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¿Por qué hay 10 pasos de pares de bases, no 16?

¿Por qué hay 10 pasos de pares de bases, no 16?


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En un curso de bioquímica que estoy tomando, el profesor enfatizó que hay 10 posibles pasos de pares de bases; He incluido una captura de pantalla de una diapositiva que indica esto. Esto me confunde, porque no puedo entender por qué no es 16; ¿Por qué no se permiten los 6 en gris en la imagen (por ejemplo, CG apilado en recuentos de CG, pero GC apilado en GC no)? TA | AT se enumera como distinto de AT | TA, por lo que no es que los en gris sean redundantes. Encontré un par de artículos que mencionan que hay 10 pasos básicos, pero no por qué. (No puedo comunicarme con el conferenciante).

¡Gracias por adelantado!


A diferencia del ARN, donde el sentido de la molécula es único, el ADN es de doble hebra, y las dos hebras tienen el sentido opuesto. En el sentido de estabilidad química, no importa qué sentido se considere positivo y cuál negativo.

Por lo tanto, si consideramos un paso de par de bases WX | YZ, tenemos Y siguiendo a W en la hebra de sentido positivo (W-> Y), y X siguiendo a Z en la hebra de sentido negativo (antisentido) (Z -> X). Esto significa que, si etiquetamos las hebras de manera diferente, tendríamos Z-> X en la hebra positiva y W-> Y en la negativa, es decir, tendríamos el paso de par de bases ZY | XW. Es decir, la regla de simetría general es $$ WX | YZ flecha derecha ZY | XW $$

En particular, esto significa que CG | CG es idéntico a GC | GC, mientras que TA | AT es idéntico a sí mismo, en lugar de a AT | TA.

Visualmente, estas simetrías se obtienen girando la imagen del paso del par de bases 180 grados, como se puede ver fácilmente en la imagen proporcionada en la pregunta.


La estructura del ADN en el núcleo del nucleosoma.

La estructura cristalina de 1,9 Å de resolución de la partícula del núcleo del nucleosoma que contiene 147 pares de bases de ADN revela la conformación del ADN nucleosómico con una precisión sin precedentes. La estructura del ADN es notablemente diferente de la de los oligonucleótidos y de los complejos de proteínas y ADN que no son histonas. La geometría de pasos de pares de bases de ADN tiene, en general, el doble de curvatura necesaria para acomodar la trayectoria superhélice del ADN en el nucleosoma. Los segmentos de ADN doblados en el surco menor se retuercen o se desplazan alternativamente. Los inusuales parámetros conformacionales del ADN inducidos por la unión de la proteína histona tienen implicaciones para el reconocimiento de la proteína dependiente de la secuencia y el posicionamiento y la movilidad de los nucleosomas. La comparación de la estructura de 147 pares de bases con dos estructuras de 146 pares de bases revela alteraciones en la torsión del ADN que son evidentemente comunes en la cromatina en masa y que son de probable importancia para la formación de fibras de cromatina y la remodelación de la cromatina.


Experimento de tubo de goma y "hélice"

Corte dos tramos de tubo de goma de 1/8 '', cada uno de unos 20 '' de largo. Inserte un trozo de tubo más pequeño o un trozo de punta de pipeta en los extremos para permitir que los extremos se conecten. Estas dos piezas de tubo de goma representan cada hebra de un dúplex de ADN. El ADN se puede ligar o unir cuando tenemos extremos 5 '(fosfato) y 3' (hidroxilo). Por lo tanto, necesitamos una forma de realizar un seguimiento de qué extremo es cuál para cada pieza de tubería.

  1. Puede escribir & quot5 & quot y & quot3 & quot en los extremos opuestos de cada pieza y alinearlos en direcciones opuestas, o
  2. En una pieza de tubo, marque ambos extremos con un marcador. Solo se pueden ligar los extremos de colores similares (consulte el diagrama anterior)

Esto le permitirá mantener la "orientación" correcta de las hebras cuando "ligue" las hebras del dúplex.

  • Introduzca un número de enlace = +2 (dos giros diestros de 360 ​​grados en el dúplex)
  • luego & quot; liga & quot los extremos (asegúrese de mantener la orientación de la hebra, es decir, conecte las dos hebras correspondientes).

Confirme que se haya introducido el número de enlace correcto "fundiendo" el dúplex en un lado y forzando todos los giros en una pequeña región del dúplex (fácil de contar de esta manera).

  • Confirme que mirando hacia abajo de la hélice en los giros que están & quot; diestro & quot (no importa en qué dirección mire hacia abajo de la hélice).

Tenga en cuenta que el "dúplex", cuando se sostiene entre el pulgar y el índice y se deja colgar, prefiere una topología "superenrollada", en lugar de "relajada" [Nota: esto se suele ver con tubos muy delgados, es posible que los tubos de mayor diámetro no adopten fácilmente esta topología].

  • Confirme que las & quotsupercoils & quot son realmente zurdo mientras mira hacia abajo las superenrollamientos (independientemente de la dirección hacia abajo de las superenrollamientos).
  • Lo más probable es que & quotsupercoil & quot sea un total de 360 ​​& deg, en lugar de 180 & deg. En cualquier caso, sujete los extremos del dúplex de modo que haya una superbobina zurda de 360 ​​& deg & quotsupercoil & quot.
  • Ahora, cuente cuántas veces se cruzan las hebras del "dúplex". En esta conformación, las hebras del "dúplex" no en realidad se cruzan entre sí (Nota: es posible que tenga una hebra que se cruce y luego se descruce, para un resultado neto de no cruce).

Por lo tanto, en respuesta a la introducción del número de enlace +2, el & quot dúplex & quot puede adoptar +2 (180 & deg) & quotsupercoils & quot, de modo que el resultado número de vinculación aparente (es decir, & quotgiro& quot valor) de las dos hebras es cero

Un superenrollamiento se considera positivo, si es "zurdo").

  • Eliminar uno & quotpositivo& quot superbobina desenrollando por 180& deg.
  • Ahora sostenga los extremos del & quot dúplex & quot y cuente el número de vinculación aparente (es decir, & quotgiros& quot). Habrá un solo diestro & quotgiro& quot.
  • Por tanto, una única superenrollamiento positiva de 180 grados tiene el efecto de eliminar una única torsión positiva (es decir, reduce el número de enlace aparente en 1).

los Retorcerse número se refiere al número de superenrollamientos presentes.

  • Aunque pueda parecer que la consecuencia de introducir superenrollamiento (Escritura) está cambiando el número de vinculación, No lo es.
  • La consecuencia de Writhe es que el Giro (aparentenúmero de enlace) está alterado (aumentado o disminuido).

El ADN tiene una preferencia Valor de & quotTwist & quot (número de enlace aparente preferido) para una longitud especificada de ADN:

  • El modelo de Watson y Crick del dúplex de ADN tenía 10 pares de bases por turno.
  • En condiciones fisiológicas de sal (NaCl 0,15 M) y temperatura, El ADN prefiere adoptar alrededor de 10,6 pb / turno.
  • Se introduce Wordhe en el ADN para lograr este valor para el & quotTwist & quot (número de enlace aparente)

Para un número de enlace dado (fijo) sobre una longitud determinada de ADN, el ADN puede adoptar superenrollamientos positivos o negativos para lograr un "torsión" (número de enlace aparente) de modo que habrá 10,6 pares de bases / vuelta.

El número de enlace no cambia con el superenrollamiento (solo puede cambiar rompiendo el dúplex)

  • Writhe tiene el efecto de cambiar el número de vínculo aparente.
  • Una superenrollamiento se define como capaz de cambiar el número de enlace aparente en +/- 1.

El valor de torsión (número de enlace aparente) para una longitud determinada de ADN está relacionado con el número de pares de bases por turno que el ADN quiere adoptar:

Número de enlace = (tamaño del ADN en pares de bases) / (pares de bases / turno) + Escritura

Número de enlace = # de giros + retorcimiento

esto generalmente se abrevia como

Enlace = Twist + Writhe

Por ejemplo, si tenemos una molécula de ADN cerrada circularmente con una longitud de 5300 pares de bases y una conformación preferida de 10.6 pares de bases por vuelta, ¿puede lograr esta conformación sin tener que introducir ningún superenrollamiento (es decir, retorcerse)?

Número de enlace aparente (Twist) = (5300 pares de bases) / (10,6 pares de bases / turno)

Número de vinculación aparente (Twist) = 500

En otras palabras, para lograr la conformación deseada de 10,6 pb / vuelta en la hélice, se requieren exactamente 500 vueltas en la longitud de 5300 pares de bases.

Número de vinculación = 500 + Escritura

Podemos tener valores integrales para el número de enlace, y ciertamente podemos introducir 500, lo que no requeriría ninguna escritura:

¿Cuál es la molécula de ADN de 5200 pares de bases?

Número de enlace aparente (Twist) = (5200 pares de bases) / (10,6 pares de bases / turno)

Número de vinculación aparente (Twist) = 490,6

Podemos introducir 490 o 491 como número de vinculación, pero no 490,6. ¿Qué sucede si hay un número de ligamiento de 490 en la molécula de ADN?

Número de enlace = Twist + Writhe

En este caso, el ADN adopta un superenrollamiento negativo de 0,6 (aproximadamente 108 ° C de un superenrollamiento de la mano derecha) que aumentará el número de enlace aparente de 490 a 490,6 (y alcanzará 10,6 pares de bases por vuelta en el dúplex).

¿Cuántos pares de bases por turno habría en el ADN si el ADN no pudiera adoptar ninguna estructura de superenrollamiento para esta longitud de ADN con un número de enlace de 490?

Número de enlace = Twist + Writhe

Twist = (5200 pares de bases) / (bp / turn) = 490 vueltas

pb / turno = 5200 pares de bases / 490 vueltas

Hay un poco más de 10,6 pares de bases por turno en el ADN.


Contenido

La PCR amplifica una región específica de una cadena de ADN (el ADN diana). La mayoría de los métodos de PCR amplifican fragmentos de ADN de entre 0,1 y 10 kilopares de bases (kpb) de longitud, aunque algunas técnicas permiten la amplificación de fragmentos de hasta 40 kbp. [5] La cantidad de producto amplificado está determinada por los sustratos disponibles en la reacción, que se vuelve limitante a medida que avanza la reacción. [6]

Una configuración básica de PCR requiere varios componentes y reactivos, [7] que incluyen:

  • a Plantilla de ADN que contiene la región diana de ADN para amplificar
  • a ADN polimerasa una enzima que polimeriza nuevas hebras de ADN resistentes al calor Taq La polimerasa es especialmente común, [8] ya que es más probable que permanezca intacta durante el proceso de desnaturalización del ADN a alta temperatura.
  • dos ADN imprimaciones que son complementarios a los extremos 3 '(tres primos) de cada una de las hebras sentido y antisentido del ADN diana (la ADN polimerasa solo puede unirse y alargarse a partir de una región bicatenaria de ADN sin cebadores, no hay doble -sitio de iniciación trenzado en el que se puede unir la polimerasa) [9] los cebadores específicos que son complementarios a la región diana del ADN se seleccionan de antemano y, a menudo, se fabrican a medida en un laboratorio o se compran a proveedores bioquímicos comerciales
  • trifosfatos de desoxinucleósido, o dNTP (a veces llamados nucleótidos "desoxinucleótido trifosfato" que contienen grupos trifosfato), los componentes básicos a partir de los cuales la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN
  • a solución tampón Proporcionar un entorno químico adecuado para una actividad y estabilidad óptimas de la ADN polimerasa.
  • bivalencia, típicamente iones magnesio (Mg) o manganeso (Mn) Mg 2+ es el más común, pero Mn 2+ puede usarse para mutagénesis de ADN mediada por PCR, ya que una concentración más alta de Mn 2+ aumenta la tasa de error durante la síntesis de ADN [10 ] y cationes monovalentes, típicamente iones de potasio (K) [se necesita una mejor fuente]

Por lo general, la reacción se lleva a cabo en un volumen de 10 a 200 μL en pequeños tubos de reacción (volúmenes de 0,2 a 0,5 mL) en un termociclador. El termociclador calienta y enfría los tubos de reacción para alcanzar las temperaturas requeridas en cada paso de la reacción (ver más abajo). Muchos termocicladores modernos utilizan el efecto Peltier, que permite calentar y enfriar el bloque que sostiene los tubos de PCR simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos de reacción de paredes delgadas permiten una conductividad térmica favorable para permitir un equilibrio térmico rápido. La mayoría de los termocicladores tienen tapas calientes para evitar la condensación en la parte superior del tubo de reacción. Los termocicladores más antiguos que carecen de una tapa caliente requieren una capa de aceite encima de la mezcla de reacción o una bola de cera dentro del tubo.

Procedimiento Editar

Normalmente, la PCR consta de una serie de 20 a 40 cambios de temperatura repetidos, denominados ciclos térmicos, y cada ciclo suele constar de dos o tres pasos de temperatura discretos (consulte la figura siguiente). El ciclo suele estar precedido por un solo paso de temperatura a una temperatura muy alta (& gt90 ° C (194 ° F)), y seguido de una retención al final para la extensión del producto final o un breve almacenamiento. Las temperaturas utilizadas y el tiempo que se aplican en cada ciclo dependen de una variedad de parámetros, incluida la enzima utilizada para la síntesis de ADN, la concentración de iones bivalentes y dNTP en la reacción y la temperatura de fusión (Tmetro) de los cebadores. [11] Los pasos individuales comunes a la mayoría de los métodos de PCR son los siguientes:

  • Inicialización: Este paso solo es necesario para las ADN polimerasas que requieren activación por calor mediante PCR de inicio en caliente. [12] Consiste en calentar la cámara de reacción a una temperatura de 94–96 ° C (201–205 ° F), o 98 ° C (208 ° F) si se utilizan polimerasas extremadamente termoestables, que luego se mantiene durante 1– 10 minutos.
  • Desnaturalización: Este paso es el primer evento cíclico regular y consiste en calentar la cámara de reacción a 94–98 ° C (201–208 ° F) durante 20–30 segundos. Esto provoca la fusión o desnaturalización del ADN de la plantilla de ADN de doble hebra al romper los enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias, dando lugar a dos moléculas de ADN de hebra sencilla.
  • Recocido: En el siguiente paso, la temperatura de reacción se reduce a 50–65 ° C (122–149 ° F) durante 20–40 segundos, lo que permite la hibridación de los cebadores con cada una de las plantillas de ADN monocatenario. Normalmente se incluyen dos cebadores diferentes en la mezcla de reacción: uno para cada uno de los dos complementos monocatenarios que contienen la región diana. Los cebadores son secuencias monocatenarias en sí mismas, pero son mucho más cortos que la longitud de la región diana, y complementan solo secuencias muy cortas en el extremo 3 'de cada cadena.
  • Extensión / alargamiento: La temperatura en este paso depende de la ADN polimerasa utilizada la temperatura de actividad óptima para la ADN polimerasa termoestable de Taq la polimerasa es de aproximadamente 75-80 ° C (167-176 ° F), [13] [14] aunque una temperatura de 72 ° C (162 ° F) se usa comúnmente con esta enzima. En este paso, la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN complementaria a la cadena de la plantilla de ADN añadiendo dNTP libres de la mezcla de reacción que es complementaria a la plantilla en la dirección 5'-a-3 ', condensando el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxi al final de la cadena de ADN naciente (alargada). El tiempo preciso requerido para el alargamiento depende tanto de la ADN polimerasa utilizada como de la longitud de la región diana del ADN para amplificar. Como regla general, a su temperatura óptima, la mayoría de las ADN polimerasas polimerizan mil bases por minuto. En condiciones óptimas (es decir, si no hay limitaciones debido a sustratos o reactivos limitantes), en cada paso de extensión / alargamiento, el número de secuencias diana de ADN se duplica. Con cada ciclo sucesivo, las hebras de plantilla originales más todas las hebras recién generadas se convierten en hebras de plantilla para la siguiente ronda de elongación, lo que conduce a una amplificación exponencial (geométrica) de la región diana de ADN específica.
  • Alargamiento final: Este único paso es opcional, pero se realiza a una temperatura de 70 a 74 ° C (158 a 165 ° F) (el rango de temperatura necesario para la actividad óptima de la mayoría de las polimerasas utilizadas en la PCR) durante 5 a 15 minutos después de la última PCR. ciclo para asegurar que cualquier ADN monocatenario restante esté completamente alargado.
  • Retención final: El paso final enfría la cámara de reacción a 4–15 ° C (39–59 ° F) durante un tiempo indefinido y puede emplearse para el almacenamiento a corto plazo de los productos de PCR.

Para comprobar si la PCR generó con éxito la región diana de ADN anticipada (también denominada a veces amplímero o amplicón), se puede emplear electroforesis en gel de agarosa para la separación por tamaños de los productos de PCR. El tamaño de los productos de la PCR se determina comparándolo con una escalera de ADN, un marcador de peso molecular que contiene fragmentos de ADN de tamaños conocidos, que corre en el gel junto con los productos de la PCR.

Etapas Editar

Al igual que con otras reacciones químicas, la velocidad de reacción y la eficiencia de la PCR se ven afectadas por factores limitantes. Por lo tanto, todo el proceso de PCR se puede dividir en tres etapas según el progreso de la reacción:

  • Amplificación exponencial: En cada ciclo, la cantidad de producto se duplica (asumiendo una eficiencia de reacción del 100%). Después de 30 ciclos, una sola copia de ADN se puede incrementar hasta 1,000,000,000 (mil millones) de copias. Entonces, en cierto sentido, la replicación de una hebra discreta de ADN se está manipulando en un tubo en condiciones controladas. [15] La reacción es muy sensible: solo deben estar presentes cantidades diminutas de ADN.
  • Nivelación del escenario: La reacción se ralentiza a medida que la ADN polimerasa pierde actividad y el consumo de reactivos, como dNTP y cebadores, hace que se vuelvan más limitados.
  • Meseta: No se acumula más producto por agotamiento de reactivos y enzima.

En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, en parte debido a su sensibilidad a la contaminación que causa la amplificación de productos de ADN falsos. Debido a esto, se han desarrollado varias técnicas y procedimientos para optimizar las condiciones de la PCR. [16] [17] La ​​contaminación con ADN extraño se aborda con protocolos y procedimientos de laboratorio que separan las mezclas previas a la PCR de los posibles contaminantes del ADN. [7] Por lo general, esto implica la separación espacial de las áreas de preparación de PCR de las áreas para análisis o purificación de productos de PCR, el uso de recipientes de plástico desechables y la limpieza a fondo de la superficie de trabajo entre las configuraciones de reacción. Las técnicas de diseño de cebadores son importantes para mejorar el rendimiento del producto de PCR y para evitar la formación de productos falsos, y el uso de componentes tampón alternativos o enzimas polimerasas puede ayudar con la amplificación de regiones de ADN largas o problemáticas de otro modo. La adición de reactivos, como formamida, en sistemas tampón puede aumentar la especificidad y el rendimiento de la PCR. [18] Se pueden realizar simulaciones por computadora de los resultados teóricos de la PCR (PCR electrónica) para ayudar en el diseño del cebador. [19]

Aislamiento selectivo de ADN Editar

La PCR permite el aislamiento de fragmentos de ADN a partir de ADN genómico mediante la amplificación selectiva de una región específica de ADN. Este uso de la PCR aumenta de muchas formas, como la generación de sondas de hibridación para la hibridación Southern o Northern y la clonación de ADN, que requieren mayores cantidades de ADN, que representan una región de ADN específica. La PCR proporciona a estas técnicas grandes cantidades de ADN puro, lo que permite el análisis de muestras de ADN incluso a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida.

Otras aplicaciones de la PCR incluyen la secuenciación de ADN para determinar secuencias desconocidas amplificadas por PCR en las que uno de los cebadores de amplificación puede usarse en la secuenciación de Sanger, el aislamiento de una secuencia de ADN para acelerar las tecnologías de ADN recombinante que implican la inserción de una secuencia de ADN en un plásmido, fago , o cósmido (dependiendo del tamaño) o el material genético de otro organismo. Colonias bacterianas (como E. coli) se puede cribar rápidamente mediante PCR en busca de construcciones de vector de ADN correctas. [20] La PCR también se puede utilizar para la toma de huellas genéticas, una técnica forense que se utiliza para identificar a una persona u organismo mediante la comparación de ADN experimentales a través de diferentes métodos basados ​​en la PCR.

Algunos métodos de huellas dactilares de PCR tienen un alto poder discriminativo y pueden usarse para identificar relaciones genéticas entre individuos, como padres e hijos o entre hermanos, y se usan en pruebas de paternidad (Fig. 4). Esta técnica también se puede utilizar para determinar las relaciones evolutivas entre organismos cuando se utilizan ciertos relojes moleculares (es decir, los genes de ARNr 16S y recA de microorganismos). [21]

Amplificación y cuantificación de ADN Editar

Debido a que la PCR amplifica las regiones de ADN a las que se dirige, la PCR se puede utilizar para analizar cantidades extremadamente pequeñas de muestra. Esto suele ser fundamental para el análisis forense, cuando solo se dispone de una pequeña cantidad de ADN como prueba. La PCR también se puede utilizar en el análisis de ADN antiguo que tiene decenas de miles de años. Estas técnicas basadas en PCR se han utilizado con éxito en animales, como un mamut de cuarenta mil años, y también en ADN humano, en aplicaciones que van desde el análisis de momias egipcias hasta la identificación de un zar ruso y el cuerpo de El rey inglés Ricardo III. [22]

Los métodos de PCR cuantitativa o PCR en tiempo real (qPCR, [23] que no debe confundirse con RT-PCR) permiten estimar la cantidad de una secuencia dada presente en una muestra, una técnica que a menudo se aplica para determinar cuantitativamente los niveles de expresión génica. La PCR cuantitativa es una herramienta establecida para la cuantificación de ADN que mide la acumulación de producto de ADN después de cada ronda de amplificación por PCR.

qPCR permite la cuantificación y detección de una secuencia de ADN específica en tiempo real ya que mide la concentración mientras se lleva a cabo el proceso de síntesis. Hay dos métodos para la detección y cuantificación simultáneas. El primer método consiste en utilizar tintes fluorescentes que se retienen de forma inespecífica entre las hebras dobles. El segundo método implica sondas que codifican secuencias específicas y están marcadas con fluorescencia. La detección de ADN utilizando estos métodos solo se puede ver después de que tenga lugar la hibridación de las sondas con su ADN complementario. Una combinación de técnicas interesante es la PCR en tiempo real y la transcripción inversa. Esta sofisticada técnica, denominada RT-qPCR, permite la cuantificación de una pequeña cantidad de ARN. A través de esta técnica combinada, el ARNm se convierte en ADNc, que se cuantifica adicionalmente usando qPCR. Esta técnica reduce la posibilidad de error en el punto final de la PCR, [24] aumentando las posibilidades de detección de genes asociados con enfermedades genéticas como el cáncer. [4] Los laboratorios utilizan RT-qPCR con el fin de medir con sensibilidad la regulación génica. Los fundamentos matemáticos para la cuantificación confiable de la PCR [25] y RT-qPCR [26] facilitan la implementación de procedimientos de ajuste precisos de datos experimentales en aplicaciones de investigación, médicas, diagnósticas y de enfermedades infecciosas. [27] [28] [29] [30]

Aplicaciones médicas y de diagnóstico Editar

Los futuros padres pueden someterse a pruebas para determinar si son portadores genéticos, o sus hijos pueden someterse a pruebas para ver si están realmente afectados por una enfermedad. [1] Las muestras de ADN para pruebas prenatales se pueden obtener mediante amniocentesis, muestreo de vellosidades coriónicas o incluso mediante el análisis de células fetales raras que circulan en el torrente sanguíneo de la madre. El análisis de PCR también es esencial para el diagnóstico genético previo a la implantación, en el que las células individuales de un embrión en desarrollo se analizan para detectar mutaciones.

  • La PCR también se puede utilizar como parte de una prueba sensible para tipificación de tejidos, vital para el trasplante de órganos. A partir de 2008, [actualización] existe incluso una propuesta para reemplazar las pruebas tradicionales basadas en anticuerpos para el tipo de sangre por pruebas basadas en PCR. [31]
  • Muchas formas de cáncer implican alteraciones oncogenes. Mediante el uso de pruebas basadas en PCR para estudiar estas mutaciones, los regímenes de terapia a veces se pueden personalizar individualmente para un paciente. La PCR permite el diagnóstico precoz de enfermedades malignas como la leucemia y los linfomas, que actualmente es el más desarrollado en la investigación del cáncer y ya se utiliza de forma rutinaria. Los ensayos de PCR se pueden realizar directamente en muestras de ADN genómico para detectar células malignas específicas de translocación a una sensibilidad que sea al menos 10.000 veces mayor que la de otros métodos. [32] La PCR es muy útil en el campo médico ya que permite el aislamiento y amplificación de supresores de tumores. La PCR cuantitativa, por ejemplo, se puede utilizar para cuantificar y analizar células individuales, así como para reconocer confirmaciones y combinaciones de ADN, ARNm y proteínas. [24]

Aplicaciones para enfermedades infecciosas Editar

La PCR permite un diagnóstico rápido y altamente específico de enfermedades infecciosas, incluidas las causadas por bacterias o virus. [33] La PCR también permite la identificación de microorganismos no cultivables o de crecimiento lento, como micobacterias, bacterias anaerobias o virus a partir de ensayos de cultivo de tejidos y modelos animales. La base de las aplicaciones de diagnóstico de la PCR en microbiología es la detección de agentes infecciosos y la discriminación de cepas no patógenas de patógenas en virtud de genes específicos. [33] [34]

La PCR ha revolucionado la caracterización y detección de organismos de enfermedades infecciosas de las siguientes formas:

  • los virus de inmunodeficiencia humana (o VIH), es un objetivo difícil de encontrar y erradicar. Las primeras pruebas de infección se basaron en la presencia de anticuerpos contra el virus que circulaban en el torrente sanguíneo. Sin embargo, los anticuerpos no aparecen hasta muchas semanas después de la infección, los anticuerpos maternos enmascaran la infección de un recién nacido y los agentes terapéuticos para combatir la infección no afectan a los anticuerpos. Se han desarrollado pruebas de PCR que pueden detectar tan solo un genoma viral entre el ADN de más de 50.000 células huésped. [35] Las infecciones se pueden detectar antes, la sangre donada puede analizarse directamente para detectar el virus, los recién nacidos pueden ser examinados de inmediato para detectar la infección y los efectos de los tratamientos antivirales se pueden cuantificar.
  • Algunos organismos patógenos, como el de tuberculosis, son difíciles de extraer de los pacientes y de cultivo lento en el laboratorio. Las pruebas basadas en PCR han permitido la detección de pequeñas cantidades de organismos patógenos (vivos o muertos), en muestras convenientes. También se puede utilizar un análisis genético detallado para detectar la resistencia a los antibióticos, lo que permite una terapia inmediata y eficaz. Los efectos de la terapia también se pueden evaluar de inmediato.
  • La propagación de un organismo de la enfermedad a través de poblaciones de animales domésticos o salvajes se puede controlar mediante pruebas de PCR. En muchos casos, se puede detectar y controlar la aparición de nuevos subtipos virulentos. Los subtipos de un organismo que fueron responsables de epidemias anteriores también se pueden determinar mediante análisis de PCR.
  • El ADN viral puede detectarse mediante PCR. Los cebadores utilizados deben ser específicos de las secuencias diana en el ADN de un virus, y la PCR puede usarse para análisis de diagnóstico o secuenciación de ADN del genoma viral. La alta sensibilidad de la PCR permite la detección del virus poco después de la infección e incluso antes del inicio de la enfermedad. [33] Esta detección temprana puede dar a los médicos un tiempo de espera significativo en el tratamiento. La cantidad de virus ("carga viral") en un paciente también se puede cuantificar mediante técnicas de cuantificación de ADN basadas en PCR (ver más abajo). Se usa una variante de PCR (RT-PCR) para detectar ARN viral en lugar de ADN: en esta prueba, la enzima transcriptasa inversa se usa para generar una secuencia de ADN que coincide con el ARN viral, este ADN luego se amplifica según el método de PCR habitual. La RT-PCR se usa ampliamente para detectar el genoma viral del SARS-CoV-2. [36]
  • Enfermedades como la tos ferina (o tos ferina) son causadas por la bacteria Bordetella pertussis. Esta bacteria está marcada por una grave infección respiratoria aguda que afecta a varios animales y humanos y ha provocado la muerte de muchos niños pequeños. La toxina de la tos ferina es una proteína exotoxina que se une a los receptores celulares mediante dos dímeros y reacciona con diferentes tipos de células, como los linfocitos T, que desempeñan un papel en la inmunidad celular. [37] La ​​PCR es una herramienta de prueba importante que puede detectar secuencias dentro del gen de la toxina pertussis. Debido a que la PCR tiene una alta sensibilidad para la toxina y un tiempo de respuesta rápido, es muy eficaz para diagnosticar la tos ferina en comparación con el cultivo. [38]

Aplicaciones forenses Editar

El desarrollo de protocolos de huellas dactilares genéticos (o ADN) basados ​​en PCR ha tenido una aplicación generalizada en la medicina forense:

  • En su forma más exigente, huella genética puede discriminar de forma única a cualquier persona de toda la población del mundo. Se pueden aislar muestras diminutas de ADN de la escena del crimen y compararlas con las de los sospechosos o de una base de datos de ADN de pruebas anteriores o condenados. A menudo se utilizan versiones más simples de estas pruebas para descartar rápidamente a los sospechosos durante una investigación criminal. La evidencia de crímenes de hace décadas se puede probar, confirmando o exonerando a las personas originalmente condenadas.
  • La tipificación forense de ADN ha sido una forma eficaz de identificar o exonerar a los sospechosos de delitos debido al análisis de las pruebas descubiertas en la escena del crimen. El genoma humano tiene muchas regiones repetitivas que se pueden encontrar dentro de secuencias de genes o en regiones no codificantes del genoma. Específicamente, hasta el 40% del ADN humano es repetitivo. [4] Hay dos categorías distintas para estas regiones repetitivas no codificantes en el genoma. La primera categoría se denomina repeticiones en tándem de número variable (VNTR), que tienen una longitud de 10 a 100 pares de bases y la segunda categoría se denomina repeticiones en tándem cortas (STR) y constan de secciones repetidas de 2 a 10 pares de bases. La PCR se utiliza para amplificar varios VNTR y STR conocidos utilizando cebadores que flanquean cada una de las regiones repetitivas. Los tamaños de los fragmentos obtenidos de cualquier individuo para cada uno de los STR indicarán qué alelos están presentes. Al analizar varios STR para un individuo, se encontrará un conjunto de alelos para cada persona que estadísticamente es probable que sea único. [4] Los investigadores han identificado la secuencia completa del genoma humano. Se puede acceder fácilmente a esta secuencia a través del sitio web de NCBI y se utiliza en muchas aplicaciones de la vida real. Por ejemplo, el FBI ha compilado un conjunto de sitios de marcadores de ADN que se utilizan para la identificación, y estos se denominan la base de datos de ADN del Sistema de índice de ADN combinado (CODIS). [4] El uso de esta base de datos permite utilizar el análisis estadístico para determinar la probabilidad de que una muestra de ADN coincida. La PCR es una herramienta analítica muy poderosa y significativa para usar en la tipificación de ADN forense porque los investigadores solo necesitan una cantidad muy pequeña del ADN objetivo para usar en el análisis. Por ejemplo, un solo cabello humano con un folículo piloso adherido tiene suficiente ADN para realizar el análisis. De manera similar, unos pocos espermatozoides, muestras de piel debajo de las uñas o una pequeña cantidad de sangre pueden proporcionar suficiente ADN para un análisis concluyente. [4]
  • Formas menos discriminatorias de huellas dactilares de ADN pueden ayudar a Prueba de paternidad de ADN, donde un individuo se empareja con sus parientes cercanos. El ADN de restos humanos no identificados puede analizarse y compararse con el de posibles padres, hermanos o hijos. Se pueden utilizar pruebas similares para confirmar a los padres biológicos de un niño adoptado (o secuestrado). También se puede confirmar (o descartar) el padre biológico real de un recién nacido.
  • Se ha demostrado que el diseño de PCR AMGX / AMGY no solo [aclaración necesaria] facilitan la amplificación de secuencias de ADN a partir de una cantidad minúscula de genoma. Sin embargo, también se puede utilizar para la determinación del sexo en tiempo real a partir de muestras de huesos forenses. Esto proporciona una forma poderosa y eficaz de determinar el género en casos forenses y especímenes antiguos. [39]

Aplicaciones de investigación Editar

La PCR se ha aplicado a muchas áreas de investigación en genética molecular:

  • La PCR permite la producción rápida de fragmentos cortos de ADN, incluso cuando no se conoce más que la secuencia de los dos cebadores. Esta capacidad de la PCR aumenta muchos métodos, como generar sondas de hibridación para la hibridación por transferencia Southern o Northern. La PCR proporciona a estas técnicas grandes cantidades de ADN puro, a veces como una sola hebra, lo que permite el análisis incluso a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida.
  • La tarea de secuencia ADN también puede ser asistido por PCR. Los segmentos conocidos de ADN se pueden producir fácilmente a partir de un paciente con una mutación de enfermedad genética. Las modificaciones a la técnica de amplificación pueden extraer segmentos de un genoma completamente desconocido o pueden generar solo una sola hebra de un área de interés.
  • La PCR tiene numerosas aplicaciones al proceso más tradicional de Clonación de ADN. Puede extraer segmentos para insertarlos en un vector de un genoma más grande, que puede que solo esté disponible en pequeñas cantidades. Utilizando un único conjunto de 'cebadores vectoriales', también puede analizar o extraer fragmentos que ya se han insertado en vectores. Algunas alteraciones del protocolo de PCR pueden generar mutaciones (general o dirigido al sitio) de un fragmento insertado.
  • Sitios etiquetados en secuencia es un proceso en el que la PCR se utiliza como indicador de que un segmento particular de un genoma está presente en un clon particular. El Proyecto Genoma Humano encontró esta aplicación vital para mapear los clones de cósmidos que estaban secuenciando y para coordinar los resultados de diferentes laboratorios.
  • Una aplicación de la PCR es el análisis filogenético del ADN de fuentes antiguas, como el que se encuentra en los huesos recuperados de los neandertales, en los tejidos congelados de los mamuts o en el cerebro de las momias egipcias. [15] En algunos casos, el ADN altamente degradado de estas fuentes puede reensamblarse durante las primeras etapas de amplificación.
  • Una aplicación común de la PCR es el estudio de patrones de la expresion genica. Los tejidos (o incluso las células individuales) se pueden analizar en diferentes etapas para ver qué genes se han activado o cuáles se han desactivado. Esta aplicación también puede usar PCR cuantitativa para cuantificar los niveles reales de expresión.
  • La capacidad de la PCR para amplificar simultáneamente varios loci de espermatozoides individuales [40] ha mejorado enormemente la tarea más tradicional de mapeo genético mediante el estudio de los cruces cromosómicos después de la meiosis. Se han observado directamente eventos de cruce raros entre loci muy cercanos mediante el análisis de miles de espermatozoides individuales. Del mismo modo, se pueden analizar deleciones, inserciones, translocaciones o inversiones inusuales, todo sin tener que esperar (o pagar) los largos y laboriosos procesos de fertilización, embriogénesis, etc.: la PCR se puede utilizar para crear genes mutantes con mutaciones elegidas por científicos a voluntad. Estas mutaciones se pueden elegir para comprender cómo las proteínas cumplen sus funciones y para cambiar o mejorar la función de las proteínas.

La PCR tiene varias ventajas. Es bastante simple de entender y usar, y produce resultados rápidamente. La técnica es muy sensible y tiene el potencial de producir de millones a miles de millones de copias de un producto específico para secuenciación, clonación y análisis. La qRT-PCR comparte las mismas ventajas que la PCR, con una ventaja adicional de cuantificación del producto sintetizado. Por tanto, tiene su utilidad para analizar alteraciones de los niveles de expresión génica en tumores, microbios u otros estados patológicos. [24]

La PCR es una herramienta de investigación muy poderosa y práctica. La secuenciación de etiologías desconocidas de muchas enfermedades se está descubriendo mediante la PCR. La técnica puede ayudar a identificar la secuencia de virus previamente desconocidos relacionados con los ya conocidos y así darnos una mejor comprensión de la enfermedad en sí. Si el procedimiento se puede simplificar aún más y se pueden desarrollar sistemas de detección no radiométricos sensibles, la PCR ocupará un lugar destacado en el laboratorio clínico durante los próximos años. [15]

Una limitación importante de la PCR es que se necesita información previa sobre la secuencia diana para generar los cebadores que permitan su amplificación selectiva. [24] Esto significa que, por lo general, los usuarios de PCR deben conocer la secuencia o secuencias precisas aguas arriba de la región objetivo en cada una de las dos plantillas monocatenarias para garantizar que la ADN polimerasa se una correctamente a los híbridos cebador-plantilla y posteriormente genera toda la región diana durante la síntesis de ADN.

Como todas las enzimas, las ADN polimerasas también son propensas a errores, lo que a su vez provoca mutaciones en los fragmentos de PCR que se generan. [41]

Otra limitación de la PCR es que incluso la cantidad más pequeña de ADN contaminante puede amplificarse, lo que da lugar a resultados engañosos o ambiguos. Para minimizar la posibilidad de contaminación, los investigadores deben reservar salas separadas para la preparación de reactivos, la PCR y el análisis del producto. Los reactivos deben dispensarse en alícuotas de un solo uso. Deben utilizarse de forma habitual pipetas con émbolos desechables y puntas de pipeta extralargas. [15]

Las muestras ambientales que contienen ácidos húmicos pueden inhibir la amplificación por PCR y dar lugar a resultados inexactos.

  • PCR específica de alelos: una técnica de diagnóstico o clonación basada en variaciones de un solo nucleótido (SNV que no deben confundirse con SNP) (diferencias de una sola base en un paciente). Requiere conocimiento previo de una secuencia de ADN, incluidas las diferencias entre alelos, y utiliza cebadores cuyos extremos 3 'abarcan el SNV (el búfer de pares de bases alrededor del SNV generalmente se incorpora). La amplificación por PCR en condiciones rigurosas es mucho menos eficaz en presencia de un desajuste entre el molde y el cebador, por lo que la amplificación exitosa con un cebador específico de SNP señala la presencia del SNP específico en una secuencia. [42] Consulte Genotipado de SNP para obtener más información.
  • PCR de montaje o Conjunto de ciclo de polimerasa (PCA): síntesis artificial de secuencias largas de ADN mediante la realización de PCR en un conjunto de oligonucleótidos largos con segmentos cortos superpuestos. Los oligonucleótidos alternan entre las direcciones sentido y antisentido, y los segmentos superpuestos determinan el orden de los fragmentos de PCR, produciendo así selectivamente el producto final de ADN largo. [43]
  • PCR asimétrica: amplifica preferentemente una hebra de ADN en una plantilla de ADN de doble hebra. Se utiliza en el sondaje de secuenciación e hibridación donde se requiere la amplificación de solo una de las dos hebras complementarias. La PCR se lleva a cabo como de costumbre, pero con un gran exceso de cebador para la hebra destinada a la amplificación. Debido a la amplificación lenta (aritmética) más adelante en la reacción después de que se haya agotado el cebador limitante, se requieren ciclos adicionales de PCR. [44] Una modificación reciente de este proceso, conocida como Len el oido-AdespuesTél-mixponencial-PCR (LATE-PCR), utiliza un cebador limitante con una temperatura de fusión más alta (Tmetro) que el cebador en exceso para mantener la eficacia de la reacción, ya que la concentración de cebador limitante disminuye a mitad de la reacción. [45]
  • PCR convectiva: una forma pseudoisotérmica de realizar PCR. En lugar de calentar y enfriar repetidamente la mezcla de PCR, la solución se somete a un gradiente térmico. El flujo convectivo impulsado por la inestabilidad térmica resultante baraja automáticamente los reactivos de PCR de las regiones frías y calientes, lo que habilita repetidamente la PCR. [46] Parámetros como las condiciones de los límites térmicos y la geometría del recinto de la PCR se pueden optimizar para producir una PCR robusta y rápida aprovechando la aparición de campos de flujo caóticos.[47] Tal configuración de PCR de flujo convectivo reduce significativamente el requerimiento de energía del dispositivo y el tiempo de operación.
  • PCR de marcación externa: un método muy paralelo para recuperar moléculas de ADN precisas para la síntesis de genes. Una biblioteca compleja de moléculas de ADN se modifica con etiquetas flanqueantes únicas antes de la secuenciación masivamente paralela. A continuación, los cebadores dirigidos por etiquetas permiten la recuperación de moléculas con las secuencias deseadas mediante PCR. [48]
  • PCR digital (dPCR): se utiliza para medir la cantidad de una secuencia de ADN diana en una muestra de ADN. La muestra de ADN está muy diluida, de modo que después de ejecutar muchas PCR en paralelo, algunas de ellas no reciben una sola molécula del ADN diana. La concentración de ADN objetivo se calcula utilizando la proporción de resultados negativos. De ahí el nombre de "PCR digital".
  • Amplificación dependiente de helicasa: similar a la PCR tradicional, pero utiliza una temperatura constante en lugar de ciclar a través de ciclos de desnaturalización y recocido / extensión. La ADN helicasa, una enzima que desenrolla el ADN, se usa en lugar de la desnaturalización térmica. [49]
  • PCR de arranque en caliente: técnica que reduce la amplificación inespecífica durante las etapas iniciales de preparación de la PCR. Puede realizarse manualmente calentando los componentes de reacción a la temperatura de desnaturalización (por ejemplo, 95 ° C) antes de agregar la polimerasa. [50] Se han desarrollado sistemas enzimáticos especializados que inhiben la actividad de la polimerasa a temperatura ambiente, ya sea por la unión de un anticuerpo [12] [51] o por la presencia de inhibidores unidos covalentemente que se disocian solo después de un paso de activación a alta temperatura. La PCR de inicio en caliente / acabado en frío se logra con nuevas polimerasas híbridas que están inactivas a temperatura ambiente y se activan instantáneamente a la temperatura de alargamiento.
  • PCR in silico (PCR digital, PCR virtual, PCR electrónica, e-PCR) se refiere a herramientas computacionales que se utilizan para calcular los resultados teóricos de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando un conjunto determinado de cebadores (sondas) para amplificar secuencias de ADN de un genoma o transcriptoma secuenciado. La PCR in silico se propuso como una herramienta educativa para la biología molecular. [52]
  • PCR específica de la intersecuencia (ISSR): un método de PCR para la toma de huellas dactilares de ADN que amplifica regiones entre repeticiones de secuencias simples para producir una huella dactilar única de longitudes de fragmentos amplificados. [53]
  • PCR inversa: se utiliza comúnmente para identificar las secuencias flanqueantes alrededor de los insertos genómicos. Implica una serie de digestiones de ADN y autoligado, lo que da como resultado secuencias conocidas en cada extremo de la secuencia desconocida. [54]
  • PCR mediada por ligadura: utiliza pequeños enlazadores de ADN ligados al ADN de interés y múltiples cebadores que se hibridan con los enlazadores de ADN. Se ha utilizado para la secuenciación del ADN, el recorrido del genoma y la huella del ADN. [55]
  • PCR específica de metilación (MSP): desarrollado por Stephen Baylin y James G. Herman en la Escuela de Medicina Johns Hopkins, [56] y se utiliza para detectar la metilación de islas CpG en el ADN genómico. El ADN se trata primero con bisulfito de sodio, que convierte las bases de citosina no metiladas en uracilo, que los cebadores de PCR reconocen como timina. A continuación, se llevan a cabo dos PCR en el ADN modificado, utilizando conjuntos de cebadores idénticos excepto en cualquier isla CpG dentro de las secuencias de cebadores. En estos puntos, un conjunto de cebadores reconoce el ADN con citosinas para amplificar el ADN metilado y un conjunto reconoce el ADN con uracilo o timina para amplificar el ADN no metilado. La MSP usando qPCR también se puede realizar para obtener información cuantitativa en lugar de cualitativa acerca de la metilación.
  • PCR con miniprimer: utiliza una polimerasa termoestable (S-Tbr) que puede extenderse desde cebadores cortos ("smalligos") tan cortos como 9 o 10 nucleótidos. Este método permite que la PCR se dirija a regiones de unión de cebadores más pequeñas y se usa para amplificar secuencias de ADN conservadas, como el gen de ARNr 16S (o 18S eucariota). [57]
  • Amplificación de sonda dependiente de la ligadura multiplex (MLPA): permite amplificar múltiples dianas con un solo par de cebadores, evitando así las limitaciones de resolución de la PCR multiplex (ver más abajo).
  • PCR múltiple: consta de varios conjuntos de cebadores dentro de una única mezcla de PCR para producir amplicones de diferentes tamaños que son específicos para diferentes secuencias de ADN. Al apuntar a múltiples genes a la vez, se puede obtener información adicional de una sola prueba que de otra manera requeriría varias veces los reactivos y más tiempo para funcionar. Las temperaturas de recocido para cada uno de los conjuntos de cebadores deben optimizarse para que funcionen correctamente dentro de una única reacción y tamaños de amplicón. Es decir, la longitud de su par de bases debe ser lo suficientemente diferente para formar bandas distintas cuando se visualiza mediante electroforesis en gel.
  • PCR asistida por nanopartículas (nanoPCR): algunas nanopartículas (NP) pueden mejorar la eficiencia de la PCR (por lo que se denominan nanoPCR), y algunas incluso pueden superar a los potenciadores de PCR originales. Se informó que los puntos cuánticos (QD) pueden mejorar la especificidad y la eficiencia de la PCR. Los nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT) y los nanotubos de carbono de paredes múltiples (MWCNT) son eficientes para mejorar la amplificación de la PCR larga. El nanopolvo de carbono (CNP) puede mejorar la eficiencia de la PCR repetida y la PCR larga, mientras que se descubrió que el óxido de zinc, el dióxido de titanio y las NP de Ag aumentan el rendimiento de la PCR. Los datos anteriores indicaron que los NP no metálicos conservaban una fidelidad de amplificación aceptable. Dado que muchas NP son capaces de mejorar la eficiencia de la PCR, está claro que es probable que exista un gran potencial para las mejoras de la tecnología nanoPCR y el desarrollo de productos. [58] [59]
  • PCR anidado: aumenta la especificidad de la amplificación del ADN, al reducir el fondo debido a la amplificación no específica del ADN. Se utilizan dos conjuntos de cebadores en dos PCR sucesivas. En la primera reacción, se usa un par de cebadores para generar productos de ADN, que además de la diana pretendida, aún pueden consistir en fragmentos de ADN amplificados no específicamente. A continuación, el producto o los productos se utilizan en una segunda PCR con un conjunto de cebadores cuyos sitios de unión son total o parcialmente diferentes y están ubicados en 3 'de cada uno de los cebadores usados ​​en la primera reacción. La PCR anidada suele tener más éxito en la amplificación específica de fragmentos largos de ADN que la PCR convencional, pero requiere un conocimiento más detallado de las secuencias diana.
  • PCR de superposición-extensión o Empalme por extensión de superposición (SOEing) : técnica de ingeniería genética que se utiliza para unir dos o más fragmentos de ADN que contienen secuencias complementarias. Se utiliza para unir piezas de ADN que contienen genes, secuencias reguladoras o mutaciones, la técnica permite la creación de construcciones de ADN específicas y largas. También puede introducir deleciones, inserciones o mutaciones puntuales en una secuencia de ADN. [60] [61]
  • PAN-AC: utiliza condiciones isotérmicas para la amplificación y puede utilizarse en células vivas. [62] [63]
  • PCR cuantitativa (qPCR): se utiliza para medir la cantidad de una secuencia objetivo (comúnmente en tiempo real). Mide cuantitativamente las cantidades iniciales de ADN, ADNc o ARN. La PCR cuantitativa se usa comúnmente para determinar si una secuencia de ADN está presente en una muestra y el número de sus copias en la muestra. PCR cuantitativa tiene un grado de precisión muy alto. Los métodos de PCR cuantitativa utilizan tintes fluorescentes, como Sybr Green, EvaGreen o sondas de ADN que contienen fluoróforos, como TaqMan, para medir la cantidad de producto amplificado en tiempo real. A veces también se abrevia como RT-PCR (tiempo real PCR), pero esta abreviatura debe usarse solo para PCR de transcripción inversa. qPCR son las contracciones adecuadas para la PCR cuantitativa (PCR en tiempo real).
  • PCR de complemento inverso (RC-PCR): permite que la adición de dominios funcionales o secuencias de elección se agreguen de forma independiente a cualquier extremo del amplicón generado en una única reacción de tubo cerrado. Este método genera cebadores específicos de la diana dentro de la reacción mediante la interacción de cebadores universales (que contienen las secuencias o dominios deseados que se van a agregar) y sondas RC.
  • PCR de transcripción inversa (RT-PCR): para amplificar ADN a partir de ARN. La transcriptasa inversa transcribe inversamente el ARN en ADNc, que luego se amplifica mediante PCR. La RT-PCR se usa ampliamente en la elaboración de perfiles de expresión, para determinar la expresión de un gen o para identificar la secuencia de una transcripción de ARN, incluidos los sitios de inicio y terminación de la transcripción. Si se conoce la secuencia de ADN genómico de un gen, se puede usar RT-PCR para mapear la ubicación de exones e intrones en el gen. El extremo 5 'de un gen (correspondiente al sitio de inicio de la transcripción) se identifica típicamente mediante RACE-PCR (Amplificación rápida de extremos de ADNc).
  • PCR dependiente de RNasa H (rhPCR): una modificación de la PCR que utiliza cebadores con un bloque de extensión de 3 'que puede eliminarse mediante una enzima RNasa HII termoestable. Este sistema reduce los dímeros de los cebadores y permite que se realicen reacciones multiplexadas con un mayor número de cebadores. [64]
  • Primer-PCR específico único (SSP-PCR): permite la amplificación de ADN bicatenario incluso cuando la información de la secuencia está disponible en un solo extremo. Este método permite la amplificación de genes para los que sólo está disponible una información de secuencia parcial, y permite que el genoma unidireccional camine desde las regiones conocidas del cromosoma hasta las desconocidas. [sesenta y cinco]
  • PCR en fase sólida: abarca varios significados, incluida la amplificación polony (donde las colonias de PCR se derivan en una matriz de gel, por ejemplo), la PCR puente [66] (los cebadores se unen covalentemente a una superficie de soporte sólido), la PCR en fase sólida convencional (donde la PCR asimétrica es aplicada en presencia de un cebador portador de soporte sólido con una secuencia que coincida con uno de los cebadores acuosos) y PCR en fase sólida mejorada [67] (donde la PCR en fase sólida convencional se puede mejorar empleando una Tm alta y un cebador de soporte sólido anidado con la aplicación opcional de un 'escalón' para favorecer la imprimación del soporte sólido).
  • PCR suicida: utilizado normalmente en paleogenética u otros estudios donde evitar falsos positivos y garantizar la especificidad del fragmento amplificado es la máxima prioridad. Originalmente se describió en un estudio para verificar la presencia del microbio Yersinia pestis en muestras dentales obtenidas de tumbas del siglo XIV de personas supuestamente muertas por la peste durante la epidemia medieval de peste negra. [68] El método prescribe el uso de cualquier combinación de cebadores solo una vez en una PCR (de ahí el término "suicidio"), que nunca debería haberse utilizado en ninguna reacción de PCR de control positivo, y los cebadores siempre deberían apuntar a una región genómica nunca amplificada antes en el laboratorio utilizando este o cualquier otro conjunto de cebadores. Esto asegura que no haya ADN contaminante de reacciones de PCR anteriores en el laboratorio, lo que de otro modo podría generar falsos positivos.
  • PCR entrelazada asimétrica térmica (TAIL-PCR): para el aislamiento de una secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida. Dentro de la secuencia conocida, TAIL-PCR usa un par anidado de cebadores con diferentes temperaturas de apareamiento, se usa un cebador degenerado para amplificar en la otra dirección de la secuencia desconocida. [69]
  • PCR de contacto (PCR descendente): una variante de la PCR que tiene como objetivo reducir el fondo inespecífico mediante la reducción gradual de la temperatura de hibridación a medida que avanza el ciclo de la PCR. La temperatura de recocido en los ciclos iniciales suele ser unos pocos grados (3-5 ° C) por encima de la Tmetro de los cebadores utilizados, mientras que en los ciclos posteriores, está unos grados (3-5 ° C) por debajo del cebador Tmetro. Las temperaturas más altas dan una mayor especificidad para la unión del cebador y las temperaturas más bajas permiten una amplificación más eficiente de los productos específicos formados durante los ciclos iniciales. [70]
  • Caminata rápida universal: para el recorrido del genoma y la toma de huellas dactilares genéticas utilizando una PCR de "dos caras" más específica que los enfoques convencionales de "una cara" (utilizando solo un cebador específico de gen y un cebador general, lo que puede provocar "ruido" artificial) [71] en virtud de un mecanismo que implica la formación de estructuras de lazo. Los derivados simplificados de UFW son LaNe RAGE (PCR anidada dependiente de lariat para la amplificación rápida de los extremos del ADN genómico), [72] 5'RACE LaNe [73] y 3'RACE LaNe. [74]

Las enzimas resistentes al calor que son un componente clave en la reacción en cadena de la polimerasa se descubrieron en la década de 1960 como producto de una forma de vida microbiana que vivía en las aguas sobrecalentadas del Mushroom Spring de Yellowstone. [75]

Un artículo de 1971 en el Revista de biología molecular por Kjell Kleppe y colaboradores en el laboratorio de H. Gobind Khorana describió por primera vez un método de uso de un ensayo enzimático para replicar una plantilla de ADN corta con cebadores in vitro. [76] Sin embargo, esta manifestación temprana del principio básico de PCR no recibió mucha atención en ese momento y la invención de la reacción en cadena de la polimerasa en 1983 generalmente se le atribuye a Kary Mullis. [77]

Cuando Mullis desarrolló la PCR en 1983, estaba trabajando en Emeryville, California para Cetus Corporation, una de las primeras empresas de biotecnología, donde era responsable de sintetizar cadenas cortas de ADN. Mullis ha escrito que concibió la idea de PCR mientras navegaba por la Pacific Coast Highway una noche en su automóvil. [78] Estaba jugando mentalmente con una nueva forma de analizar cambios (mutaciones) en el ADN cuando se dio cuenta de que, en cambio, había inventado un método para amplificar cualquier región de ADN a través de ciclos repetidos de duplicación impulsados ​​por la ADN polimerasa. En Científico americano, Mullis resumió el procedimiento: "Comenzando con una sola molécula del material genético ADN, la PCR puede generar 100 mil millones de moléculas similares en una tarde. La reacción es fácil de ejecutar. No requiere más que un tubo de ensayo, unos pocos reactivos simples y una fuente de calor ". [79] Las huellas dactilares de ADN se utilizaron por primera vez para las pruebas de paternidad en 1988. [80]

Mullis y el profesor Michael Smith, que habían desarrollado otras formas esenciales de manipular el ADN, [81] recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Química en 1993, siete años después de que Mullis y sus colegas de Cetus pusieran en práctica su propuesta por primera vez. [82] El artículo de 1985 de Mullis con RK Saiki y HA Erlich, "Amplificación enzimática de secuencias genómicas de β-globina y análisis de sitios de restricción para el diagnóstico de anemia de células falciformes", la invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), fue galardonada con una Citación para Premio Breakthrough de la División de Historia de la Química de la Sociedad Química Estadounidense en 2017. [83] [1]

En el núcleo del método de PCR se encuentra el uso de una ADN polimerasa adecuada capaz de soportar las altas temperaturas de & gt90 ° C (194 ° F) requeridas para la separación de las dos cadenas de ADN en la doble hélice de ADN después de cada ciclo de replicación. Las ADN polimerasas empleadas inicialmente para experimentos in vitro que presagian PCR fueron incapaces de soportar estas altas temperaturas. [1] Así que los primeros procedimientos para la replicación del ADN eran muy ineficientes y consumían mucho tiempo, y requerían grandes cantidades de ADN polimerasa y un manejo continuo durante todo el proceso.

El descubrimiento en 1976 de Taq polimerasa: una ADN polimerasa purificada de la bacteria termófila, Thermus aquaticus, que vive naturalmente en ambientes cálidos (50 a 80 ° C (122 a 176 ° F)) [13] como las aguas termales, allanó el camino para mejoras dramáticas del método de PCR. La ADN polimerasa aislada de T. aquaticus es estable a altas temperaturas y permanece activo incluso después de la desnaturalización del ADN, [14] obviando así la necesidad de agregar nueva ADN polimerasa después de cada ciclo. [2] Esto permitió un proceso automatizado basado en termocicladores para la amplificación del ADN.

Disputas de patentes Editar

La técnica de PCR fue patentada por Kary Mullis y asignada a Cetus Corporation, donde Mullis trabajaba cuando inventó la técnica en 1983. La Taq La enzima polimerasa también estaba cubierta por patentes. Ha habido varias demandas de alto perfil relacionadas con la técnica, incluida una demanda fallida presentada por DuPont. La empresa farmacéutica suiza Hoffmann-La Roche compró los derechos de las patentes en 1992 y actualmente [ ¿Cuándo? ] contiene los que todavía están protegidos.

Una batalla de patentes relacionada Taq La enzima polimerasa todavía está en curso en varias jurisdicciones de todo el mundo entre Roche y Promega. Los argumentos legales se han extendido más allá de la vida del PCR original y Taq patentes de polimerasa, que expiraron el 28 de marzo de 2005. [84]


ADN y ARN (con diagrama)

Watson y Crick (1953) han propuesto un modelo para la estructura de la molécula de ADN que ahora es aceptado por todos. De acuerdo con este modelo llamado Watson Crick Model, la molécula de ADN es una estructura doble he & shylix que consta de dos largas cadenas de polinucleótidos enrolladas una alrededor de la otra alrededor de un eje imaginario y que corren opuestas entre sí. (Figura 9.14).

Cada cadena de polinucleótidos consta de miles de unidades de nucleótidos.

La columna vertebral de las dos hélices de la cadena de polinucleótidos consta de fosfatos de desoxirribosa, mientras que las bases están presentes en los lados internos.

Las bases de una cadena polinucleotídica son complementarias a las bases de la otra cadena polinucleotídica y están unidas por enlaces de hidrógeno (fig. 9.16).

El emparejamiento de bases es muy específico (Fig 9.15), Las bases complementarias son: -

La proporción de bases de purina y pirimidina es 1: 1.

La distancia entre dos pares de bases subsiguientes en la cadena de polinucleótidos es 3,4 Å.

Cada vuelta de las dos cadenas de polinucleótidos se completa después de 10 pares de bases, es decir, una distancia de 34 Å.

La distancia entre el eje y la región de fosfato de azúcar es de aproximadamente 10 Å. El arrollamiento helicoidal es para diestros.

(1. Las moléculas de D.N.A. son gigantes. Sus pesos moleculares están en la región de varios millones. 2. En algunos bacteriófagos, es decir, los virus que atacan a las bacterias, el ADN es monocatenario).

Hay diferentes formas de ADN en los organismos vivos, a saber, A, B, C, y rara vez D y E. En todas estas formas, el enrollamiento helicoidal de la molécula de ADN es hacia la derecha. Estas formas difieren en el número de pares de bases (pb) por vuelta, el diámetro de la hélice y otros detalles menores similares. La forma más común y habitual de ADN que se encuentra en los organismos vivos es la forma B, que se denomina B-ADN. El relato anterior de la estructura del ADN, de hecho, pertenece al B-ADN.

Recientemente, se ha sintetizado artificialmente otra forma de ADN en la que el enrollamiento helicoidal del ADN es a la izquierda y la cadena principal de fosfato de los polinucleótidos sigue un curso en zig-zag. Por lo tanto, esta forma de ADN se ha denominado Z-ADN. Algunas de las otras características importantes y tímidas de Z-DNA one: 1. Cada vuelta de las dos cadenas de polinucleótidos se completa después de 12 pares de bases, es decir, una distancia de aproximadamente 45 Å. 2. La distancia entre dos pares de bases subsiguientes es de 3,7 Å. 3.

La distancia entre el eje y el azúcar-fosfato es de 9 Å. 4. Las unidades alternativas de azúcar de desoxi-ribosa en la cadena de polinucleótidos tienen orientación inversa (una de tales unidades tiene el oxígeno etéreo y tímido mirando hacia arriba y la otra unidad posterior mirando hacia abajo).

Ácido nucleico ribosa (ARN):

El ARN es una estructura monocatenaria que consta de una sola cadena polinucleotídica. Si en algún momento las bases complementarias se acercan mucho entre sí, se establecen enlaces de hidrógeno entre ellas para dar a la cadena de polinucleótidos una apariencia helicoidal como el ADN.

El ARN consta de las siguientes bases:

La proporción de bases de purina y pirimidina no es 1: 1.

El azúcar pentosa es β-D-Ribosa.

El tamaño de la molécula de ARN es muy pequeño en comparación con la molécula de ADN. Peso molecular de ARN puede variar desde varios miles hasta algunos lakhs.

Hay 3 formas diferentes de ARN en las células vegetales:

Peso molecular de m-ARN es más alto entre los diferentes tipos de ARN que generalmente varían de 5 a 10 mil rupias. Estos constituyen el 5-10% del ARN total que tiene la célula.

El m-ARN se sintetiza en el nucleolo y, después de tomar información genética del ADN, ingresa al citoplasma y ayuda en la formación de una proteína específica. Los ARNm son de corta duración.

La secuencia de 3 bases de nucleótidos en la molécula de m-ARN constituye un codón. En realidad, la información genética obtenida del ADN está codificada en codones que son específicos (para de & shytails ver código genético).

(ii) ARN ribosómico (r-ARN):

El r-ARN se encuentra en el ribosoma que actúa como molde para la síntesis de proteínas. Es del tipo más estable y constituye aproximadamente el 80% del ARN total en la célula.

(iii) ARN de transferencia o soluble (t-ARN o s-ARN):

Las estructuras de muchas moléculas de t-ARN se conocen con bastante detalle. Estos son comparativamente muy pequeños con un peso molecular de alrededor de 25000. La estructura básica de todos los mol y shyecules de t-RNA está en el patrón de la hoja del trébol. El modelo de hoja de trébol de t-RNA se muestra en la figura 9.17.

Los t-RNA se encuentran en el citoplasma y constan de solo unas 80 bases. Éstos constituyen el 10-15% del ARN total en la célula.

Los t-RNA contienen muchas bases y nucleótidos inusuales. Estos son, por ejemplo, pseudouridina (Ψ), dihidrouridina (DHU), inosina (I), etc. La metilación de bases también es común.

Todas las moléculas de t-RNA contienen guanina (G) en el extremo 5 & # 8242. El extremo 3 & # 8242 siempre termina en la secuencia de bases Citosina-Citosina-Adenina (CCA). Durante la síntesis de proteínas, este extremo recoge el aminoácido y lo transfiere a la cadena polipeptídica en crecimiento y, por lo tanto, estos ARN se denominan t-ARN o ARN de transferencia.

Estos t-RNA también se denominan s-RNA o RNA solubles porque son solubles en IM NaCl.

Las moléculas de t-ARN se pliegan en un patrón de hoja de trébol con tres o más reyecciones helicoidales dobles (como el ADN) que terminan en bucles.

Tres bucles importantes de t-RNA son:

(ii) Bucle de unión de amino acil sintetasa

(iii) Bucle de unión ribosomal.

El bucle Anticodon consta de 7 bases. En el extremo libre, 3 bases no apareadas constituyen el anticodón que es complementario al codón en el m-ARN. El bucle de unión de la aminoacil sintetasa consta de 8-12 bases. Debido a la presencia de dihidrouridinas en este bucle, también se lo conoce como bucle DHU.

El bucle de unión ribosomal consta de 7 bases. En contiene la secuencia de GTΨC y, por lo tanto, también se denomina bucle GTΨC.

Existen diferentes moléculas de t-RNA con anticodones específicos para captar aminoácidos específicos. Sin embargo, muchos t-RNA pueden ser específicos de un aminoácido particular o una única especie de t-RNA puede reconocer varios aminoácidos.

La molécula de t-RNA cuya estructura fue dada por primera vez en detalle por Holley es alanil-t-RNA de levadura (fig. 9.18).


67 Estructura y secuenciación del ADN

Al final de esta sección, podrá hacer lo siguiente:

  • Describe la estructura del ADN.
  • Explica el método Sanger de secuenciación de ADN.
  • Discutir las similitudes y diferencias entre el ADN eucariota y procariota

Los componentes básicos del ADN son los nucleótidos. Los componentes importantes del nucleótido son una base nitrogenada (portadora de nitrógeno), un azúcar de 5 carbonos (pentosa) y un grupo fosfato ((Figura)). El nombre del nucleótido depende de la base nitrogenada. La base nitrogenada puede ser una purina como adenina (A) y guanina (G), o una pirimidina como citosina (C) y timina (T).


Las imágenes de arriba ilustran las cinco bases de ADN y ARN. Examine las imágenes y explique por qué se denominan "bases nitrogenadas". ¿En qué se diferencian las purinas de las pirimidinas? ¿En qué se diferencia una purina o pirimidina de otra, por ejemplo, adenina de guanina? ¿En qué se diferencia un nucleósido de un nucleótido?

Las purinas tienen una estructura de doble anillo con un anillo de seis miembros fusionado a un anillo de cinco miembros. Las pirimidinas son de tamaño más pequeño y tienen una estructura de anillo única de seis miembros.

El azúcar es desoxirribosa en el ADN y ribosa en el ARN. Los átomos de carbono del azúcar de cinco carbonos se numeran 1 & # 8242, 2 & # 8242, 3 & # 8242, 4 & # 8242, y 5 & # 8242 (1 & # 8242 se lee como "un primo"). El fosfato, que hace que el ADN y el ARN sean ácidos, se conecta al carbono 5 & # 8242 del azúcar mediante la formación de un enlace éster entre el ácido fosfórico y el grupo 5 & # 8242-OH (un éster es un ácido + un alcohol). En los nucleótidos de ADN, el carbono 3 & # 8242 del azúcar desoxirribosa está unido a un grupo hidroxilo (OH). En los nucleótidos de ARN, el carbono 2 & # 8242 de la ribosa del azúcar también contiene un grupo hidroxilo. La base está unida al carbono 1 & # 8217 del azúcar.

Los nucleótidos se combinan entre sí para producir enlaces fosfodiéster. El residuo de fosfato unido al carbono 5 & # 8242 del azúcar de un nucleótido forma un segundo enlace éster con el grupo hidroxilo del carbono 3 & # 8242 del azúcar del siguiente nucleótido, formando así un fosfodiéster 5 & # 8242-3 & # 8242 vínculo. En un polinucleótido, un extremo de la cadena tiene un fosfato 5 & # 8242 libre y el otro extremo tiene un 3 & # 8242-OH libre. Estos se denominan extremos 5 & # 8242 y 3 & # 8242 de la cadena.

En la década de 1950, Francis Crick y James Watson trabajaron juntos para determinar la estructura del ADN en la Universidad de Cambridge, Inglaterra. Otros científicos como Linus Pauling y Maurice Wilkins también estaban explorando activamente este campo. Pauling había descubierto previamente la estructura secundaria de las proteínas mediante cristalografía de rayos X. En el laboratorio de Wilkins, la investigadora Rosalind Franklin estaba usando métodos de difracción de rayos X para comprender la estructura del ADN. Watson y Crick pudieron armar el rompecabezas de la molécula de ADN sobre la base de los datos de Franklin & # 8217 porque Crick también había estudiado la difracción de rayos X ((Figura)). En 1962, James Watson, Francis Crick y Maurice Wilkins recibieron el Premio Nobel de Medicina. Desafortunadamente, para entonces Franklin había muerto y los premios Nobel no se otorgan póstumamente.


Watson y Crick propusieron que el ADN está formado por dos hebras que se retuercen entre sí para formar una hélice a la derecha. El emparejamiento de bases tiene lugar entre una purina y pirimidina en hebras opuestas, de modo que A se empareja con T y G se empareja con C (sugerido por Chargaff & # 8217s Rules). Por tanto, la adenina y la timina son pares de bases complementarios, y la citosina y la guanina también son pares de bases complementarios. Los pares de bases están estabilizados por enlaces de hidrógeno: la adenina y la timina forman dos enlaces de hidrógeno y la citosina y la guanina forman tres enlaces de hidrógeno. Las dos hebras son de naturaleza antiparalela, es decir, el extremo 3 y # 8242 de una hebra se enfrenta al extremo 5 y # 8242 de la otra hebra. El azúcar y el fosfato de los nucleótidos forman la columna vertebral de la estructura, mientras que las bases nitrogenadas se apilan en el interior, como los peldaños de una escalera. Cada par de bases está separado del siguiente par de bases por una distancia de 0,34 nm, y cada vuelta de la hélice mide 3,4 nm. Por lo tanto, están presentes 10 pares de bases por vuelta de la hélice. El diámetro de la doble hélice del ADN es de 2 nm y es uniforme en toda su extensión. Solo el emparejamiento entre una purina y pirimidina y la orientación antiparalela de las dos cadenas de ADN pueden explicar el diámetro uniforme. La torsión de las dos hebras entre sí da como resultado la formación de ranuras mayores y menores uniformemente espaciadas ((Figura)).


Técnicas de secuenciación de ADN

Hasta la década de 1990, la secuenciación del ADN (leer la secuencia del ADN) era un proceso relativamente costoso y largo. El uso de nucleótidos radiomarcados también agravó el problema por motivos de seguridad. Con la tecnología disponible actualmente y las máquinas automatizadas, el proceso es más barato, más seguro y se puede completar en cuestión de horas. Fred Sanger desarrolló el método de secuenciación utilizado para el proyecto de secuenciación del genoma humano, que se utiliza ampliamente en la actualidad ((Figura)).

Visite este sitio para ver un video que explica la técnica de lectura de secuencias de ADN que resultó del trabajo de Sanger.

La secuenciación
El método se conoce como método de terminación de cadena didesoxi. El método se basa en el uso de terminadores de cadena, los didesoxinucleótidos (ddNTP). Los ddNTPS se diferencian de los desoxinucleótidos por la falta de un grupo OH 3 & # 8242 libre en el azúcar de cinco carbonos. Si se agrega un ddNTP a una cadena de ADN en crecimiento, la cadena no se puede extender más porque el grupo OH 3 & # 8242 libre necesario para agregar otro nucleótido no está disponible. Usando una proporción predeterminada de desoxirribonucleótidos a didesoxinucleótidos, es posible generar fragmentos de ADN de diferentes tamaños.


La muestra de ADN que se va a secuenciar se desnaturaliza (se separa en dos hebras calentándola a altas temperaturas). El ADN se divide en cuatro tubos en los que se añaden un cebador, la ADN polimerasa y los cuatro nucleósidos trifosfatos (A, T, G y C). Además, se añaden cantidades limitadas de uno de los cuatro trifosfatos de didesoxinucleósido (ddCTP, ddATP, ddGTP y ddTTP) a cada tubo, respectivamente. Los tubos están etiquetados como A, T, G y C de acuerdo con el ddNTP agregado. Para fines de detección, cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos lleva una etiqueta fluorescente diferente. El alargamiento de la cadena continúa hasta que se incorpora un didesoxi nucleótido fluorescente, después de lo cual no tiene lugar ningún alargamiento adicional. Una vez finalizada la reacción, se realiza la electroforesis. Incluso se puede detectar una diferencia en la longitud de una sola base. La secuencia se lee en un escáner láser que detecta el marcador fluorescente de cada fragmento. Por su trabajo en la secuenciación del ADN, Sanger recibió un Premio Nobel de Química en 1980.

La secuenciación del genoma de Sanger ha llevado a una carrera para secuenciar genomas humanos a una velocidad rápida y a bajo costo, a menudo denominada secuencia de $ 1000 en un día. Obtenga más información seleccionando el Animación de secuenciación a velocidad aquí.

La electroforesis en gel es una técnica que se utiliza para separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños. Por lo general, el gel está hecho de una sustancia química llamada agarosa (un polímero de polisacárido extraído de algas marinas con alto contenido de residuos de galactosa). Se añade agarosa en polvo a un tampón y se calienta. Después de enfriar, la solución de gel se vierte en una bandeja de colada. Una vez que el gel se ha solidificado, el ADN se carga en el gel y se aplica corriente eléctrica. El ADN tiene una carga negativa neta y se mueve desde el electrodo negativo hacia el electrodo positivo. La corriente eléctrica se aplica durante el tiempo suficiente para permitir que el ADN se separe según el tamaño, los fragmentos más pequeños estarán más lejos del pozo (donde se cargó el ADN) y los fragmentos de peso molecular más pesado estarán más cerca del pozo. Una vez que se separa el ADN, el gel se tiñe con un tinte específico de ADN para verlo ((Figura)).


El primer borrador de secuencia del genoma neandertal fue publicado recientemente por Richard E. Green et al. en 2010. 1 Los neandertales son los antepasados ​​más cercanos de los humanos actuales. Se sabía que habían vivido en Europa y Asia occidental (y ahora, quizás, en el norte de África) antes de que desaparecieran de los registros fósiles hace aproximadamente 30.000 años. El equipo de Green estudió restos fósiles de casi 40.000 años que fueron seleccionados de sitios en todo el mundo. Se emplearon medios extremadamente sofisticados de preparación de muestras y secuenciación de ADN debido a la naturaleza frágil de los huesos y la fuerte contaminación microbiana. En su estudio, los científicos pudieron secuenciar unos cuatro mil millones de pares de bases. La secuencia neandertal se comparó con la de los humanos actuales de todo el mundo. Después de comparar las secuencias, los investigadores descubrieron que el genoma del neandertal tenía entre un 2 y un 3 por ciento más de similitud con las personas que vivían fuera de África que con las personas de África. Si bien las teorías actuales han sugerido que todos los humanos de hoy en día se pueden rastrear hasta una pequeña población ancestral en África, los datos del genoma neandertal sugieren cierto mestizaje entre los neandertales y los primeros humanos modernos.

Green y sus colegas también descubrieron segmentos de ADN entre personas en Europa y Asia que son más similares a las secuencias de Neandertal que a otras secuencias humanas contemporáneas. Otra observación interesante fue que los neandertales están tan estrechamente relacionados con la gente de Papúa Nueva Guinea como con los de China o Francia. Esto es sorprendente porque los restos fósiles de neandertales se han localizado solo en Europa y Asia occidental. Lo más probable es que el intercambio genético tuvo lugar entre los neandertales y los humanos modernos cuando los humanos modernos emergieron de África, antes de la divergencia de europeos, asiáticos orientales y Papúa Nueva Guinea.

Varios genes parecen haber sufrido cambios con respecto a los neandertales durante la evolución de los humanos actuales. Estos genes están involucrados en la estructura craneal, el metabolismo, la morfología de la piel y el desarrollo cognitivo. Uno de los genes de especial interés es RUNX2, que es diferente en los humanos y los neandertales de hoy en día. Este gen es responsable del hueso frontal prominente, la caja torácica en forma de campana y las diferencias dentales que se observan en los neandertales. Se especula que un cambio evolutivo en RUNX2 fue importante en el origen de los seres humanos de hoy en día, y esto afectó el cráneo y la parte superior del cuerpo.

Vea la charla de Svante Pääbo que explica la investigación del genoma neandertal en la conferencia anual TED (Tecnología, Entretenimiento, Diseño) de 2011.

Empaquetado de ADN en células

Los procariotas son mucho más simples que los eucariotas en muchas de sus características ((Figura)). La mayoría de los procariotas contienen un cromosoma circular único que se encuentra en un área del citoplasma llamada región nucleoide.


En las células eucariotas, la síntesis de ADN y ARN se produce en un compartimento separado de la síntesis de proteínas. En las células procariotas, ambos procesos ocurren juntos. ¿Qué ventajas podría tener separar los procesos? ¿Qué ventajas podría tener que ocurran juntos?

El tamaño del genoma en uno de los procariotas mejor estudiados, E. coli, es de 4,6 millones de pares de bases (aproximadamente 1,1 mm, si se corta y se estira). Entonces, ¿cómo encaja esto dentro de una pequeña célula bacteriana? El ADN se tuerce mediante lo que se conoce como superenrollamiento. El superenrollamiento sugiere que el ADN está "subenrollado" (menos de una vuelta de la hélice por cada 10 pares de bases) o "sobreenrollado" (más de 1 vuelta por cada 10 pares de bases) de su estado relajado normal. Se sabe que algunas proteínas están involucradas en el superenrollamiento de otras proteínas y enzimas como la ADN girasa ayudan a mantener la estructura superenrollada.

Los eucariotas, cuyos cromosomas consisten cada uno en una molécula de ADN lineal, emplean un tipo diferente de estrategia de empaquetamiento para encajar su ADN dentro del núcleo ((Figura)). En el nivel más básico, el ADN está envuelto alrededor de proteínas conocidas como histonas para formar estructuras llamadas nucleosomas. Las histonas son proteínas conservadas evolutivamente que son ricas en aminoácidos básicos y forman un octámero compuesto por dos moléculas de cada una de cuatro histonas diferentes. El ADN (recuerde, está cargado negativamente debido a los grupos fosfato) está envuelto firmemente alrededor del núcleo de histonas. Este nucleosoma se vincula al siguiente con la ayuda de un ADN enlazador. Esto también se conoce como estructura de “cuentas en una cuerda”. Con la ayuda de una quinta histona, una cadena de nucleosomas se compacta aún más en una fibra de 30 nm, que es el diámetro de la estructura. Los cromosomas en metafase se condensan aún más por asociación con proteínas de andamiaje. En la etapa de metafase, los cromosomas son más compactos, aproximadamente 700 nm de ancho.

En la interfase, los cromosomas eucariotas tienen dos regiones distintas que se pueden distinguir por tinción. La región compacta se conoce como heterocromatina y la región menos densa se conoce como eucromatina. La heterocromatina generalmente contiene genes que no se expresan y se encuentra en las regiones del centrómero y los telómeros. La eucromatina generalmente contiene genes que se transcriben, con ADN empaquetado alrededor de nucleosomas pero no más compactado.


Resumen de la sección

Watson y Crick propusieron el modelo actualmente aceptado de la estructura de doble hélice del ADN. Algunas de las características más destacadas son que las dos hebras que forman la doble hélice tienen secuencias de bases complementarias y orientaciones antiparalelas. La alternancia de azúcares desoxirribosa y fosfatos forman la columna vertebral de la estructura, y las bases nitrogenadas se apilan como peldaños en el interior. El diámetro de la doble hélice, 2 nm, es uniforme en todas partes. Una purina siempre se empareja con una pirimidina. A se empareja con T y G se empareja con C. Una vuelta de la hélice tiene 10 pares de bases. Los procariotas son mucho más simples que los eucariotas en muchas de sus características. La mayoría de los procariotas contienen un cromosoma circular único. En general, los cromosomas eucariotas contienen una molécula de ADN lineal empaquetada en nucleosomas y tienen dos regiones distintas que se pueden distinguir por tinción, lo que refleja diferentes estados de empaquetamiento y compactación.

Preguntas de conexión visual

(Figura) En las células eucariotas, la síntesis de ADN y ARN se produce en un compartimento separado de la síntesis de proteínas. En las células procariotas, ambos procesos ocurren juntos. ¿Qué ventajas podría tener separar los procesos? ¿Qué ventajas podría tener que ocurran juntos?

(Figura) La compartimentación permite que una célula eucariota divida los procesos en pasos discretos para que pueda construir proteínas y productos de ARN más complejos. Pero también hay una ventaja en tener un solo compartimento: la síntesis de ARN y proteínas ocurre mucho más rápidamente en una célula procariota.

Preguntas de revisión

¿Cuál de los siguientes no tiene la doble hélice de ADN?

  1. configuración antiparalela
  2. maridaje de bases complementarias
  3. surcos mayores y menores
  4. uracilo

En eucariotas, ¿qué envuelve el ADN?

Preguntas de pensamiento crítico

Proporcione un breve resumen del método de secuenciación de Sanger.

La hebra de ADN molde se mezcla con una ADN polimerasa, un cebador, los 4 desoxinucleótidos y una concentración limitante de 4 didesoxinucleótidos. La ADN polimerasa sintetiza una hebra complementaria a la plantilla. La incorporación de ddNTP en diferentes ubicaciones da como resultado fragmentos de ADN que han terminado en todas las bases posibles de la plantilla. Estos fragmentos se separan mediante electroforesis en gel y se visualizan mediante un detector láser para determinar la secuencia de bases.

Describir la estructura y el apareamiento de bases complementarias del ADN.

El ADN tiene dos hebras en orientación antiparalela. Los enlaces azúcar-fosfato forman una columna vertebral en el exterior y las bases están emparejadas en el interior: A con T y G con C, como peldaños en una escalera de caracol.

Los procariotas tienen un solo cromosoma circular, mientras que los eucariotas tienen cromosomas lineales. Describa una ventaja y una desventaja del empaquetamiento del genoma eucariota en comparación con los procariotas.

Ventaja: la disposición lineal del cromosoma eucariota permite que se empaque más ADN al enrollarlo firmemente alrededor de las histonas. Más material genético significa que el organismo puede codificar más información en una sola célula.Esto eventualmente permitió que algunos eucariotas se convirtieran en organismos multicelulares con especialización celular.
Desventaja: Mantener más material genético requiere más energía e introduce la posibilidad de más errores (más complejidad).


Resultados

Línea de base y periodicidad

Las secuencias de ADN en los nucleosomas se caracterizan por distribuciones periódicas de frecuencia de dinucleótidos AA / TT de 10 pares de bases que se manifiestan más claramente en la levadura. En diversos grados también se observa en otros organismos modelo: humanos, ratones, gusanos [35] y moscas de la fruta [36]. Investigamos patrones formados por pares de dinucleótidos WW / SS y RR / YY y dinucleótidos individuales AA / TT / TA y CC / GG que transportan señales de posicionamiento de nucleosomas por sus arreglos periódicos. El análisis de frecuencia (transformada de Fourier) de los perfiles de dinucleótidos en NAC de cerebro de ratón mostró picos en un período base de 10,1-10,4 de acuerdo con la periodicidad anticipada de 10 pb. Las distribuciones de frecuencia de dinucleótidos en células de ratón y humanas tenían una línea de base ligeramente diferente posiblemente debido a las diferencias en el contenido de G + C en el genoma humano frente al de ratón (en los cromosomas principales de hg19, excluyendo el aleatorio, no mapeado, MT e Y, es 40,398% y en el ratón mm9 es 38,345% calculado con BEDTools nuc función). Observamos un patrón muy diferente de composición de la secuencia de nucleosomas en células apoptóticas en comparación con el patrón en células humanas normales y de ratón, lo que sugiere un mecanismo diferente basado en la secuencia que gobierna la dinámica de los nucleosomas en las células que experimentan apoptosis. Cómo se comparan los patrones en NAC de cerebro de ratón, CD4 + humano y células apoptóticas se muestra en la Sección 1 Figuras A-E en el Apéndice S2.

Comparación de patrones de ADN nucleosómico entre humanos y ratones

La similitud global y la diferencia entre los perfiles de frecuencia de dinucleótidos en diferentes condiciones se cuantificó calculando el coeficiente de correlación de Pearson entre los patrones por pares. La figura 1 muestra mapas de calor de magnitudes de correlación entre patrones de ADN nucleosómico de humanos y ratones y dendrogramas derivados de estas matrices de correlación.

Para cada dinucleótido compuesto (WW, SS, RR, YY) e individual (AA, TT, CC, GG) una similitud entre los patrones en células CD4 + humanas como cd4, células de linfocitos apoptóticos humanos como apo y células NAC de cerebros de ratón en control como con, resistente al estrés como res y susceptible al estrés como sus. La similitud se cuantifica mediante un coeficiente de correlación de Pearson, cuya magnitud se muestra en cada celda de la matriz de correlación. Se representan dos representaciones de similitud para cada dinucleótido: un mapa de calor en el que las celdas codificadas por colores muestran un coeficiente de correlación de Pearson entre dos perfiles y el color proporciona una dirección: el rojo es positivo, el azul es negativo. Los dendrogramas de similitud se calculan a partir de la matriz de correlación que se muestra en el mapa de calor e ilustran la agrupación jerárquica de enlaces completos de los patrones.

Los patrones en las células CD4 + humanas normales y la NAC del cerebro de ratón son sorprendentemente similares a pesar de que sus contextos experimentales y funcionales originales son muy diferentes. Por el contrario, los patrones en las células humanas apoptóticas eran muy diferentes de los de las células NAC de ratón y CD4 + humanas. Sin embargo, existe un alto grado de similitud entre los patrones apoptóticos y los patrones observados en la levadura [8]. Los patrones WW, AA y TT en NAC de ratón y células CD4 + humanas tienen correlaciones positivas significativas (& gt 0,8). Los patrones CC, GG y SS están menos correlacionados (& gt 0,49). En todos los casos, los patrones de dinucleótidos en células apoptóticas no tienen correlación o tienen una correlación negativa (WW es & lt −0,27 y SS es & lt −0,5) con los patrones en células CD4 + humanas y de ratón.

Picos de sincronización y preferencias posicionales

Las preferencias posicionales de los nucleosomas a algunas firmas de secuencia se manifiestan estadísticamente como picos de ciertos dinucleótidos en ciertas posiciones en los perfiles de frecuencia calculados a partir de un gran conjunto de secuencias alineadas de ADN nucleosómico. Observamos los máximos y mínimos (picos y valles) de los patrones de dinucleótidos AA / TT, CC / GG, WW / SS y RR / YY en células humanas y de ratón que se producen en una proximidad muy alta. Las posiciones en las que la mayoría de los dinucleótidos en secuencias de diferentes condiciones tienen picos bien definidos pueden indicar hubs que puede tener un significado especial en la dinámica de los nucleosomas. Para localizar las posiciones del eje, utilizamos perfiles de dinucleótidos transformados en una secuencia de indicador de unidad en la que un +1 especifica una posición de un máximo y un -1 especifica una posición de un mínimo y todas las demás posiciones tienen valores cero. Observamos que los picos en su mayoría co-ocurren a intervalos separados por un paso de 10 ± 1 pares de bases. Los sitios en el ADN nucleosómico en células humanas y de ratón fueron utilizados de manera diferente por los dinucleótidos. En células humanas, las posiciones de múltiples picos coincidentes a lo largo del ADN nucleosómico fueron ± 69, ± 47, ± 46, ± 43, ± 28, ± 23, ± 19, ± 13, ± 7. En células de ratón fueron: ± 64, ± 60, ± 44, ± 39, ± 16, ± 11. Los organismos humanos y de ratón también se diferenciaron por las identidades de los picos de dinucleótidos que ocurren simultáneamente.

Los dinucleótidos mutuamente excluyentes como WW y SS no pueden ocupar simultáneamente la misma posición. Sin embargo, observamos que los picos de CC y GG y los picos de TA e YY ocurren simultáneamente en el ratón. En las células CD4 + humanas, los picos que se produjeron simultáneamente fueron TA y GG y WW y SS. Esto significa que las secuencias analizadas de ADN nucleosómico contienen varias clases de patrones diferentes. El estudio de análisis de células individuales [2] mostró que en cualquier momento las células individuales están en estado binario: algunas tienen nucleosomas remodelados y otras no. Esto puede explicar la presencia de picos de dinucleótidos incompatibles en secuencias de ADN nucleosómico alineadas de la misma fuente. En las células humanas CD4 +, las secuencias de ADN nucleosómico formaron dos grupos distintos, cada uno de los cuales favorecía los patrones de WW o SS, como se mostró anteriormente [18]. los centro los sitios en los que la mayoría de los dinucleótidos (incluidos los incompatibles) tenían picos fueron ± 45, ± 31, ± 20. Estas centro los sitios se encuentran en ± 2, ± 3 y ± 4 ubicaciones superhelicales (SHL) en las que el ADN interactúa con el octámero de histonas en un proceso de remodelación que estabiliza o desestabiliza los nucleosomas [37]. Más detalles sobre la sincronización de picos, dinucleótidos y la centro Las posiciones se proporcionan en la Sección 2, Figuras F, G, H y Tabla A en el Apéndice S2.

Firmas estructurales de patrones de dinucleótidos en diversas condiciones

Investigamos más a fondo cómo los patrones de ADN nucleosómico en organismos superiores humanos y de ratón se comparan con los patrones bien establecidos [8] en el organismo de levadura unicelular. Como dimensión adicional a nuestra comparación, agregamos una distribución generalizada de ubicaciones superhelical. Cui y Zhurkin obtuvieron las SHL que comprenden surcos menores y mayores en el ADN nucleosómico a partir de ángulos de giro de las estructuras cristalinas de la partícula del núcleo del nucleosoma (NCP) ilustradas en la Fig. 3 en [10]. Superpusimos las distribuciones de los picos WW / SS, RR / YY, AA / TT / TA y CC / GG en tres organismos (levadura, ratón y humano) en un mapa de zonas SHL de la caricatura de la Fig. 3 en [10]. que corresponde a la mitad del ADN nucleosómico. En la figura 2 se muestra un diagrama de escalera codificado por colores de los picos WW / SS y RR / YY. Los escalones WW y SS y los escalones RR e YY se representan uno frente al otro para que sea más fácil ver un orden en la disposición de estos pasos.

Los diagramas de escalera representan la mitad del nucleosoma con una posición de díada en la parte inferior y avanzando desde la posición de -1 par de bases hasta el par de bases -72. Las posiciones correspondientes a las ranuras mayores se muestran en rojo y las menores son azules (como en el dibujo de la Fig. 3 en [10] etiquetado con números SHL). Los picos WW están codificados en verde, los SS en rojo, los RR están codificados en tonos magenta y YY en tonos naranjas. Cada pico indicado dentro de la célula está marcado con una letra que indica a qué organismo pertenece (H- para células CD4 + humanas, M- para NAC de ratón de control, Y levadura y A para células de linfocitos apoptóticos humanos). Los diagramas SS1 / WW1 y RR1 / YY1 muestran las distribuciones de picos en humanos y ratones. Los diagramas SS2 / WW2 y RR2 / YY2 muestran distribuciones de picos en levaduras y células apoptóticas humanas. Los números 1 y 2 designan estas clases de patrones separadas. Los diagramas de escalera ilustran una sincronización entre las ocurrencias pico. Los picos de WW en humanos y ratones tienen contrapartes de picos de SS en levaduras y células apoptóticas y viceversa. Los patrones RR1 / YY1 parecen ser muy regulares. El RR2 / YY2 tiene una apariencia menos regular en la que los picos se concentran principalmente en las zonas SHL ± 2.5, ± 3.5 y ± 4.5.

En las células CD4 + humanas y las células NAC de ratón, la mayoría de los sitios de los picos de WW coinciden y se encuentran en los surcos principales. Sin embargo, los picos de WW en levaduras y células apoptóticas humanas aparecen principalmente como opuestos con respecto al mismo pico en células CD4 + humanas y NAC de ratón. Los picos de WW en células CD4 + humanas y NAC de ratón se producen en zonas de surcos principales de SHL ± 6, ± 5, ± 4, ± 3, ± 2, pero las células apoptóticas humanas y de levadura tienen picos SS en estas zonas. Y lo contrario: las zonas ± 4.5 y ± 2.5 tienen picos SS en células CD4 + humanas y NAC de ratón, pero en levaduras y células apoptóticas humanas estas ubicaciones contienen picos WW. Los picos SS proximales a la díada en ± 1,5 ocurren solo en ratones. La mayoría de los picos de SS en ratones y humanos están separados por ± 1, ± 2 pares de bases, pero el pico de SS central en la díada coincide en ambos organismos. Generalmente, en todos los organismos los picos en la zona -1 de SHL tienen una magnitud menor. El ratón y el ser humano en la díada tienen picos SS y la levadura tiene picos SS y WW. Existen similitudes significativas de distribuciones de picos posicionales en células NAC de ratón y células CD4 + humanas normales. Sin embargo, la distribución posicional de los picos en las células apoptóticas humanas es significativamente diferente y se parece mucho a la distribución de los picos en la levadura.

Las distribuciones de los picos RR / YY tienen características similares en CD4 + humanos y ratones. Sin embargo, es diferente en las células de levadura y considerablemente diferente en las células apoptóticas humanas. El patrón RR2 / YY2 en levadura tiene picos RR (Purina-Purina) que ocurren en zonas menores de SHL que se intercambian con pasos YY (Pirimidina-Pirimidina) que ocurren en todas las zonas SHL, mientras que en células CD4 + humanas y NAC de ratón, los pasos RR e YY ocurren en zonas principales y están dispuestas muy próximas entre sí. El patrón RR2 / YY2 en células apoptóticas humanas tiene una estructura regular que es muy diferente de otros patrones. La configuración del patrón de WW / SS observada es un nucleosoma clásico que favorece la configuración de la secuencia [7, 8]. En cuanto a los patrones RR / YY observados, las estructuras de ADN que contienen estas configuraciones de dinucleótidos no persisten debido a la rigidez de los pasos de dinucleótidos RR e YY [8,38]. La localización del punto máximo en las zonas SHL difiere entre el ratón (control, ratones susceptibles y resistentes al estrés) y el ser humano (células CD4 + y apoptóticas). Todos los sitios que tenían uno o varios picos se contaron en cada zona SHL para el ratón y para el ser humano. La distribución de los recuentos se muestra en la Fig. 3. Las posiciones de los picos de todos los dinucleótidos en este estudio y sus zonas estructurales correspondientes se resumen en la Tabla 1 en la Tabla S1.

Las barras muestran el número de recuentos de sitios de pico a través de SHL en células de linfocitos apoptóticos y CD4 + humanos en comparación con los recuentos en NAC de ratón en ratones de control, susceptibles y resistentes al estrés.

Los recuentos de picos en SHL en humanos y ratones tuvieron una diferencia estadísticamente significativa (valor p de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon emparejados = 0,02). La zona SHL -1.5 tiene 4 sitios de pico en el ratón, pero en humanos tiene solo un sitio de pico en las células apoptóticas. Las zonas SHL ± 4, ± 4,5 y -3,5 en humanos tienen más sitios de pico en comparación con los ratones. En la zona SHL -6.5, solo el ratón susceptible al estrés tuvo un pico. Las zonas SHL ± 1,5, ± 4 y ± 4,5 que difieren entre humanos y ratones en términos de preferencias posicionales juegan un papel en la dinámica de los nucleosomas. La mayoría de las deformaciones del ADN tienen lugar en la zona SHL ± 1,5. Tiene una mayor unión de las proteínas del ADN y es más susceptible al daño del ADN [39]. Otras zonas importantes en las que se observaron múltiples picos de todos los organismos son las zonas SHL ± 2, ± 3 y ± 4. Las SHL ± 2, ± 3 son zonas en las que los remodeladores de cromatina interactúan con el ADN y en las zonas SHL ± 4 la cola de la histona H2A interactúa con ADN que la convierte en una zona menos estable [37]. Se observaron relaciones definidas estadísticamente entre el posicionamiento del nucleosoma y la modificación de la cromatina covalente, pero no existe una relación establecida entre las modificaciones de las histonas y los nucleótidos específicos observados en una ubicación determinada [5]. Aún no está claro cómo la composición específica de la secuencia de ADN podría interactuar con estos procesos y afectar el posicionamiento y remodelación de los nucleosomas. En la Sección 3 del Apéndice S2 se proporciona un breve resumen del conocimiento actual sobre la importancia de zonas SHL específicas que tratan de proporcionar más contexto a las regularidades observadas en este trabajo.

Mapeo computacional de nucleosomas en ubicaciones de cambio de ocupación de nucleosomas en ratones susceptibles y resistentes al estrés

Los patrones en un perfil de dinucleótidos agregado no necesariamente se observan en un número significativo de secuencias individuales [40]. En este caso, es probable que reflejen preferencias de secuencia relativamente débiles del núcleo de histonas, en lugar de un mecanismo de colocación de nucleosomas que sea significativo para la regulación biológica a nivel de loci individuales, como promotores o potenciadores de genes.

Para verificar si los patrones RR / YY se observan con frecuencia en secuencias individuales en los loci en los que se produjeron eventos reguladores en respuesta al estrés en ratones susceptibles al estrés y resistentes al estrés, realizamos un mapeo computacional de nucleosomas en esas secuencias utilizando patrones derivados en este estudio. Además, mapeamos nucleosomas en un subconjunto de secuencias de nucleosomas +1 muestreadas al azar de secuencias fasta de ratones afectados por estrés. La Tabla 2 muestra las proporciones del patrón de correlaciones de Pearson positivas más altas con las distribuciones de dinucleótidos en las secuencias de los loci en los que se produjeron cambios de ocupación de nucleosomas en respuesta al estrés en ratones afectados por estrés. Los patrones RR / YY y SS2 dominan significativamente en estas secuencias tanto en ratones susceptibles como resistentes al estrés. Se observaron proporciones de patrones similares en secuencias muestreadas aleatoriamente de +1 nucleosoma en todo el genoma de los ratones afectados por estrés. Las distribuciones de los coeficientes de correlación máximos de Pearson entre patrones y secuencias no difieren significativamente entre el promotor, el cuerpo del gen y las secuencias de nucleosomas +1 aleatorias. Sólo se observaron correlaciones ligeramente más altas en los promotores y los loci del cuerpo del gen para el patrón YY2. Las cifras que comparan las funciones de distribución acumulativa empírica (ECDF) de los coeficientes de correlación de Pearson obtenidos en el mapeo de nucleosomas en el promotor, el cuerpo del gen y las secuencias de nucleosoma +1 muestreadas al azar se encuentran en el Apéndice S3 complementario. A pesar de que observamos una prevalencia de patrones RR / YY menos estables en las secuencias de los loci en los que tuvieron lugar los eventos reguladores del cambio de ocupación del nucleosoma, se necesita un experimento dirigido más riguroso para establecer si estos patrones podrían interferir o influir en la cromatina reguladora biológicamente significativa. actividad.


Contenido

Los debates sobre las posibles funciones de estos elementos son de larga data. Las referencias controvertidas al ADN "basura" o "egoísta" se presentaron desde el principio, lo que implica que los segmentos de ADN repetitivos son restos de la evolución pasada o secuencias autónomas autorreplicantes que piratean la maquinaria celular para proliferar. [2] [3] Descubierto originalmente por Barbara McClintock, [4] las repeticiones dispersas se han reconocido cada vez más como una fuente potencial de variación y regulación genética. Junto con estas funciones reguladoras, también se ha propuesto una función estructural del ADN repetido en la configuración del plegamiento 3D de los genomas. [5] Esta hipótesis solo está respaldada por un conjunto limitado de pruebas experimentales. Por ejemplo, en humanos, ratones y moscas, varias clases de elementos repetitivos presentan una alta tendencia a la co-localización dentro del espacio nuclear, lo que sugiere que la célula puede utilizar posiciones de repeticiones de ADN como un mapa de plegamiento del genoma. [6]

Repeticiones en tándem en enfermedades humanas Editar

Las secuencias de repetición en tándem, en particular las repeticiones de trinucleótidos, subyacen a varias enfermedades humanas. Las repeticiones de trinucleótidos pueden expandirse en la línea germinal durante generaciones sucesivas dando lugar a manifestaciones cada vez más graves de la enfermedad. Las condiciones de la enfermedad en las que se produce la expansión incluyen la enfermedad de Huntington, el síndrome de X frágil, varias ataxias espinocerebelosas, distrofia miotónica y ataxia de Friedrich. [7] Las expansiones de repetición de trinucleótidos pueden ocurrir a través del deslizamiento de la cadena durante la replicación del ADN o durante la síntesis de reparación del ADN. [7]

Secuencias de repetición de hexanucleótidos GGGGCC en el C9orf72 gen son una causa común de esclerosis lateral amiotrófica y demencia frontotemporal. [8] Las secuencias de repetición de trinucleótidos CAG subyacen a varias ataxias espinocerebelosas (SCA-SCA1 SCA2 SCA3 SCA6 SCA7 SCA12 SCA17). [8] La enfermedad de Huntington es el resultado de una expansión inestable de secuencias CAG repetidas en el exón 1 del Huntingtin genHTT). HTT codifica una proteína de andamio que participa directamente en la reparación del daño oxidativo del ADN. [9] Se ha observado que los genes que contienen repeticiones de CAG patógenas a menudo codifican proteínas que tienen un papel en la respuesta al daño del ADN y que las expansiones repetidas pueden afectar las vías específicas de reparación del ADN. [10] La reparación defectuosa de los daños del ADN en secuencias repetidas puede causar una mayor expansión de estas secuencias, creando así un círculo vicioso de patología. [10]

Tipos principales Editar

Principales categorías de secuencia repetida o repite:

    : son copias adyacentes entre sí, ya sea directamente o invertidas. ADN satélite: normalmente se encuentra en centrómeros y heterocromatina. Minisatélite: unidades de repetición de aproximadamente 10 a 60 pares de bases, que se encuentran en muchos lugares del genoma, incluidos los centrómeros. Microsatélites: unidades de repetición de menos de 10 pares de bases, esto incluye los telómeros, que normalmente tienen de 6 a 8 unidades de repetición de pares de bases.
    (también conocido como elementos nucleares intercalados): elementos transponibles. Transposones de ADN, retrotransposones, retrotransposones LTR (HERV), retrotransposones no LTR.Short Idisperso norteuclear mielementos) .LÍNEAS (Long Idisperso norteuclear mielementos) .SVAs

En los primates, la mayoría de LINE son LINE-1 y la mayoría de SINE son Alu. Los SVA son específicos de hominoides.

En procariotas, CRISPR son matrices de repeticiones alternas y espaciadores.

Secuencias repetidas evolutivamente derivadas de eventos de infección viral. [11]

Otros tipos Editar

Nota: Lo siguiente se cubre en detalle en "Computación para genómica microbiana comparativa". [12]

    • Repetición directa global
    • Repeticiones simples directas locales
    • Repeticiones directas locales
    • Repeticiones directas locales con espaciador
    • Repetición global invertida
    • Repetición local invertida
    • Repetición invertida con espaciador

    El ADN repetitivo es difícil de secuenciar utilizando técnicas de secuenciación de próxima generación: el ensamblaje de secuencias a partir de lecturas cortas simplemente no puede determinar la longitud de una parte repetitiva.Este problema es particularmente grave para los microsatélites, que están formados por pequeñas unidades repetidas de 1 a 6 pb. [13]

    Muchos investigadores históricamente han omitido partes repetitivas al analizar y publicar datos del genoma completo. [14]


    ¿Por qué hay 10 pasos de pares de bases, no 16? - biología

    Al comparar células procariotas con células eucariotas, las procariotas son mucho más simples que las eucariotas en muchas de sus características (Figura 1). La mayoría de los procariotas contienen un cromosoma circular único que se encuentra en un área del citoplasma llamada nucleoide.

    Pregunta de práctica

    Figura 1. Un eucariota contiene un núcleo bien definido, mientras que en los procariotas, el cromosoma se encuentra en el citoplasma en un área llamada nucleoide.

    En las células eucariotas, la síntesis de ADN y ARN se produce en un compartimento separado de la síntesis de proteínas. En las células procariotas, ambos procesos ocurren juntos. ¿Qué ventajas podría tener separar los procesos?

    El tamaño del genoma en uno de los procariotas mejor estudiados, E. coli, es de 4,6 millones de pares de bases (aproximadamente 1,1 mm, si se corta y se estira). Entonces, ¿cómo encaja esto dentro de una pequeña célula bacteriana? El ADN se tuerce mediante lo que se conoce como superenrollamiento. Superenrollamiento significa que el ADN está subenrollado (menos de una vuelta de la hélice por cada 10 pares de bases) o sobreenrollado (más de 1 vuelta por cada 10 pares de bases) desde su estado relajado normal. Se sabe que algunas proteínas están involucradas en el superenrollamiento de otras proteínas y enzimas como la ADN girasa ayudan a mantener la estructura superenrollada.

    Los eucariotas, cuyos cromosomas consisten cada uno en una molécula de ADN lineal, emplean un tipo diferente de estrategia de empaquetamiento para encajar su ADN dentro del núcleo (Figura 2). En el nivel más básico, el ADN se envuelve alrededor de proteínas conocidas como histonas para formar estructuras llamadas nucleosomas. Las histonas son proteínas conservadas evolutivamente que son ricas en aminoácidos básicos y forman un octámero. El ADN (que está cargado negativamente debido a los grupos fosfato) se envuelve firmemente alrededor del núcleo de las histonas. Este nucleosoma está vinculado al siguiente con la ayuda de un ADN enlazador. Esto también se conoce como la estructura & # 8220beads on a string & # 8221. Esto se compacta aún más en una fibra de 30 nm, que es el diámetro de la estructura. En la etapa de metafase, los cromosomas son más compactos, miden aproximadamente 700 nm de ancho y se encuentran asociados con proteínas de andamio.

    En la interfase, los cromosomas eucariotas tienen dos regiones distintas que se pueden distinguir por tinción. La región compacta se conoce como heterocromatina y la región menos densa se conoce como eucromatina. La heterocromatina generalmente contiene genes que no se expresan y se encuentra en las regiones del centrómero y los telómeros. La eucromatina generalmente contiene genes que se transcriben, con ADN empaquetado alrededor de nucleosomas pero no más compactado.

    Figura 2. Estas figuras ilustran la compactación del cromosoma eucariota.


    Contenido

    Ejemplo de una repetición invertida Editar

    Comenzando con esta secuencia inicial:
    5'-TTACG-3 '

    El complemento creado por el emparejamiento de bases es:
    3'-AATGC-5 '

    El complemento inverso es:
    5'-CGTAA-3 '

    Y la secuencia de repetición invertida es:
    5 '--- TTACGnnnnnn CGTAA --- 3'

    "nnnnnn" representa cualquier número de nucleótidos intermedios.

    Vs. repetición directa Editar

    Una repetición directa ocurre cuando una secuencia se repite con el mismo patrón en sentido descendente. [1] No hay inversión ni complemento inverso asociado con una repetición directa. La secuencia de nucleótidos escrita en negrita significa la secuencia repetida. Puede tener o no nucleótidos intermedios.

    TTACGnnnnnnTTACG 3´ 3´ AATGCnnnnnnAATGC 5´

    Lingüísticamente, una repetición directa típica es comparable a la rima, como en "tyo me en una dyo me".

    Vs. repetición en tándem Editar

    Una repetición directa con no Los nucleótidos intermedios entre la secuencia inicial y su copia corriente abajo es una repetición en tándem. La secuencia de nucleótidos escrita en negrita significa la secuencia repetida.

    TTACGTTACG 3´ 3´ AATGCAATGC 5´

    Lingüísticamente, una repetición típica en tándem es comparable a tartamudear, o palabras repetidas deliberadamente, como en "adiós".

    Vs. palíndromo Editar

    Una secuencia de repetición invertida con no Los nucleótidos intermedios entre la secuencia inicial y su complemento inverso corriente abajo es un palíndromo. [1]
    EJEMPLO:
    Paso 1: comience con una repetición invertida: 5 'TTACGnnnnnnCGTAA 3'
    Paso 2: elimine los nucleótidos intermedios: 5 'TTACGCGTAA 3'
    Esta secuencia resultante es palindrómica porque es el complemento inverso de sí misma. [1]

    5 'TTACGCGTAA 3' Secuencia de prueba (del Paso 2 con los nucleótidos intermedios eliminados) 3 'AATGCGCATT 5' Complemento de la secuencia de prueba 5 'TTACGCGTAA 3' Complemento inverso Esto es igual que la secuencia de prueba anterior y, por lo tanto, es un palíndromo.

    Condiciones que favorecen la síntesis Editar

    Las diversas repeticiones de todo el genoma se derivan de elementos transponibles, que ahora se entiende que "saltan" sobre diferentes ubicaciones genómicas, sin transferir sus copias originales. [9] El transporte posterior de las mismas secuencias a lo largo de numerosas generaciones asegura su multiplicidad en todo el genoma. [9] La recombinación limitada de las secuencias entre dos elementos de secuencia distintos conocida como recombinación conservadora específica de sitio (CSSR) da como resultado inversiones del segmento de ADN, según la disposición de las secuencias de reconocimiento de recombinación en el ADN del donante y el ADN del receptor. [9] Nuevamente, la orientación de dos de los sitios de recombinación dentro de la molécula de ADN del donante en relación con la asimetría de las secuencias de escisión del ADN intervinientes, conocida como región de cruce, es fundamental para la formación de repeticiones invertidas o repeticiones directas. [9] Por lo tanto, la recombinación que ocurre en un par de sitios invertidos invertirá la secuencia de ADN entre los dos sitios. [9] Se han observado cromosomas muy estables con un número comparativamente menor de repeticiones invertidas que de repeticiones directas, lo que sugiere una relación entre la estabilidad cromosómica y el número de repeticiones. [10]

    Regiones donde la presencia es obligatoria Editar

    Se han observado repeticiones terminales invertidas en el ADN de varios transposones eucariotas, aunque se desconoce su origen. [11] Las repeticiones invertidas se encuentran principalmente en los orígenes de la replicación de organismos celulares y orgánulos que van desde plásmidos fagos, mitocondrias y virus eucariotas hasta células de mamíferos. [12] Los orígenes de replicación del fago G4 y otros fagos relacionados comprenden un segmento de casi 139 bases de nucleótidos que incluyen tres repeticiones invertidas que son esenciales para el cebado de replicación. [12]

    En el genoma Editar

    En gran medida, las porciones de repeticiones de nucleótidos se observan con bastante frecuencia como parte de combinaciones raras de ADN. [13] Las tres repeticiones principales que se encuentran principalmente en construcciones de ADN particulares incluyen las repeticiones invertidas de homopurina-homopirimidina muy precisas, que también se conocen como palíndromos H, una ocurrencia común en las conformaciones H de triple hélice que pueden comprender el TAT o el CGC tríadas de nucleótidos. Los otros podrían describirse como repeticiones invertidas largas que tienen la tendencia a producir horquillas y repeticiones cruciformes, y finalmente repeticiones en tándem directas, que comúnmente existen en estructuras descritas como ADN-Z de bucle deslizado, cruciforme y zurdo. [13]

    Común en diferentes organismos Editar

    Estudios anteriores sugieren que las repeticiones son una característica común de los eucariotas a diferencia de los procariotas y arqueas. [13] Otros informes sugieren que, independientemente de la escasez comparativa de elementos repetidos en los genomas procarióticos, estos contienen cientos o incluso miles de grandes repeticiones. [14] El análisis genómico actual parece sugerir la existencia de un gran exceso de repeticiones perfectas invertidas en muchos genomas procarióticos en comparación con los genomas eucarióticos. [15]

    Para la cuantificación y comparación de repeticiones invertidas entre varias especies, concretamente en arqueas, consulte [16]

    Repeticiones invertidas en pseudonudos Editar

    Los pseudonudos son motivos estructurales comunes que se encuentran en el ARN. Están formados por dos lazos de tallo anidados, de modo que el tallo de una estructura se forma a partir del lazo de la otra. Existen múltiples topologías de plegado entre los pseudonudos y una gran variación en las longitudes de los bucles, lo que los convierte en un grupo estructuralmente diverso. [17]

    Las repeticiones invertidas son un componente clave de los pseudonudos, como se puede ver en la ilustración de un pseudonudo natural que se encuentra en el componente de ARN de la telomerasa humana. [18] En esta estructura están involucrados cuatro conjuntos diferentes de repeticiones invertidas. Los conjuntos 1 y 2 son el vástago del vástago-bucle A y forman parte del bucle del vástago-bucle B. Del mismo modo, los conjuntos 3 y 4 son el vástago del vástago-bucle B y forman parte del bucle del vástago-bucle A.

    Los pseudonudos desempeñan una serie de funciones diferentes en biología. El pseudonudo de la telomerasa en la ilustración es fundamental para la actividad de esa enzima. [18] La ribozima para el virus de la hepatitis delta (HDV) se pliega en una estructura de doble pseudonudo y auto-escinde su genoma circular para producir un ARN de longitud de un solo genoma. Los pseudonudos también desempeñan un papel en el cambio de marco ribosómico programado que se encuentra en algunos virus y se requiere en la replicación de retrovirus. [17]

    En riboswitches Editar

    Las repeticiones invertidas juegan un papel importante en los riboswitches, que son elementos reguladores del ARN que controlan la expresión de genes que producen el ARNm, del cual forman parte. [9] En la ilustración se muestra un ejemplo simplificado del riboswitch de flavina mononucleótido (FMN). Este riboswitch existe en la transcripción de ARNm y tiene varias estructuras de tallo-bucle corriente arriba de la región codificante. Sin embargo, en la ilustración solo se muestran los bucles de base clave, que se han simplificado en gran medida para ayudar a mostrar el papel de las repeticiones invertidas. Hay múltiples repeticiones invertidas en este interruptor rib, como se indica en verde (fondo amarillo) y azul (fondo naranja).

    En ausencia de FMN, la estructura anti-terminación es la conformación preferida para la transcripción de ARNm. Se crea mediante el emparejamiento de bases de la región de repetición invertida rodeada con un círculo rojo. Cuando FMN está presente, puede unirse al bucle y evitar la formación de la estructura Anti-terminación. Esto permite que dos conjuntos diferentes de repeticiones invertidas se emparejen y formen la estructura de terminación. [19] El tallo-bucle en el extremo 3 'es un terminador transcripcional porque la secuencia que lo sigue inmediatamente es una cadena de uracilos (U). Si este bucle de tallo se forma (debido a la presencia de FMN) a medida que la cadena de ARN en crecimiento emerge del complejo de ARN polimerasa, creará suficiente tensión estructural para hacer que la cadena de ARN se disocie y, por lo tanto, termine la transcripción. La disociación se produce fácilmente porque el emparejamiento de bases entre las U en el ARN y las A en la hebra molde es el más débil de todos los emparejamientos de bases. [9] Por lo tanto, a niveles de concentración más altos, FMN regula negativamente su propia transcripción aumentando la formación de la estructura de terminación.

    Las repeticiones invertidas se describen a menudo como "puntos calientes" de inestabilidad genómica eucariota y procariota. [6] Se considera que las repeticiones largas invertidas influyen en gran medida en la estabilidad del genoma de varios organismos. [20] Esto se ejemplifica en E. coli, donde las secuencias genómicas con repeticiones largas invertidas rara vez se replican, sino que se eliminan con rapidez. [20] Nuevamente, las repeticiones largas invertidas observadas en la levadura favorecen en gran medida la recombinación dentro del mismo cromosoma y los cromosomas adyacentes, lo que resulta en una tasa de deleción igualmente muy alta. [20] Finalmente, también se observó una tasa muy alta de deleción y recombinación en regiones de cromosomas de mamíferos con repeticiones invertidas. [20] Las diferencias reportadas en la estabilidad de los genomas de organismos interrelacionados son siempre una indicación de una disparidad en las repeticiones invertidas. [10] La inestabilidad resulta de la tendencia de las repeticiones invertidas a doblarse en estructuras de ADN en forma de horquilla o cruciformes. Estas estructuras especiales pueden dificultar o confundir la replicación del ADN y otras actividades genómicas. [6] Por lo tanto, las repeticiones invertidas conducen a configuraciones especiales tanto en el ARN como en el ADN que, en última instancia, pueden causar mutaciones y enfermedades. [8]

    La ilustración muestra una repetición invertida sometida a extrusión cruciforme. El ADN en la región de la repetición invertida se desenrolla y luego se recombina, formando una unión de cuatro vías con dos estructuras de tallo-bucle. La estructura cruciforme se produce porque las secuencias repetidas invertidas se emparejan entre sí en su propia hebra. [21]

    Las cruciformes extruidas pueden provocar mutaciones de desplazamiento de marco cuando una secuencia de ADN tiene repeticiones invertidas en forma de palíndromo combinado con regiones de repeticiones directas en ambos lados. Durante la transcripción, el deslizamiento y la disociación parcial de la polimerasa de la hebra molde puede conducir a mutaciones por deleción e inserción. [8] La eliminación ocurre cuando una porción de la hebra de plantilla desenrollada forma un tallo-bucle que es "saltado" por la maquinaria de transcripción. La inserción se produce cuando se forma un tallo-bucle en una parte disociada de la hebra naciente (recién sintetizada), lo que hace que una parte de la hebra plantilla se transcriba dos veces. [8]

    Deficiencia de antitrombina por una mutación puntual Editar

    Las repeticiones invertidas imperfectas pueden dar lugar a mutaciones a través de la conmutación entre cadenas y entre cadenas. [8] La región codificante del gen de la antitrombina III es un ejemplo de una repetición invertida imperfecta, como se muestra en la figura de la derecha. La estructura de vástago-bucle se forma con una protuberancia en la parte inferior porque la G y la T no se emparejan. Un evento de cambio de hebra podría resultar en que la G (en la protuberancia) sea reemplazada por una A que elimina la "imperfección" en la repetición invertida y proporciona una estructura de vástago-bucle más fuerte. Sin embargo, el reemplazo también crea una mutación puntual que convierte el codón GCA en ACA. Si al evento de cambio de hebra le sigue una segunda ronda de replicación del ADN, la mutación puede fijarse en el genoma y provocar una enfermedad. Específicamente, la mutación sin sentido daría lugar a un gen defectuoso y una deficiencia de antitrombina que podría resultar en el desarrollo de tromboembolismo venoso (coágulos de sangre dentro de una vena). [8]

    Osteogénesis imperfecta de una mutación de cambio de marco Editar

    Las mutaciones en el gen del colágeno pueden provocar la enfermedad de la osteogénesis imperfecta, que se caracteriza por huesos frágiles. [8] En la ilustración, un tallo-bucle formado a partir de una repetición invertida imperfecta se muta con una inserción de nucleótido de timina (T) como resultado de un cambio entre cadenas o dentro de las cadenas. La adición de la T crea un emparejamiento de bases "emparejado" con la adenina (A) que anteriormente era un "bulto" en el lado izquierdo del tallo. Si bien esta adición hace que el tallo sea más fuerte y perfecciona la repetición invertida, también crea una mutación de cambio de marco en la secuencia de nucleótidos que altera el marco de lectura y dará como resultado una expresión incorrecta del gen. [8]

    La siguiente lista proporciona información y enlaces externos a varios programas y bases de datos para repeticiones invertidas: