términos de respuesta inmune, ya que eso era lo que se observaba. La definición evolucionó en algunos sectores para incluir la idea de unirse a un anticuerpo o célula T (ver, por ejemplo, la definición de Merriam-Webster).

Sin embargo, esta definición ampliada plantea el problema de la terminología que se debe utilizar si algo se une a un anticuerpo pero no provoca una respuesta inmunitaria. Así, el Glosario del libro de texto Inmunobiología (Janeway et al.) define el antígeno como "cualquier molécula que pueda unirse específicamente a un anticuerpo" y utiliza un término diferente, "inmunógeno", para "cualquier molécula que pueda provocar una respuesta inmune adaptativa al inyectarse en una persona o animal". (Lo que explica mi mención de 'inmunogénico', en oposición a 'antigénico', más arriba).


Respuestas inmunitarias celulares en la aloinmunización de glóbulos rojos

En la actualidad, se han descrito más de 340 antígenos de grupos sanguíneos que varían entre individuos. Por tanto, cualquier unidad de sangre que no sea autóloga representa una dosis significativa de aloantígeno. La mayoría de los antígenos de los grupos sanguíneos son proteínas, que difieren en un solo aminoácido entre donantes y receptores. Aproximadamente 1 de cada 70 personas se transfunden cada año (solo en los Estados Unidos), lo que conduce a respuestas de anticuerpos a los aloantígenos de glóbulos rojos (RBC) en algunos receptores de transfusiones. Cuando se forman aloanticuerpos, en muchos casos, los glóbulos rojos que expresan el antígeno en cuestión ya no se pueden transfundir de manera segura. Sin embargo, a pesar de la transfusión crónica, solo del 3% al 10% de los receptores (en general) presentan una respuesta de aloanticuerpos. En algunos estados patológicos, las tasas de aloinmunización son mucho más altas (p. Ej., Anemia de células falciformes). Para los pacientes que se vuelven aloinmunizados a múltiples antígenos, la terapia de transfusión continua se vuelve cada vez más difícil o, en algunos casos, imposible. Si bien los aloanticuerpos son el efector inmune final de la aloinmunización humoral, los fundamentos celulares del sistema inmune que conducen a la producción final de aloanticuerpos son complejos, incluido el consumo de antígenos, el procesamiento de antígenos, la presentación de antígenos, la biología de las células T y la biología de las células B. Además, estos procesos celulares difieren en cierta medida con respecto a los glóbulos rojos transfundidos en comparación con otras barreras inmunes mejor estudiadas (por ejemplo, enfermedades infecciosas, vacunas y trasplante de órganos sólidos). El trabajo actual se centra en ilustrar el paradigma actual de la inmunidad humoral, con un enfoque específico en los detalles de la aloinmunización de glóbulos rojos y los avances recientes en su comprensión.


Componentes del sistema inmunológico

El sistema inmunológico tiene muchos componentes:

Anticuerpos (inmunoglobulinas) son proteínas que son producidas por glóbulos blancos llamados células B y que se unen fuertemente al antígeno de un invasor, marcando al invasor para atacarlo o neutralizándolo directamente. El cuerpo produce miles de anticuerpos diferentes. Cada anticuerpo es específico para un antígeno determinado.

Antígenos son cualquier sustancia que el sistema inmunológico pueda reconocer y que, por tanto, pueda estimular una respuesta inmunitaria.

Células B (linfocitos B) son glóbulos blancos que producen anticuerpos específicos contra el antígeno que estimuló su producción.

Basófilos son glóbulos blancos que liberan histamina (una sustancia involucrada en reacciones alérgicas) y que producen sustancias para atraer a otros glóbulos blancos (neutrófilos y eosinófilos) a un lugar problemático.

Células son la unidad más pequeña de un organismo vivo, compuesta por un núcleo y un citoplasma rodeado por una membrana.

Quimiotaxis es el proceso por el cual una sustancia química atrae a las células a un sitio en particular.

los sistema complementario Consiste en un grupo de proteínas que participan en una serie de reacciones (llamadas cascada del complemento) diseñadas para defender el cuerpo, por ejemplo, matando bacterias y otras células extrañas, haciendo que las células extrañas sean más fáciles de identificar e ingerir por los macrófagos, y atraer macrófagos y neutrófilos a un punto problemático.

Citoquinas son numerosas proteínas diferentes que son secretadas por las células inmunes y otras y que actúan como mensajeros del sistema inmunológico para ayudar a regular una respuesta inmunitaria.

Células dendríticas se derivan de los glóbulos blancos. Residen en los tejidos y ayudan a las células T a reconocer antígenos extraños.

Eosinófilos son glóbulos blancos que matan bacterias y otras células extrañas demasiado grandes para ingerirlas, y pueden ayudar a inmovilizar y matar parásitos y ayudar a destruir las células cancerosas. Los eosinófilos también participan en reacciones alérgicas.

Células T auxiliares son glóbulos blancos que ayudan a las células B a producir anticuerpos contra antígenos extraños, ayudan a que las células T asesinas se activen y estimulan a los macrófagos, lo que les permite ingerir células infectadas o anormales de manera más eficiente.

Histocompatibilidad (literalmente, compatibilidad de tejido) está determinada por antígenos leucocitarios humanos (moléculas de autoidentificación). La histocompatibilidad se utiliza para determinar si el receptor aceptará un tejido u órgano trasplantado.

Antígenos leucocitarios humanos (HLA) son un grupo de moléculas de identificación ubicadas en la superficie de todas las células en una combinación que es casi única para cada persona, lo que permite que el cuerpo se distinga entre sí y no. Este grupo de moléculas de identificación también se denomina complejo principal de histocompatibilidad.

Un complejo inmunológico es un anticuerpo unido a un antígeno.

Un respuesta inmune es la reacción del sistema inmunológico a un antígeno.

Inmunoglobulina es otro nombre para el anticuerpo.

Interleucina es un tipo de mensajero (citocina) secretado por algunos glóbulos blancos para afectar a otros glóbulos blancos.

Células T asesinas (citotóxicas) son células T que se adhieren a las células infectadas y las células cancerosas y las destruyen.

Leucocito es otro nombre para un glóbulo blanco, como un monocito, un neutrófilo, un eosinófilo, un basófilo o un linfocito (una célula B o una célula T).

los sistema linfático es una red de ganglios linfáticos conectados por vasos linfáticos que ayuda al cuerpo a transportar microorganismos y células muertas o dañadas para filtrarlas y destruirlas. Las respuestas inmunitarias adquiridas se inician en los ganglios linfáticos.

Linfocitos son los glóbulos blancos responsables de la inmunidad adquirida (específica), incluida la producción de anticuerpos (por las células B), distinguirse entre sí y no (por las células T) y matar las células infectadas y las células cancerosas (por las células T asesinas).

Macrófagos son células grandes que se desarrollan a partir de glóbulos blancos llamados monocitos. Ingieren bacterias y otras células extrañas y ayudan a las células T a identificar microorganismos y otras sustancias extrañas. Los macrófagos normalmente están presentes en los pulmones, la piel, el hígado y otros tejidos.

Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) es sinónimo de antígenos leucocitarios humanos.

Mastocitos son células en los tejidos que liberan histamina y otras sustancias involucradas en reacciones inflamatorias y alérgicas.

A molécula es un grupo de átomos combinados químicamente para formar una sustancia única.

Células asesinas naturales son un tipo de glóbulo blanco que puede reconocer y destruir células anormales, como ciertas células infectadas y células cancerosas, sin tener que saber primero que las células son anormales.

Neutrófilos son glóbulos blancos que ingieren y matan bacterias y otras células extrañas.

Fagocitos son un tipo de célula que ingiere y mata o destruye los microorganismos invasores, otras células y fragmentos de células. Los fagocitos incluyen neutrófilos y macrófagos.

Fagocitosis es el proceso en el que una célula engulle e ingiere un microorganismo invasor, otra célula o un fragmento celular.

A receptor es una molécula en la superficie de una célula o dentro de la célula que puede identificar moléculas específicas, que encajan con precisión en ella, como encaja una llave en su cerradura.

Células T reguladoras (supresoras) son glóbulos blancos que ayudan a poner fin a una respuesta inmunitaria.

Células T (linfocitos T) son glóbulos blancos que participan en la inmunidad adquirida. Hay tres tipos: auxiliar, asesino (citotóxico) y regulador.

células blancas de la sangre (leucocitos) existen en varios tipos diferentes, como monocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y linfocitos (células B y células T), cada uno de los cuales tiene diferentes funciones en el sistema inmunológico.


Resultados

Información de muestreo para scRNA-seq

En total, se incluyeron 28 muestras en el estudio actual, incluidas 25 muestras de 16 pacientes con COVID-19 (los datos de las diferentes etapas de siete de los 16 pacientes se analizaron comparativamente para un estudio dinámico) y tres controles. La información básica y las características clínicas de los pacientes se enumeran en la Tabla complementaria S1. Hubo dos casos críticos (paciente 1, hombre, 34 años, paciente 2, hombre, 33 años), un caso grave (paciente 3, hombre, 43 años), seis casos moderados (pacientes 4-9, que comprendían dos hombres y cuatro mujeres de 25 a 62 años), y tres casos leves (paciente 10, mujer, 19 años, paciente 11, hombre, 30 años y paciente 12, mujer, 32 años). Los cuatro pacientes curados (paciente 13-16, que comprende dos hombres y dos mujeres de 20 a 40 años de edad) se inscribieron el día de su alta del hospital después de que dieron negativo para SARS-CoV-2 y después de que los signos de la enfermedad habían desaparecido. Se incluyeron tres personas sanas como controles normales (NC 1-3, dos hombres y una mujer, de 28 a 62 años).

Considerando la cinética de la respuesta inmune del cuerpo en la sangre involucrada en diferentes etapas de COVID-19, realizamos un estudio comparativo con siete de los 16 pacientes (pacientes 1, 2, 3, 6, 7, 9 y 10) que fueron analizados comparativamente durante su batalla con la enfermedad en diferentes etapas.

El transcriptoma unicelular de PBMC

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de cada individuo se aislaron de la sangre completa, y se realizó un análisis de scRNA-seq de las PBMC en la plataforma genómica 10X con los kits de reactivos V (D) J de una sola célula V (D) J de Chromium Next GEM v1. 1 (figura 1a). 18 Después del control de calidad, en el análisis de primera ronda, obtuvimos 241,292 células PBMC, 131,391 clones de TCR y 23,674 clones de BCR de las 19 muestras de 19 individuos, incluidos 16 pacientes con COVID-19 y tres controles. El análisis de componentes principales (PCA) y los gráficos de incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE) de la expresión génica de una sola célula sugirieron que no había efecto de lote entre las 19 muestras después de la normalización (Fig. 1b). En estas muestras, identificamos ocho tipos de células PBMC completamente diferentes, que podrían dividirse en 30 subtipos de células (grupos) en función de los resultados del agrupamiento con el paquete Seurat V3 R a una resolución de 0,9 (Fig. 1c, d). Los ocho tipos de células PBMC incluyen linfocitos T CD4 + identificados por CD4, Linfocitos T CD8 + identificados por CD8A, Monocitos CD16 + identificados por FCGR3A, Monocitos CD14 + identificados por CD14, células asesinas naturales (NK) identificadas por KLRF1, Células B identificadas por MS4A1, células dendríticas (DC) identificadas por FCER1A y células progenitoras de megacariocitos / plaquetas (MP / plaquetas) identificadas por PF4 (Figura 1c). El gráfico de expresión de t-SNE del gen marcador en parte de las muestras se muestra en la Fig. S1 complementaria. En la figura 1d se muestra información detallada para los 30 subtipos de células, incluidos siete subtipos de linfocitos T CD4 +, seis subtipos de linfocitos T CD8 +, cuatro subtipos de linfocitos B y otros subtipos de células. Los gráficos de puntos de los genes marcadores de linfocitos T clásicos y los marcadores de linfocitos B se presentaron en la Fig. Suplementaria S2a, b, respectivamente.

Composición celular de las PBMC en pacientes con COVID-19 y controles. a Breve resumen de las muestras para secuenciación de ARNc y diseño del estudio. La información detallada de las muestras se muestra en la Tabla S1. B Resultados del análisis de integración de pacientes con COVID-19 y controles normales que muestran el componente principal (PC) y la visualización del algoritmo TSNE. No se observó ningún efecto de playa entre las muestras. C Ocho tipos principales de células PBMC identificadas por marcadores celulares conocidos. D Resultados del análisis de integración de pacientes con COVID-19 y controles normales que muestran el componente principal (PC), el algoritmo TSNE y la visualización del algoritmo UMAP. En total, se identificaron 30 subtipos de células en PBMC. mi Composición de las proporciones de las principales composiciones de tipo celular de PBMC comparando cada uno de los pacientes con controles normales. Se calculó la proporción de cada tipo de célula en cada muestra y luego se comparó la proporción de cada tipo de célula entre casos y controles (para las muestras de control, se utilizó la proporción media de tres muestras de control para la comparación). F El mapa de calor de expresión génica de los 30 genes principales para cada subtipo celular. gramo Composición de las proporciones de las 30 composiciones de subtipos de células de PBMC comparando cada paciente con controles normales. Se calculó la proporción de cada subtipo celular en cada muestra y luego se comparó la proporción de cada subtipo celular entre casos y controles (para las muestras de control, se utilizó la proporción media de tres muestras de control para comparar)

Comparación de las proporciones de subtipos de células PBMC entre pacientes con COVID-19 y los controles

Para evaluar los estados del sistema inmunológico de la sangre de los pacientes con COVID-19, primero comparamos la proporción de los ocho tipos principales de células de cada uno de los pacientes con COVID-19 con los controles normales. Encontramos la expansión de CD mieloides, monocitos CD14 + y MP / plaquetas en la mayoría de los pacientes con COVID-19, y disminución de monocitos CD16 + y NK en más de la mitad de los pacientes con COVID-19 (fig. 1e). Para investigar más a fondo los cambios de los 30 subtipos de células en diferentes condiciones de COVID-19, comparamos las proporciones de subtipos de células en cada uno de los pacientes con COVID-19 con los tres controles normales (Fig. 1e). Un subtipo de linfocitos T CD4 + sin tratamiento previo (grupo 1), que están marcados por genes codificadores de ribosomas altamente expresados, como RPL32, RPL30, RPS12, y RPS3A, se redujo en todos los pacientes hospitalizados. Dado que los genes que codifican los ribosomas juegan un papel crítico en la transcripción y replicación del ARN viral (CL: 14985, en la base de datos STRING), la alta expresión de los genes que codifican los ribosomas en los linfocitos T CD4 + ingenuos podría estar asociada con la replicación del virus. 19 Al mismo tiempo, CD8 + T sin tratamiento previo (grupos 4, ARN no codificante altamente expresado LINC02446, factores de alargamiento EEF1A1 y EEF1B2), y NK (grupos 13, altamente expresados ​​en un gen de la superfamilia de cistatinas CST7, receptores tipo lectina de células asesinas KLRD1 y KLRG1) también disminuyeron en más de la mitad de los pacientes. Por otro lado, algunos subtipos de células, incluida la memoria efectora CD8 T (grupo 23, altamente expresado STMN1, HMGB2, TUBA1B, HIST1H4C), Monocitos CD14 + (grupos 10, altamente expresados FCN1, LYZ, S100A8, grupo 12, altamente expresado S100A12, S100A6, y TYROBP, y el grupo 16, altamente expresado ACAMPAR, LCN2, CCL3, y CCL3L1), células B vírgenes (grupo 19, que expresan altamente CD74, CD79A, y HLA-DRA), DC mieloides (grupo 21, altamente expresado HLA-DRB5, HLA-DPB1, y HLA-DQA1) y MP / plaquetas (grupo 11, altamente expresado CAVIN2, HIST1H2AC, y TUBB1, y el grupo 28, altamente expresado HIST1H4H, HIST1H3H, H3F3A, y NT5C3A) se observó un aumento en más de la mitad de los pacientes. El mapa de calor de expresión génica de los 30 genes principales de cada grupo se muestra en la Fig. 1f.

La proporción de 15 de los 30 subtipos de células, como las células T CD4 + y las células T CD8 +, disminuyó drásticamente en ambos pacientes críticos (paciente 1 y paciente 2). Esto concuerda con el número mucho menor de linfocitos en estos dos pacientes (0,75 × 109 / L para el paciente 1 y 0,27 × 109 / L para el paciente 2) en comparación con el rango normal (1,1-3,2 × 109 / L, Tabla S1). En el estado grave (paciente 3), aumentaron las proporciones de algunos subtipos de células, como las células T CD8 T efectoras terminales y las células T CD8 de memoria efectoras. Para los pacientes moderados (pacientes 4-9), también presentaron un grado medio de cambios en las proporciones celulares (fig. 1e, g), excepto para el paciente 9. En el paciente 9, que tenía síntomas moderados, sus proporciones celulares de B naive las células (grupos 19) y los subtipos de células T CD4 + y CD8 + (grupos 4, 14, 17, 18 y 23) se expandieron en gran medida (Fig. 1e, g). Para los pacientes leves (pacientes 10-12), también presentaron un grado medio de cambios en las proporciones celulares (fig. 1e, g), excepto para el paciente 11. En el paciente 11, la proporción de células de un subtipo de células B vírgenes ( grupos 19) es el más alto entre todos los pacientes, 12,52 veces más en comparación con los controles (Fig. 1e, g). En la condición curada, la proporción de MP / plaquetas (grupos 11 y 28) disminuyó significativamente. Estos resultados sugieren que las respuestas inmunitarias de la sangre humana están altamente reguladas individualmente de acuerdo con las condiciones de la enfermedad durante la infección por SARS-CoV-2, y el desequilibrio de las células inmunitarias está asociado con COVID-19.

Para brindar información detallada sobre los cambios en la proporción de células en las diferentes condiciones de enfermedad, analizamos más los subtipos de células en los cinco grupos con cambios dramáticos en la proporción de células en las condiciones de enfermedad estudiadas: grupo 1 (CD4 + T sin tratamiento previo), grupo 10 (monocitos CD14 +), grupo 13 (NK), grupo 19 (ingenuo B) y grupo 24 (efector terminal CD8 T) (Fig. 2a, b). Los resultados muestran que el agotamiento de las células efectoras CD8 + terminales está asociado con una condición crítica de la enfermedad (flecha roja en la Fig. 2a, b). En comparación con las otras condiciones, el grupo leve presenta una proporción de células B vírgenes mucho más alta (flecha verde en la Fig. 2a, b). Estos resultados sugieren que la depleción de células T efectoras CD8 + terminales podría estar asociada con pacientes en condición crítica, y una gran parte de la expansión de células B vírgenes para la producción de anticuerpos puede prevenir el empeoramiento de COVID-19.

Proyección UMAP de cinco grupos de células y cambios en la expresión génica de las vías de IFN-I y MAPK en respuesta a la infección por SARS-CoV-2. a Proyección UMAP de cinco grupos de células entre críticos (norte = 2), grave (norte = 1), moderado (norte = 6), leve (norte = 3), curado (norte = 4) y controles (norte = 3). CD4 + T ingenuo: grupo 1 en la Fig. 1d Monocitos CD14 +: grupo 10 en la Fig. 1d NK: grupo 13 en la Fig. 1d Células B: grupo 19 en la Fig. 1d CD8 + efector terminal T: grupo 24 en la Fig. 1d. La flecha roja en a indica el efector CD8 + T (CTL), la flecha verde en a indicó las células B. Se modifican significativamente en comparación con los pacientes y controles COVID-19. La sección relacionada se explica en la parte inferior de la página 7 del texto principal. B Significación estadística (cada una de las otras condiciones frente a controles) para la población celular mencionada en a. *pag & lt 0.05 **pag & lt 0.01 ***pag & lt 0,001. CF Cambios log2 veces mayores de los recuentos de identificadores moleculares únicos (UMI) de los genes de la vía del IFN-I comparando pacientes con controles normales. C Los pacientes críticos (paciente 1 y paciente 2) vs. controles normales. D El paciente severo (paciente 3) vs. controles normales. mi Los pacientes moderados (pacientes 4-9) versus controles normales, y F Los pacientes curados (pacientes 11 y 10) vs. controles normales. gramoj Log2 veces los cambios de los recuentos de UMI de los objetivos MAPK en críticos (gramo), grave (h), moderado (I) y pacientes curados con COVID-19 frente a controles normales (j), respectivamente. Cada punto representa un subtipo de celda diferente

Vías expresadas diferencialmente entre pacientes con COVID-19 y controles

Luego, analizamos los perfiles de expresión génica en cada subtipo celular de pacientes con diferentes condiciones de COVID-19 y comparamos estos perfiles con los controles. Identificamos muchos genes expresados ​​diferencialmente (DE, FDR & lt 0.05) entre pacientes con COVID-19 y controles normales en cada grupo celular. Para explorar más a fondo las vías de señales enriquecidas de los genes DE en cada subtipo celular, realizamos un análisis de red STRING local, 20,21,22 utilizando genes DE y su log2 cambió los pliegues entre los pacientes y los controles. En pacientes con condiciones críticas, graves, moderadas, leves y curadas, encontramos que 16 (en 9 subtipos de células), 22 (en 26 subtipos de células), 22 (en 20 subtipos de células), 28 (en 16 subtipos de células), y 19 (en 9 subtipos de células) las vías de señal se cambiaron significativamente para cada condición de enfermedad, respectivamente (FDR & lt 0.05) (Figs. Suplementarias S3-S7, Tabla 2-6).

Mediante el análisis de la red STRING, encontramos que, además de las vías de señalización metabólicas básicas, como la fosforilación respiratoria y oxidativa, las vías de señal significativamente enriquecidas estaban implicadas principalmente en la sobreactivación de cinco vías (fig. 2c-j, figs. Suplementarias S3-S7): (1) replicación e infección del genoma viral (traducción del ARNm viral, elongación de la cadena peptídica y proteína cotraduccional dependiente de SRP dirigida a la membrana, que se expresó en gran medida en monocitos CD14 +, células T CD4 + vírgenes y otras células) (2) tipo I señalización de interferón (IFN-I) (altamente expresado en células B vírgenes y monocitos CD14 +) (3) proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) (que también incluye el factor de transcripción AP-1, Jun y bZIP Maf) (altamente expresado en Células B, células T CD8 + y NK) (4) interacciones inmunológicas entre células linfoides y no linfoides (altamente expresadas en células T efectoras CD8 + terminales y células B vírgenes) y (5) complejo proteico de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (altamente ex presionado en células B). La mayoría de los genes implicados en estas vías se regularon positivamente en los pacientes hospitalizados con COVID-19 en comparación con los controles normales (fig. 2c-j, fig. Complementaria S8-S9). Sin embargo, la expresión de los genes de la vía MAPK se reguló negativamente en los pacientes curados, lo que sugiere que la expresión disminuida de los genes de la vía MAPK es una buena señal para la recuperación del paciente (Fig. 2j).

Para estudiar las alteraciones de señalización asociadas con la gravedad de la enfermedad, que podrían conducir a nuevas estrategias de intervención, hemos comparado además la condición crítica / grave con la condición moderada (Fig. S10 complementaria) y la condición leve (Fig. S11 complementaria). Eventos de señalización respiratoria y G alfa (i) enriquecidos en la condición crítica / severa en comparación con los moderados en PM / Plaquetas (grupo 8). Se alteraron muchas vías de señalización para la comparación de condiciones críticas / severas con la condición leve, y la mayoría de las vías de señalización enriquecidas están incluidas o relacionadas con las cinco vías mencionadas anteriormente además de las vías de señalización metabólicas básicas (Fig. Complementaria S11).

Comparación pareada de pacientes con COVID-19 antes y después de la mejoría de la enfermedad

Para explorar más a fondo la respuesta inmune al SARS-CoV-2 antes y después de que los pacientes se recuperaran de la enfermedad, recolectamos una segunda ronda de nueve muestras adicionales de siete pacientes que se recuperaron con éxito y que produjeron 100,128 células PBMC, 54,039 clones de TCR y 5128 BCR. clones (Tabla complementaria S1). Para los dos pacientes críticos, paciente 1 y paciente 2, recolectamos muestras de sangre y volvimos a realizar scRNA-seq cuando su enfermedad mejoró (22 días después de la primera ronda de muestreo para ambos pacientes) y después de que se curaron (25 y 23 días después el muestreo mejorado para el paciente 1 y el paciente 2, respectivamente). En los otros cinco pacientes (un paciente grave, paciente 3, tres pacientes moderados, pacientes 6, 7 y 9 y un paciente leve, paciente 10), recolectamos muestras de sangre y volvimos a realizar análisis de scRNA-seq justo después de que los pacientes se recuperaran de la enfermedad. Por lo tanto, podríamos comparar los cambios de la secuencia de ARNc inmunes en sangre en la enfermedad y después de que los pacientes se hubieran recuperado. En combinación con estas muestras y los datos de la primera ronda de estos pacientes, los subtipos de células identificados en base a los resultados de la agrupación con el paquete Seurat V3 R a una resolución de 0,9 se muestran en la Fig. 3a.

El estudio dinámico para el paciente crítico 1 antes y después de la mejoría. a Gráficos de TSNE de tipos celulares identificados en pacientes con estudio dinámico (P1-1, P1-2, P1-3, P2-1, P2-2, m P2-3, P3-1, P3-2, P6-1, P6 -2, P7-1, P7-2, P9-1, P9-2, P10-1 y P10-2). B Gráficos de TSNE de P1-1 (en condición crítica) y P1-2 (en condición de mejora), que muestran la distribución del tipo de célula en las dos muestras. C Gráficos de TSNE de P1-2 y P1-3 (en condiciones de curado), que muestran la distribución del tipo de célula en las dos muestras. D Comparaciones de todos los subtipos de células de P1-1, P1-2 y P1-3. mi Cambios log2 veces mayores de los recuentos de UMI de los genes implicados en la traducción del ARNm viral, objetivos de IFN-I, MAPK y ferroptosis entre P1-1 y P1-2. Cada punto representa un subtipo de celda diferente. F Cambios log2 veces mayores de los recuentos de UMI de los genes implicados en la traducción del ARNm viral, objetivos de IFN-I, MAPK y ferroptosis entre P1-2 y P1-3. Cada punto representa un subtipo de celda diferente

Observamos que la reducción o expansión de tipos y subtipos de células mejoró significativamente después de recuperarse de la enfermedad. Las vías que incluyen la traducción del ARNm viral, IFN-I, MAPK, interacciones inmunológicas y el complejo proteico MHC de clase II se enriquecieron significativamente en la mayoría de las comparaciones pareadas de los estados de mejora antes y después de los siete pacientes, lo que sugiere además que estas cinco vías están involucradas. en la patogenia de COVID-19 (Figs. suplementarias S12-S19). Los perfiles de expresión génica de la mayoría de estas vías también son consistentes con nuestros resultados anteriores al comparar a los pacientes con los controles. Es decir, la mayoría de estos genes están regulados positivamente en condiciones de enfermedad de COVID-19.

En el paciente crítico 1, al comparar las condiciones de su enfermedad en la etapa crítica con la mejorada (P1-1 vs P1-2), observamos que se recuperó su efector T CD8 + terminal (grupos 10) y NK (grupos 6), etc. en la etapa mejorada (Fig. 3b, cyd). Para brindar información más detallada sobre la ruta relacionada con su proceso de recuperación, hicimos tanto un análisis de red STRING local como un análisis KEGG (utilizando la lista de genes DE). Para el análisis de la red STRING, encontramos que los cambios de las vías y los patrones de expresión génica entre la etapa crítica y la etapa mejorada eran similares a nuestros hallazgos de la comparación de primera ronda entre pacientes críticos y controles (Fig. 3d, Fig. Complementaria S12). Las rutas que incluyen la traducción de ARNm viral, IFN-I y MAPK se regularon significativamente al alza en la etapa crítica en comparación con la etapa mejorada (Fig. 3e). El análisis de KEGG reveló que una forma de muerte celular regulada, la ferroptosis, se incrementó significativamente en la etapa crítica de la enfermedad en comparación con la etapa mejorada (Fig. 3e, Fig. S13 complementaria). Y luego, al comparar aún más las condiciones de la enfermedad de este paciente entre las etapas mejorada y curada (P1-2 vs P1-3, encontramos que las proporciones de células Th1 (grupo 19) se recuperaron en la etapa curada (Fig.3c, d) . Las vías que incluyen la traducción del ARNm viral, IFN-I y MAPK también se regularon positivamente en la etapa mejorada en comparación con la etapa curada (Fig. 3f, Figs. Suplementarias S14-S15). Los perfiles de expresión génica involucrados en la ferroptosis no cambiaron significativamente entre las etapas mejorada y curada, lo que indica que la ferroptosis ocurrió principalmente en la etapa crítica y volvió gradualmente a la normalidad en la etapa mejorada (Fig. 3f). Se encontraron cambios similares de tipos y subtipos celulares, vías y patrones de expresión génica en otra etapa crítica. paciente — paciente 2 — al comparar las etapas crítica, mejorada y curada (Figs. suplementarias S16-S20).

El paciente 3 con síntomas graves mostró expansión de linfocitos en comparación con los controles normales en el análisis de primera ronda, su expansión de linfocitos se redujo en la etapa curada (Fig. 4a, b). Las rutas que incluyen la traducción de ARNm viral, IFN-I y MAPK se regularon significativamente al alza en la etapa grave en comparación con la etapa curada (Fig. 4c). Sin embargo, la vía de la señal de la ferroptosis se incrementó ligeramente en la etapa grave de la enfermedad (Figuras complementarias S21-S22), probablemente debido a la expansión de sus células linfocitarias. Para los tres pacientes moderados con COVID-19 (pacientes 6, 7 y 9), las vías de IFN-I y MAPK se regularon significativamente al alza en el estadio de la enfermedad en comparación con el estadio curado (Fig. 4d-f, Figs. Complementario S23– S30). Las vías de traducción del ARNm viral y ferroptosis se regularon significativamente en la etapa de la enfermedad en comparación con la etapa curada para los pacientes 6 y 7. Sin embargo, la traducción del ARNm del virus individual y la ferroptosis no se regularon significativamente en la etapa de la enfermedad en comparación con la etapa curada para pacientes 9, lo que podría explicarse por su expansión relativamente mayor de células T y B 23 (Figs. suplementarias S27-S29). El paciente de condición leve, el paciente 10, mostró un grado leve de respuesta inmune.

El estudio dinámico del paciente severo 3 y el paciente moderado 6 en su enfermedad y condiciones curadas. a Gráficos de TSNE de tipos celulares identificados en pacientes con estudio dinámico de P3-1 (condición grave) y P3-2 (condición curada). B Comparaciones de todos los subtipos de células de P3-1 y P3-2. C Cambios log2 veces mayores de los recuentos de UMI de los genes implicados en la traducción del ARNm viral, objetivos de IFN-I y MAPK entre P3-1 y P3-2. Cada punto representa un subtipo de celda diferente. Sólo se representaron los genes DE (FDR & lt 0,05) para el grupo de comparación. The cell subtype is shown in Fig. 3a. D TSNE plots of cell types identified in patients with dynamic study of P6-1 and P6-2 showing the cell type distribution in the two states. mi Comparisons of all the cell subtypes of P6-1 and P6-2. F Log2 fold changes of the UMI counts of the genes involved in viral mRNA translation, IFN-I, MAPK targets, and ferroptosis between P6-1 and P6-2. Each point represents a different cell subtype. Only DE genes (FDR < 0.05) were plotted for the comparison group. The cell subtype is shown in Fig. 3a

TCR and BCR expansion in patients with COVID-19

To explore the clonal proliferation of TCR and BCR in COVID-19, we conducted TCR and BCR V(D)J 16,18,24 single-cell transcriptome analysis. Using an integration analysis, we detected 185,430 clonotypic T cells and 28,802 clonotypic B cells in the 28 samples obtained from 19 participants. The repertoire in patients with COVID-19 and controls showed large diversities of the clonotypic T cells and B cells in each individual. The distributions of clonotypic T cells for each patient are shown in Fig. 5a (Supplementary Table S7). By comparing the clonotypic T cells of the seven patients before and after the improvement of disease, we found that the relative quantity of clonotypic T cells of patients decreased from the disease to the cured conditions (Fig. 5b). However, lower clonotypic cells were detected in critical conditions (patient 1–1 and patient 2–1), which might be due to lymphocyte exhaustion during this disease stage. The highest relative quantity of clonotypic T cells was detected in the moderate patient 9 (Fig. 5a, b), which might be due to the expansion of her lymphocytes.

T lymphocytes and B lymphocytes V(D)J clone expansion and TSNE plots of integrated analysis of 5′mRNA, T cell receptor (TCR), and B cell receptors (BCR) of patients with COVID-19. a The number of T cell clones detected by V(D)J in each patient. B The number of T cell clones detected by disease condition and the recovery condition of patients 1, 2, 3, 6, 7, 9, and 10. C The number of B cell clones detected by V(D)J in each patient. D The number of B cell clones detected at disease and recovery conditions of patients 1, 2, 3, 6, 7, 9, and 10. mi Clonally related IgH sequences in each patient. F Number of mutations in IgH gene variable regions in different COVID-19 patients. The statistical significance refers to the statistics of different courses of the same patient who had dynamic analysis data. *PAG & lt 0.05, **PAG & lt 0.01, ***PAG & lt 0,001 t-prueba. gramo Clonotypic T cells of hospitalized patients. h Clonotypic T cells of cured patients. I Clonotypic B cells of hospitalized patients. j Clonotypic B cells of cured patients. Patients in hospitalized condition: P1-1, P1-2, P2-1, P2-2, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1, and P10-1. Patients in cured condition: P1-3, P2-3, P3-2, P6-2, P7-2, P9-2, and P10-2. The detailed cell types of these patients are shown in Fig. 3a. k TSNE plot of a clonotypic T cell (terminal effector CD8 T cells): CVVNYYKAAGNKLTF_CASSLGSAPRELFF (TRAV12-1*01, TRAJ17*01, and TRAC*010 in P2-1, P2-2, and P2-3)

Compared to the clonotypic T cells, the total number of clonotypic B cells detected was much lower (Fig. 5c, d, Supplementary Table S8). The relative quantity of total clonotypic B cells of patients increased with the disease condition improvement (Fig. 5d). The V(D)J segments of the immunoglobulin (Ig) genes are rearranged in an ordered fashion to generate the primary Ig repertoire during the development of B cells before the encounter with antigen during the immune response, activated B cells are clonally expanded within the germinal center and the variable region of Ig genes can be further mutated to produce high-affinity antibodies. 25 Detailed analyses showed that almost all these COVID-19 patients had developed clonally related IgH genes (Fig. 5e). The variable regions of IgH genes from all the patients are highly mutated, with an average of 9.39 nucleotides in each gene (Fig. 5f).

We further performed an integrated analysis of 5′ gene expression libraries, T cell receptor (TCR), and B cell receptor (BCR) data by mapping the clonotypic T cells and clonotypic B cells in the TSNE plot of the 5′ gene expression libraries scRNA data (Fig. 3a) to compare the TCR and BCR expansion of the same patients in hospitalized condition (P1-1, P1-2, P2-1, P2-2, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1, and P10-1) and cured condition (P1-3, P2-3, P3-2, P6-2, P7-2, P9-2, and P10-2). We found that the clonotypic T cells in hospitalized conditions are mainly terminal CD8 + effector T cells (Fig. 5g) in cured condition, high-frequency clonotypic T cells in Th1/Th17/Tregs were detected besides terminal CD8+ effector T cells (Fig. 5h, red arrow). For the clonotypic B cells, no excessively high-frequency expansion is found in the hospitalized condition of these patients (Fig. 5i). However, in the cured condition of these patients, high-frequency clonotypic B cells can be detected in the naive B cells (Fig. 5j, red arrow). These results present the cell expansion dynamic landscape of T and B lymphocytes.

The patients with COVID-19 showed different degrees of specific memory T cell expansion or preservation with the disease improvement. Using the scRNA-seq data, we could identify antigen-receptor sequences in the memory clonotypic T cells during different disease conditions. The clonotypic effector memory CD8 T cells with the following TCR variable sequences significantly increased in critical patient 2 at the different stages of the disease. (1) CVVNYYKAAGNKLTF_CASSLGSAPRELFF (TRAV12-1*01, TRAJ17*01 and TRAC*01) had 11 clones in P2-1 (critical), 88 clones in P2-2 (improved) (FDR = 5.99 × 10 −4 , P2-1 vs. P2-2, adjusted binomial probabilities, the same below), and 222 clones in P2-3 (cured) (FDR = 9.48 × 10 −39 , P2-2 vs. P2-3) (Fig. 5k). These clones changed from terminal effector CD8 T cells to effector memory CD8 T cells from disease condition to cured condition (Fig. 5k). (2) CAMKTSYDKVIF_CASTPGDTIYF (TRAV12-3*01, TRAJ50*01, TRAC*01) had 6 clones in P2-1, 23 clones in P2-2 (FDR = 3.92 × 10 −5 , P2-1 vs. P2-2), and 50 clones in P2-3 (FDR = 8.32 × 10 −6 , P2-2 vs. P2-3). (3) CAFRKDTGRRALTF_CASSPQGGGGYTF (TRAV24*01, TRAJ5*01, TRAC*01) had 4 clones in P2-1, 12 clones in P2-2 (FDR = 9.75 × 10 −4 , P2-1 vs. P2-2), and 24 clones in P2-3 (FDR = 0.01, P2-2 vs. P2-3). These clonotypic cells expansions and preservations may be related to the memory of SARS-CoV-2 antigens in patients.

By analyzing Ig coding genes that changed during the course of the disease, we found that the highest changed genes belonged to the IGHV3 family (IGHV3-21, IGHV3-22, IGHV3-30, IGHV3-48, IGHV3-49, IGHV3-72, etc.). Other families, such as IGKV1, IGKV3, IGLV2, IGLV3, IGLV1, y IGHV4, were also highly changed in different disease conditions (Fig. S31a). The values of IgG and IgM of these samples were shown in Supplementary Fig. S31b. In the recently cured condition, patients had more Ig genes than normal controls (Supplementary Fig. S32). Together, the adaptive immunity involved in B cell antibody production may play a crucial role in the fight against SARS-COV-2.

Experimental detection of IFN-I and MAPK signals

From the scRNA-seq analysis, we found that a set of genes involved in the IFN-I, MAPK pathways were stably upregulated in patients with COVID-19. To further validate this finding, we performed quantitative real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (real-time RT-PCR) testing to detect the expressions of related genes in another cohort of 38 patients with COVID-19, including three critical, three severe, 19 moderate, three mild, and 10 cured patients with COVID-19 and 35 normal controls (Fig. 6a). IFI27, a reported biomarker of influenza distinct from bacterial infection, 26 was the strongest upregulated gene in patients with COVID-19 in the scRNA-seq data. It was upregulated 8.1 times in critical patients, 51.7 times in severe patients, 39.9 times in moderate patients, 38.6 times in mild patients, and 29.5 times in cured patients compared with the normal controls (Fig. 6a). We performed PBMC immunofluorescence testing to compare the protein expressions of IFI27 between patients with COVID-19 and the controls. Immunofluorescence staining showed that IFI27 was highly expressed in the lymphocytes of patients with COVID-19 but only partially expressed in the lymphocytes of the controls (Fig. 6b, c). Another gene in the IFN-I pathway, BST2, also showed upregulation in patients with COVID-19 compared with controls (Fig. 6a). These results suggest that IFI27 y BST2 are candidate marker genes for SARS-CoV-2 infection. Consistent with our scRNA-seq data, the expression profile of FOS, which is a transcription factor mediating the MAPK pathway, showed significant upregulation in patients with COVID-19 but obvious downregulation in recovered patients by real-time RT-PCR analysis (Fig. 6a). Esto sugiere que FOS is a candidate marker for COVID-19 patient recovery.

Experimental validation of IFN-I signaling. a Real-time PCR validation of IFI27 y BST2 in the interferon pathway and FOS in the MAPK pathway. IFI27 y BST2 are upregulated in patients with COVID-19. FOS is upregulated in hospitalized patients but downregulated in cured patients (norte = 3 for critical, norte = 3 for severe, norte = 19 for moderate, norte = 3 for mild, and norte = 10 for cured patients with COVID-19 and 35 normal controls). *PAG & lt 0.05, **PAG & lt 0.01, ***PAG < 0.001 Student’s t-prueba. B Statistical significance of IFI27 immunofluorescence signal comparing COVID-19 and normal controls. *p < 0.05 **p < 0.01 ***pag & lt 0,001. C Immunofluorescence staining of IFI27 in PBMCs of patients with COVID-19 and normal controls. D IFN-α concentration in serum of 257 patients with COVID-19 and 106 matched tested by ELISA, including of the severe and critical group (12.02 ug/mL ± 2.80, norte = 68), the moderate group (23.99 g/mL ± 4.840, norte = 133 patients), the mild group (20.29 ug/mL ± 7.732, norte = 34 patients), and the cured group (9.637 ug/mL ± 1.184, norte = 22 patients). *PAG & lt 0.05, **PAG & lt 0.01, ***PAG < 0.001 one-way ANOVA

We further measured total IFN-α concentration in the serum of 257 patients with COVID-19 and 106 matched controls by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The patients were placed into four groups: the critical and severe group, the moderate group, the mild group, and the cured group. We found that the total IFN-α level was significantly increased in patients than in controls (pag < 0.001, 17.79 ug/mL ± 2.55 vs. 6.42 ug/mL ± 0.703). IFN-α was increased dramatically in the moderate group (pag < 0.001, 23.99 ug/mL ± 4.840, norte = 133 patients) and mild (pag < 0.001, 20.29 ug/mL ± 7.732, norte = 34 patients) patients (Fig. 6d). The IFN-α concentration in the serum of the critical and severe group is 12.02 ug/mL ± 2.80 (norte = 68) and the cured group is 9.637 ug/mL ±1.184 (norte = 22, pag < 0.05,) (Fig. 6d). This result suggests that patients in moderate condition produced the highest level of IFN-α.


Link between blood clotting, immune response uncovered

Rice University researchers have found an unexpected link between a protein that triggers the formation of blood clots and other proteins that are essential for the body's immune system. The find could lead to new treatments for thousands of patients who suffer from inflammatory diseases and disorders that cause abnormal blood clotting.

The research is available online in the journal MÁS UNO.

"This link opens the door for studying severe, debilitating inflammatory disorders where the disease mechanism is still poorly understood, including lupus, rheumatoid arthritis, regional ileitis and ulcerative colitis, as well as age-related macular degeneration," said study co-author Dr. Joel Moake, a hematologist and senior research scientist in bioengineering at Rice. "There's clinical evidence that clotting and inflammation are somehow linked in many patients, even in the absence of an infection. This linkage could help explain some of the clinical cases that have long baffled physicians."

The link is biochemical. Nancy Turner, a research technician in Moake's lab, established the link after conducting hundreds of experiments on more than a dozen proteins, including key molecules involved with both clotting and the body's innate immune response.

"In addition to the clinical evidence, there's also a logical basis for this connection," Moake said. "Clotting is a type of wound response, and wounds are magnets for infection, so there could be a selective advantage in triggering both responses at the same time."

But the link could also have a downside. For example, if a person has a genetic mutation or acquired disorder that causes their blood to clot more often or more extensively than normal, the overactive clotting could lead to the kind of inflammation that would typically be caused by an infection. Furthermore, initiation of the clotting process may initiate clinical relapses in patients susceptible to various types of severe inflammatory disease.

In fact, the symptoms in the above scenarios are not uncommon. For example, in prior research, Moake's lab conducted pioneering research on two disorders: thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), which causes clots to form in small blood vessels throughout the body and hemolytic uremic syndrome (HUS), which causes abnormal blood clots in the kidneys. Both HUS and TTP come in two varieties -- one that is triggered by infection or inappropriate antibody formation, and another that is hereditary. Moake said the newfound link between clot formation and the immune response could help improve the diagnosis and treatment for TTP, HUS and other puzzling blood disorders with similar symptoms.

The experiments Turner used to establish the link between clotting and the body's immune response involved a key clotting protein called von Willebrand factor (VWF) and about a dozen other proteins that are components of the "complement system." The complement system, a part of the body's innate immune system, is one of biology's most ancient forms of defense against invading pathogens.

The complement system consists of a series of proteins that are produced by a variety of cell types. These proteins circulate continuously in the bloodstream and react sequentially upon activation. When triggered, the complement component proteins join together to form a biological weapon called the "membrane attack complex" (MAC), which kills both invading bacteria and the body's own cells if they become infected or damaged.

Turner and Moake first thought of looking for the link more than two years ago after they collaborated with physicians at Texas Children's Hospital on several puzzling clinical cases. Turner designed and conducted a series of experiments to examine whether any of the proteins in the complement complex were likely to bind onto long strands of VWF. Each complement protein was detected with a specific antibody and a fluorescent tag that could be viewed with a specialized microscope.

She found that C3, an important complement pathway initiator protein, was produced by cells in such low concentration that it was almost impossible to see -- even with a fluorescent microscope. But that changed when she looked at experimental samples that contained both C3 and VWF.

"The signals were so clear," Turner recalled. "The VWF had so much C3 on it that it looked like a Christmas tree."

Moake said he and Turner are conducting follow-up research to measure more effectively the activation of C3 on VWF. They are also measuring whether the C3 activation stimulates the sequential cascade of reactions that leads to MAC formation. In particular, they are interested in studying how the connection might lead to autoimmune diseases by causing MAC to target the body's own healthy cells rather than sick or damaged cells.

"We'd like to know what happens on a cell's surface that ordinarily enables it to protect itself against MAC," Moake said. "We'd also like to know what can go wrong with cells in terms of sickness or trauma that might make them more susceptible to being attacked and killed by overactivation of the complement sequence during clotting."


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Viral Antigens

A virus antigen is a toxin or other substance given off by a virus which causes an immune response in its host. A viral protein is an antigen specified by the viral genome that can be detected by a specific immunological response.

Viral Morphology and Structure

Viruses are complexes consisting of protein and an RNA or DNA genome. They lack both cellular structure and independent metabolic processes. They replicate solely by exploiting living cells based on the information in the viral genome.

A mature virus particle is also known as a virion. It consists of either two or three basic components (Figure 1):

1. A genome of DNA or RNA, double-stranded or single-stranded, linear or circular, and in some cases segmented. A single-stranded nucleic acid can have plus or minus polarity.
2. The capsid, virus-coded proteins enclosing the nucleic acid of the virus and determining its antigenicity the capsid can have a cubic (rotational), helical or complex symmetry and is made up of subunits called capsomers.
3. In some cases an envelope that surrounds the capsid and is always derived from cellular membranes.

Other Components of Viral Particles:

4. Various enzymes. Viruses require a number of different enzymes depending on genome type and mode of infection. In several virus species enzymes are a component of the virus particle, for example the neuraminidase required for invasion and release of myxoviruses. Other examples include nucleic acid polymerases such as the RNA-dependent RNA polymerases in antisense viruses, the DNA polymerases in smallpox viruses and the RNA-dependent DNA polymerase in hepatitis B viruses and retroviruses.
5. Hemagglutinin. Some viruses (above all myxoviruses and paramyxoviruses) are capable of agglutinating various different human or animal erythrocytes. These viruses bear a certain surface protein (hemagglutinin) in their envelope that enables them to do this. The hemagglutination phenomenon can be made use of for quantitative viral testing or—in the hemagglutination inhibition test—for virus identification and antibody identification. In biological terms, hemagglutinin plays a decisive role in adsorption and penetration of the virus into the host cell.

Figure 1. Viral structure (a) and replication (b).

Principles of Viral Diseases

Viral disease is some harmful abnormality that results from viral infection of the host organism. Important principles that pertain to viral disease include the following: (1) many viral infections are subclinical (Figure 2) (2) the same disease may be produced by a variety of viruses (3) the same virus may produce a variety of diseases (4) the disease produced bears no relationship to viral morphology and (5) the outcome in any particular case is determined by both viral and host factors and is influenced by the genetics of each. Important features of two general categories of acute viral diseases (local, systemic) are compared in Table 1.

Table 1. Important Features of Acute Viral Diseases


Local Infections Systemic Infections
Specific disease example
Site of pathology
Incubation period
Viremia
Duration of immunity
Role of secretory antibody (IgA) in resistance
Respiratory(rhinovirus)
Portal of entry
Relatively short
Ausente
Variable—may be short
Usually important
Measles
Distant site
Relatively long
Regalo
Usually lifelong
Usually not important

To produce disease, viruses must enter a host, come in contact with susceptible cells, replicate, and produce cell injury. Specific steps involved in viral pathogenesis are the following: viral entry into the host, primary viral replication, viral spread, cellular injury, host immune response, viral clearance or establishment of persistent infection, and viral shedding.


METHODS article

Rym Ben-Othman 1,2 , Bing Cai 1 , Aaron C. Liu 1 , Natallia Varankovich 1 , Daniel He 1 , Travis M. Blimkie 3 , Amy H. Lee 4 , Erin E. Gill 3 , Mark Novotny 5 , Brian Aevermann 5 , Sibyl Drissler 6 , Casey P. Shannon 7 , Sarah McCann 1 , Kim Marty 1 , Gordean Bjornson 1 , Rachel D. Edgar 8 , David Tse Shen Lin 8 , Nicole Gladish 8 , Julia Maclsaac 8 , Nelly Amenyogbe 2 , Queenie Chan 9 , Alba Llibre 10 , Joyce Collin 11 , Elise Landais 11,12 , Khoa Le 11,12 , Samantha M. Reiss 13 , Wayne C. Koff 14 , Colin Havenar-Daughton 13 , Manraj Heran 15 , Bippan Sangha 15 , David Walt 16 , Mel Krajden 17 , Shane Crotty 13 , Devin Sok 11,12 , Bryan Briney 11 , Dennis R. Burton 11 , Darragh Duffy 10 , Leonard J. Foster 9 , William W. Mohn 18 , Michael S. Kobor 8 , Scott J. Tebbutt 7,19 , Ryan R. Brinkman 6,20 , Richard H. Scheuermann 5,13 , Robert E. W. Hancock 3 , Tobias R. Kollmann 1,2 and Manish Sadarangani 1*
  • 1 Vaccine Evaluation Center, BC Children’s Hospital Research Institute, Vancouver, BC, Canada
  • 2 Telethon Kids Institute, University of Western Australia, Nedlands, WA, Australia
  • 3 Centre for Microbial Diseases and Immunity Research, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada
  • 4 Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
  • 5 Department of Informatics, J. Craig Venter Institute (La Jolla), La Jolla, CA, United States
  • 6 Terry Fox Laboratory, Vancouver, BC, Canada
  • 7 Prevention of Organ Failure (PROOF) Centre of Excellence and Centre for Heart Lung Innovation, St. Paul's Hospital, Vancouver, BC, Canada
  • 8 Centre for Molecular Medicine and Therapeutics, Department of Medical Genetics, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada
  • 9 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada
  • 10 Translational Immunology Lab, Institut Pasteur, Paris, France
  • 11 Department of Immunology and Microbiology, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, United States
  • 12 IAVI Neutralizing Antibody Center, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, United States
  • 13 Center for Infectious Disease and Vaccine Research, La Jolla Institute for Immunology (LJI), La Jolla, CA, United States
  • 14 Human Vaccines Project, New York, NY, United States
  • 15 Department of Radiology, BC Children’s Hospital, Vancouver, BC, Canada
  • 16 Wyss Institute at Harvard University, Department of Pathology, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, United States
  • 17 British Columbia Centre for Disease Control, Vancouver, BC, Canada
  • 18 Department of Microbiology and Immunology, Life Sciences Institute, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada
  • 19 Department of Medicine, Division of Respiratory Medicine, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada
  • 20 Department of Medical Genetics, University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada

Conventional vaccine design has been based on trial-and-error approaches, which have been generally successful. However, there have been some major failures in vaccine development and we still do not have highly effective licensed vaccines for tuberculosis, HIV, respiratory syncytial virus, and other major infections of global significance. Approaches at rational vaccine design have been limited by our understanding of the immune response to vaccination at the molecular level. Tools now exist to undertake in-depth analysis using systems biology approaches, but to be fully realized, studies are required in humans with intensive blood and tissue sampling. Methods that support this intensive sampling need to be developed and validated as feasible. To this end, we describe here a detailed approach that was applied in a study of 15 healthy adults, who were immunized with hepatitis B vaccine. Sampling included

350 mL of blood, 12 microbiome samples, and lymph node fine needle aspirates obtained over a

7-month period, enabling comprehensive analysis of the immune response at the molecular level, including single cell and tissue sample analysis. Samples were collected for analysis of immune phenotyping, whole blood and single cell gene expression, proteomics, lipidomics, epigenetics, whole blood response to key immune stimuli, cytokine responses, in vitro T cell responses, antibody repertoire analysis and the microbiome. Data integration was undertaken using different approaches—NetworkAnalyst and DIABLO. Our results demonstrate that such intensive sampling studies are feasible in healthy adults, and data integration tools exist to analyze the vast amount of data generated from a multi-omics systems biology approach. This will provide the basis for a better understanding of vaccine-induced immunity and accelerate future rational vaccine design.


Why would blood type matter?

Since the early days of the pandemic, several studies of coronavirus patients have uncovered trends in what blood types seem to become infected most often, Live Science previously reported.

"Many studies have found associations between blood groups and propensity for SARS-CoV-2 infections," in particular, showing that people with type O blood have a lower risk of catching COVID-19, comparado con non-O blood types, said Dr. Torben Barington, a clinical immunologist at Odense University Hospital and the University of Southern Denmark, who was not involved in the study. People with type A blood may also be more likely to develop severe symptoms and respiratory failure when they do contract the virus, some studies found.

"Several hypotheses have been proposed for these associations, but we still need to learn what the mechanisms actually are," Barington told Live Science in an email. This new study hints at a possible explanation for why SARS-CoV-2 may infect blood type A individuals more easily than type O &mdash though it doesn't explain why type B is also linked to more infections than type O, he noted.

Stowell said that he and his colleagues were curious about the link between blood type and COVID-19, but that they actually struck inspiration for their new study while developing a diagnostic test for the disease.

While creating the test, "we started looking at different parts of the virus and realized that the receptor binding domain … it looks very similar to an ancient group of proteins called galectins," Stowell said.

Galectins can be found in all multicellular animals and bind to carbohidratos, or sugar structures, known as glycans in humans, galectins can be found all over the body and participate in many processes, from muscle development to metabolism to immune cell behavior, Stowell said.

In the past, "we've observed that galectins really love to bind to blood group antigens," proteins and molecules that are specific to different blood groups and stick off the surface of cells. Blood group antigens come in two flavors &mdash A and B &mdash and the presence or absence of these antigens determine a person's blood group &mdash A, B, AB, which has both, or O, which has neither, according to the American Red Cross. The antigens are found not only on blood cells in the body, but also on other tissues, including the lining of the lungs.

Given the molecular similarity between the coronavirus RBD and galectins, "we thought, 'Well, maybe the virus directly binds to blood group antigens,'" Stowell said. If that were the case, blood group antigens may somehow influence the likelihood of the infection taking hold, he said. For example, some viruses accrue on cells by first grabbing hold of glycans on their surfaces, according to a 2016 report in the journal Current Opinion in Structural Biology the viruses then let go of these glycans to slip through nearby entryways into the cell, triggering infection.

Something similar could potentially be happening with blood group antigens and SARS-CoV-2, the authors thought. With this hypothesis in hand, the team headed to the lab to run experiments.


Antigenic Characterization

&ldquoAntigens&rdquo are molecular structures on the surface of viruses that are recognized by the immune system and are capable of triggering an immune response (antibody production). On influenza viruses, the major antigens are found on the virus&rsquo surface proteins (see Figure 1).

When someone is exposed to an influenza virus (either through infection or vaccination) their immune system makes specific antibodies against the antigens (surface proteins) on that particular influenza virus. The term &ldquoantigenic properties&rdquo is used to describe the antibody or immune response triggered by the antigens on a particular virus. &ldquoAntigenic characterization&rdquo refers to the analysis of a virus&rsquo antigenic properties to help assess how related it is to another virus.

CDC antigenically characterizes about 2,000 influenza viruses every year to compare how similar currently circulating influenza viruses are to those that were included in the influenza vaccine and to monitor for changes in circulating influenza viruses. Antigenic characterization can give an indication of the flu vaccine&rsquos ability to produce an immune response against the influenza viruses circulating in people. This information also helps experts decide what viruses should be included in the upcoming season&rsquos influenza vaccine.

Other information that determines how similar a circulating virus is to a vaccine virus or another virus are the results of serology tests and genetic sequencing.

The above image shows the different features of an influenza virus, including the surface proteins hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). Following influenza infection or receipt of the influenza vaccine, the body&rsquos immune system develops antibodies that recognize and bind to &ldquoantigenic sites,&rdquo which are regions found on an influenza virus&rsquo surface proteins. By binding to these antigenic sites, antibodies neutralize flu viruses, which prevents them from causing further infection.

The Hemagglutinin Inhibition Assay (HI Test)

Scientists use a test called the hemagglutinin inhibition (HI) assay to antigenically characterize influenza viruses. The HI test works by measuring how well antibodies bind to (and thus inactivate) influenza viruses.

Scientists use the HI test to assess the antigenic similarity between influenza viruses. This test is particularly useful for helping to select the vaccine viruses used in the seasonal flu vaccine. HI test results can tell us whether antibodies developed against vaccination with one virus are antigenically similar enough to another circulating influenza virus to produce an immune response against that circulating virus. Scientists also use the HI test to compare antigenic changes in currently circulating influenza viruses with influenza viruses that have circulated in the past.

The HI test involves three main components: antibodies, influenza virus, and red blood cells that are mixed together in the wells (i.e., cups) of a microtiter plate. (See Image 1.)

A microtiter plate is used to perform the HI test. The plate contains wells (i.e., cup-like depressions that can hold a small amount of liquid) where the solution of antibodies, influenza virus and red blood cells are inserted and allowed to interact. These wells are arranged according to rows and columns (which are identified on the microtiter plate by letters and numbers, respectively). The rows of the plate can be used to test different influenza viruses against the same set of antibodies. The columns can be used to differentiate between greater dilutions of antibodies, like a scale from low to high going from left to right (see Figures 3 and 4 for an example).

The antibodies used in the HI test are obtained by infecting an animal (usually a ferret) that is immunologically naïve (i.e., it has not been exposed to any influenza virus or vaccine previously in its lifetime). The animal&rsquos immune system creates antibodies in response to the antigens on the surface of the specific flu virus that was used to infect that animal. To study these antibodies, a sample of blood (serum) is drawn from the animal. The HI test measures how well these antibodies recognize and bind to other influenza viruses (for example, influenza viruses that have been isolated from flu patients). If the ferret antibodies (that resulted from exposure to the vaccine virus) recognize and bind to the influenza virus from a sick patient, this indicates that the vaccine virus is antigenically similar to the influenza virus obtained from the sick patient. This finding has implications for how well the vaccine might work in people. See Flu Vaccine Effectiveness: Questions and Answers for Health Professionals for more information.

As previously mentioned, the influenza viruses used in the HI test are taken from samples from sick people. CDC and other WHO collaborating centers collect specimens from people all over the world to track which influenza viruses are infecting humans and to monitor how these viruses are changing.

For the HI test, red blood cells (RBCs) are taken from animals (usually turkeys or guinea pigs). They are used in the HI test because influenza viruses bind to them. Normally, RBCs in a solution will sink to the bottom of the assay well and form a red dot at the bottom (Figure 2A). However, when an influenza virus is added to the RBC solution, the virus&rsquo hemagglutinin (HA) surface proteins will bind to multiple RBCs. When influenza viruses bind to the RBCs, the red cells form a lattice structure (Figure 2B). This keeps the RBCs suspended in solution instead of sinking to the bottom and forming the red dot. The process of the influenza virus binding to RBCs to form the lattice structure is called &ldquohemagglutination.&rdquo

The HI test involves the interaction of red blood cells (RBCs), antibody and influenza virus. Row A shows that in the absence of virus, RBCs in a solution will sink to the bottom of a microtiter plate well and look like a red dot. Row B shows that influenza viruses will bind to red blood cells when placed in the same solution. This is called hemagglutination and is represented by the formation of the lattice structure, depicted in the far right column under &ldquoMicrotiter Results.&rdquo Row C shows how antibodies that are antigenically similar to a virus being tested will recognize and bind to that influenza virus. This prevents the virus and RBCs from binding, and therefore, hemagglutination does not occur (i.e., hemagglutination inhibition occurs instead).

When antibodies are pre-mixed with influenza virus followed by RBCs, the antibodies will bind to influenza virus antigens that they recognize, covering the virus so that its HA surface proteins can no longer bind to RBCs (Figure 2C). The reaction between the antibody and the virus inhibits (i.e., prevents) hemagglutination from occurring, which results in hemagglutination inhibition (as shown in Figure 2C). This is why the assay is called a &ldquohemagglutinin inhibition (HI) test.&rdquo Hemagglutination (as depicted in Figure 2B) occurs when antibodies do not recognize and bind to the influenza viruses in the solution, and as a result, the influenza viruses bind to the red blood cells in the solution, forming the lattice structure. When the antibodies do recognize and bind to the influenza viruses in the solution, this shows that the vaccine virus (like the one the ferrets were infected with) has produced an immune response against the influenza virus obtained from the sick patient. When this happens, the influenza virus being tested is said to be &ldquoantigenically like&rdquo the influenza virus that created the antibodies (from ferrets).

When a circulating influenza virus is antigenically different from a vaccine or reference virus, the antibodies (developed in response to the vaccine or reference virus) will not recognize and bind to the circulating influenza virus&rsquo surface antigens. In the HI test this will cause hemagglutination to occur (see Figure 2B). This indicates that the vaccine virus or reference virus has not caused an immune response (i.e., the creation of antibodies) that recognizes and targets the circulating influenza virus. Circulating influenza viruses tested via the HI test are typically obtained from respiratory samples collected from ill patients.

Assessing Antigenic Similarity Using the HI Test

The HI test assesses the degree of antigenic similarity between two viruses using a scale based on greater dilutions of antibodies. As previously mentioned, the HI test is performed using a microtiter plate. The microtiter plate contains rows and columns of wells (i.e., cups) where RBCs, influenza virus and antibodies (developed against a comparison virus, such as a vaccine virus) are mixed. Dilutions are marked across the top of the microtiter plate. These dilutions function as a scale for assessing antigenic similarity and immune response. By testing the ability of greater dilutions of antibody to prevent hemagglutination, scientists measure how well those antibodies recognize and bind to (and therefore inactivate) an influenza virus. The higher the dilution, the fewer antibodies are needed to block hemagglutination and the more antigenically similar the two viruses being compared are to each other. The highest dilution of antibody that results in hemagglutinin inhibition is considered a virus&rsquos HI titer (Figure 3). Higher HI titers are associated with greater antigenic similarity. Greater antigenic similarity suggests that vaccination would produce an immune response against the test virus.

This virus sample has an HI titer of 1280, which means that the greatest dilution of antibody that still blocked hemagglutination from occurring was at 1280 dilution. At this dilution, the antibodies were still capable of recognizing and binding to the antigens on the virus.

When CDC antigenically characterizes influenza viruses to inform decisions on the formulation of the seasonal flu vaccine, the HI test is used to compare currently circulating viruses (B&C) with vaccine viruses (A). This allows scientists to quickly determine if a virus used in the seasonal flu vaccine is antigenically similar to circulating influenza viruses and therefore capable of producing an immune response against them.

Public health experts consider influenza viruses to be antigenically similar or &ldquolike&rdquo each other if their HI titers differ by two dilutions or less. (This is equivalent to a two-well (i.e., a four-fold dilution) or less difference). Using figure 4 as an example, when circulating virus 1 is compared to a vaccine virus, circulating virus 1 differs by one dilution (a 2-fold difference) and therefore is &ldquolike&rdquo the previous season&rsquos vaccine virus. However, circulating virus 2 differs by five dilutions (a 32-fold difference) and therefore is not like the previous season&rsquos vaccine virus. Circulating viruses that are antigenically dissimilar (i.e., not &ldquolike&rdquo) the reference panel are considered &ldquolow reactors.&rdquo

Limitaciones

Antigenic characterization gives important information about whether a vaccine made using a specific vaccine virus will protect against circulating influenza viruses, but there are several limitations to antigenic characterization test methodology, which are described below.

Egg Adaptations

Right now, most flu vaccines are made using viruses grown in eggs. As human influenza viruses adapt to grow in eggs, genetic changes can occur in the viruses. These are called &ldquoegg-adapted&rdquo changes. Some egg-adapted changes may change the virus&rsquo antigenic (or immunogenic) properties while others may not. Egg-adapted changes have become a particular problem for selection of candidate vaccine viruses (CVVs) for the influenza A(H3N2) virus component of the flu vaccine. Influenza A(H3N2) viruses tend to grow less well in chicken eggs than influenza A(H1N1) viruses and they also are more prone to egg-adapted changes. Such changes can reduce the immune protection provided by the flu vaccine against circulating A(H3N2) viruses.