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Papel del NaCl en CTAB: complejo de ADN en la extracción de ADN

Papel del NaCl en CTAB: complejo de ADN en la extracción de ADN


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Tengo una pregunta sobre el papel del NaCl en el proceso de extracción de ADN. Entonces, para concentraciones de NaCl por debajo de 0.5M, las moléculas de CTAB y ADN pueden crear complejos. En esas concentraciones, las proteínas y otros hidrocarburos todavía son solubles en agua, excepto el complejo ADN-CTAB. Si aumentamos la concentración de NaCl, el complejo de CTAB-ADN también será soluble en agua. Corrígeme si me equivoco hasta ahora.

Entonces no entiendo algo. ¿Por qué usamos NaCl?

Supongamos que no agregamos NaCl. ¿El CTAB creará complejos con ADN o no? Mientras leo, CTAB crea enlaces iónicos con el ADN (grupos fosfato). Entonces, en esta situación (sin NaCl), CTAB también debe poder crear complejos con ADN.

Entonces, ¿por qué usamos NaCl? ¿Solo para mantener las proteínas y otros hidrocarburos solubles en el agua o hay algo más a lo que el NaCl ayuda en esta compleja creación?


CTAB forma complejos insolubles con ácidos nucleicos y se puede utilizar para precipitarlos selectivamente de soluciones, consulte esta referencia:

Cuando agrega NaCl en una concentración entre 0.4 - 0.7 M, los ácidos nucleicos permanecen en solución, mientras que los polisacáridos y otras sustancias, que pueden interferir con la preparación del ADN, no. Consulte este artículo: "Aislamiento rápido de ADN vegetal de alto peso molecular".


¿Cuál es el propósito de la sal en la extracción de ADN?

Durante la extracción de ácido desoxirribonucleico, o ADN, típicamente se añaden compuestos de sal como acetato de sodio y acetato de amonio para ayudar en la eliminación de proteínas asociadas al ADN. Otro tipo de compuesto de sal llamado cloruro de sodio, o NaCl, ayuda a solidificar y hacer visible el ADN. Cuando se mezcla en una solución de alcohol, el componente de sodio de NaCl proporciona una barrera protectora alrededor de los extremos de fosfato de ADN cargados negativamente, lo que les permite acercarse para ser extraídos de la solución.

La extracción de ADN es el proceso de obtener ADN puro de una muestra, ya sea de células vivas o no vivas, como las que se encuentran en los virus. Esta técnica se usa comúnmente en el campo médico, donde la detección temprana de enfermedades y trastornos aumenta significativamente las tasas de supervivencia de las personas afectadas.

El método inicialmente requiere la lisis de las células que contienen el ADN que se va a extraer. Las células se desintegran al someter la muestra a oscilaciones ultrasónicas o al batir las perlas. La muestra se agrega con sal, que se centrifuga en una solución de fenol-cloroformo. A continuación, se extraen las moléculas de proteína asociadas. El ADN que queda después de la eliminación de las proteínas se mezcla con una solución de alcohol, típicamente isopropanol frío o etanol. La solución se centrifuga y el ADN, que no se disuelve en alcohol, se precipita y se extrae. Para aumentar la producción de ADN, todo el proceso debe realizarse en un ambiente frío.


¿Qué es la precipitación de ADN?

La precipitación de ADN es un proceso en el que el ADN se precipita o se agrega en el hilo de algodón visible como precipitados usando alcohol y sal.

La precipitación del ADN también elimina las impurezas del ADN.

& # 8220La precipitación es un proceso en el que la reacción entre el soluto y el solvente crea un agregado insoluble llamado precipitado y el proceso se llama precipitación. & # 8221

El ADN es de naturaleza hidrófila que se disuelve en agua pero no en alcohol.

El agua tiene una carga parcial positiva y una carga parcial negativa. La carga positiva de la molécula de agua interactúa con la carga negativa del ADN (la PO3-) y la disuelve. Sin embargo, la interacción no es tan fuerte.

La imagen muestra la interacción intermolecular entre el agua y el ADN.

La sal y el alcohol hacen que el ADN sea más hidrófobo en agua, una vez que agregamos la sal al ADN, la carga negativa del ADN interactúa con la carga positiva de la sal, en lugar de la carga positiva del agua.

Puede unirse al agua, pero gracias al alcohol, el & # 8220 alcohol constante dieléctrico inferior & # 8221 protege el complejo de sal y ADN protegiéndolo del agua.

El ADN es visible como un hilo de algodón y se agrega como un precipitado debido a esta reacción química.

Para obtener una explicación más detallada sobre el mecanismo de precipitación del ADN, lea nuestro artículo anterior: Papel del alcohol en la extracción de ADN.

Además, en lugar de la carga negativa del ADN, el agua permanece ocupada en interacción con la carga negativa del alcohol, lo que también aumenta la eficiencia de precipitación y el rendimiento general del precipitado de ADN.

Todo el mecanismo de precipitación se basa en la polaridad de la solución y la constante dieléctrica del solvente.


Referencias

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Desafíos durante la extracción de ADN y las aplicaciones posteriores

La autenticación de alimentos requiere ADN de alta calidad, ya que es vital para el análisis basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La baja calidad del ADN extraído de los productos alimenticios después de un procesamiento térmico masivo obstruye el proceso de autenticación (Demirhan, Ulca y Senyuva, 2012). La selección de un método apropiado para la extracción de ADN tiene en cuenta ciertos factores, como el tiempo, el costo y la toxicidad de los productos químicos empleados (Chapela et al., 2007). Por ejemplo, un método convencional de extracción de ADN de especies animales generalmente requiere la adición de fenol y cloroformo (Lopera-Barrero et al., 2008), que presentan mayores riesgos de contaminación del ADN y peligros para la salud (Yue & Orban, 2001). El método también requiere mucho tiempo.

Para asegurar una amplificación por PCR exitosa, la pureza del ADN extraído es de mayor importancia que el rendimiento del ADN (Särkinen, Staats, Richardson, Cowan y Bakker, 2012). Pinto y col. (2007) ha descrito la presencia de inhibidores o contaminantes provenientes de alimentos, como polisacáridos y ácido húmico, mientras que Rijpens, Jannes, Asbroeck, Rossau y Herman (1996) indican que la proteína en la leche reduce la solubilidad de las células granuladas de las que se extrae el ADN. extraído. Wilson (1997) informó sobre lípidos y compuestos fenólicos que pueden contaminar el ADN. Además, algunos componentes químicos empleados durante la extracción de ADN se han identificado como inhibidores de la PCR. Por ejemplo, el agente quelante, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), puede formar un complejo con magnesio, que eventualmente afecta la concentración efectiva de magnesio requerida para la PCR. Como resultado, es necesaria una mayor concentración de magnesio para apoyar la amplificación (Khosravinia & Ramesha, 2007).

Además, los productos químicos, como el fenol, provocan la desnaturalización de la polimerasa, mientras que el NaOH también provoca la degradación del ADN y la polimerasa. El uso de isopropanol y etanol en el paso de precipitación del ADN afecta la calidad del ADN obtenido (Bar, Kubista y Tichopad, 2012 Hedman & Rådström, 2013). Estos inhibidores obstaculizarán e interferirán con las aplicaciones posteriores o pueden causar una inhibición completa de la actividad de la ADN polimerasa en la PCR (Pinto et al., 2007). Alternativamente, los inhibidores de la PCR se pueden eliminar mediante la técnica de columna de rotación, donde con la ayuda de agentes caotrópicos, el ADN se une a las membranas de sílice durante la extracción (Pinto, Forte, Conversano y Tantillo, 2005).

Además de los inhibidores, el aumento de la temperatura y la duración del tratamiento térmico pueden degradar gradualmente el tamaño de los fragmentos de ADN (Şakalar, Abasiyanik, Bektik y Tayyrov, 2012). Asimismo, se deben tener en cuenta varios factores, como la especificidad del cebador, el tamaño del amplicón y el número de copias del gen, para lograr una amplificación exitosa (Jagadeesan & Salem, 2017). Por lo tanto, es importante incorporar un control endógeno en aplicaciones posteriores, ya que puede verificar posibles variaciones de amplificación debido a ciertos factores. Estos factores, que pueden afectar el resultado del ensayo, incluyen la variación de la cantidad y la calidad del ADN extraído de las muestras y la degradación del ADN (Soares, Amaral, Oliveira y Mafra, 2013).


Materiales y métodos

Fuentes de semillas de soja

En el presente estudio se utilizaron cinco tipos de semillas de soja, incluidas las variedades no biotecnológicas y biotecnológicas. Los materiales de semillas de soja no biotecnológicos, Zhoudou22, Zheng196 y Zhonghuang13, se compraron en la Academia de Ciencias Agrícolas de Henan. Se obtuvieron dos tipos de semillas de soja transgénicas de Henan Sunshine Oils and Fats Group que importa materiales transgénicos de Estados Unidos anualmente. Se había realizado un ensayo con tiras reactivas de inmunocromatografía que revelaban 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) positivo para ambas semillas de soja GM. Teniendo en cuenta que las muestras de soja transgénica eran geográficamente diferentes, las llamamos Roundup Ready Soybean (RRS) 1 (RRS1) y Roundup Ready Soybean2 (RRS2) respectivamente.

Protocolos de extracción de ADN genómico

Todas las semillas de soja se trituraron y homogeneizaron en nitrógeno líquido con un molino mezclador, seguido de filtración a través de un tamiz de 80 mallas. Todas las muestras molidas se almacenaron a -20 ° C antes de la extracción de ADN.

Método 1 de SDS

Se pesaron cien miligramos de Zhoudou22 y se transfirieron a un tubo de centrífuga estéril de 2 ml. Se añadió un mililitro de tampón de extracción de SDS (20 g SDS / l, NaCl 150 mM, Tris / HCl 100 mM, EDTA 25 mM, pH 8,0) precalentado a 65 ° C y se mezcló seguido de la adición de 10 μl de proteinasa K (10 mg / ml). Luego, el tubo de reacción se incubó a 65 ° C durante 1 h, con agitación cada 10 min. Después de centrifugar el tubo durante 10 min a 12000 ×gramo, el sobrenadante se extrajo dos veces con fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (P: C: I, 25: 24: 1, v / v / v) (primera extracción) y cloroformo / alcohol isoamílico (C: I, 24: 1, v / v) (segunda extracción), respectivamente. Luego, la fase acuosa superior se añadió con 0,1 volumen de solución de acetato de potasio (3 M, pH 5,5) y doble volumen de solución de etanol (95%, v / v, -20 ° C) (primera precipitación), seguido de una suave inversión y agitación. durante 10 min a 15000 ×gramo para sedimentar el ADN. Después de lavar el sedimento con solución de etanol (70%, v / v, -20 ° C) dos veces y secar al aire durante 5 min, el sedimento seco se disolvió con 400 μl de tampón Tris / EDTA (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Se agregaron diez miligramos de RNasa a la mezcla y se realizó una incubación a 37 ° C durante 30 min para eliminar el ARN restante. Se llevó a cabo otra extracción con C: I (tercera extracción) para eliminar la proteína de la solución de ADN. Recuperar la capa superior en un nuevo tubo estéril que contenga 2,5 vol de etanol (segunda precipitación) ayudaría a precipitar el ADN fácilmente. Después de girar el tubo a 15000 ×gramo durante 10 min y lavando el sedimento de ADN dos veces, el ADN seco se redisolvió en 200 µl de agua desionizada estéril.

Método CTAB

La operación en este método fue similar a la descrita en el método 1 de SDS excepto el tampón de lisis y los reactivos orgánicos usados ​​para precipitar el ADN. Este método se basó en tampón de extracción de CTAB (20 g de CTAB / l, NaCl 1,4 M, Tris / HCl 100 mM, EDTA 20 mM, pH 8,0) y se añadió 0,6 vol de isopropanol a la fase acuosa superior para sedimentar el ADN dos veces en lugar de solución de etanol utilizada en el método 1 de SDS.

Método del mini kit de plantas DP305 y DNeasy

Con respecto a dos kits comerciales, DP305 (TIANGEN, Beijing, China) y DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Hilden, Alemania), se extrajo ADN de Zhoudou22 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Método 2 de SDS

El protocolo de extracción de ADN se describió en el método 1 de SDS, excepto por los componentes del tampón de lisis. Las concentraciones de cada componente en el tampón de extracción de SDS se detallan en la Tabla 2.

Composición de los componentes del tampón de lisis SDS (pH 8,0).
Número . SDS (p / v). NaCl (mM). Tris / HCl (mM). EDTA (mM).
1 0.5% 250 100 25
2 2% 250 100 25
3 5% 250 100 25
4 2% 0 100 25
5 2% 150 100 25
6 2% 250 100 25
7 2% 500 100 25
8 2% 250 10 25
9 2% 250 50 25
10 2% 250 100 25
11 2% 250 200 25
12 2% 250 100 5
13 2% 250 100 25
14 2% 250 100 50
15 2% 250 100 100
Composición de los componentes del tampón de lisis SDS (pH 8,0).
Número . SDS (p / v). NaCl (mM). Tris / HCl (mM). EDTA (mM).
1 0.5% 250 100 25
2 2% 250 100 25
3 5% 250 100 25
4 2% 0 100 25
5 2% 150 100 25
6 2% 250 100 25
7 2% 500 100 25
8 2% 250 10 25
9 2% 250 50 25
10 2% 250 100 25
11 2% 250 200 25
12 2% 250 100 5
13 2% 250 100 25
14 2% 250 100 50
15 2% 250 100 100
Reactivos orgánicos utilizados para extraer y precipitar ADN.
Procedimiento. Primera extracción. Tercera extracción. Primera precipitación. Segunda precipitación.
A P: C: Yo C: yo Etanol Etanol
B C: yo C: yo Etanol Etanol
C P: C: Yo / Etanol Etanol
D P: C: Yo C: yo KAc + 95% de etanol Etanol
mi P: C: Yo C: yo Isopropanol Etanol
F C: yo C: yo Etanol Isopropanol
GRAMO C: yo C: yo Isopropanol Isopropanol
H C: yo C: yo Isopropanol Etanol
Reactivos orgánicos utilizados para extraer y precipitar ADN.
Procedimiento. Primera extracción. Tercera extracción. Primera precipitación. Segunda precipitación.
A P: C: Yo C: yo Etanol Etanol
B C: yo C: yo Etanol Etanol
C P: C: Yo / Etanol Etanol
D P: C: Yo C: yo KAc + 95% de etanol Etanol
mi P: C: Yo C: yo Isopropanol Etanol
F C: yo C: yo Etanol Isopropanol
GRAMO C: yo C: yo Isopropanol Isopropanol
H C: yo C: yo Isopropanol Etanol

Método 3 de SDS

El protocolo de extracción de ADN se describió en el método 1 de la SDS, excepto para las variedades de disolventes orgánicos. El uso de disolventes orgánicos se muestra en la Tabla 2. El volumen de adición de isopropanol fue 0,6 vol de sobrenadante.

Método 4 de SDS

Fue el método de extracción de ADN optimizado. Su protocolo se mostró en el método 1 de SDS excepto varias modificaciones: tampón de lisis SDS (SDS al 2% (p / v), NaCl 150 mM, Tris / HCl 50 mM, EDTA 50 mM, pH 8.0), primer reactivo de extracción (C: I ), tercer reactivo de extracción (C: I), primer reactivo de precipitación (isopropanol), segundo reactivo de precipitación (etanol).


Reactivos utilizados para el aislamiento y purificación de ADN

Recientemente hicimos un experimento sobre el aislamiento y purificación de ADN de células bacterianas y, por mucho que lo intento, realmente no entiendo lo que sucedió como resultado de qué reactivo. He buscado en línea y en varios textos, pero casi todas las fuentes dan una respuesta diferente.

Qué usamos (en orden de uso):
Búfer TE
SDS
Proteinasa K
NaCl
Solución CTAB / NaCl
Cloroformo / alcohol isoamílico 24: 1
Fenol / cloroformo / alcohol isoamílico 25: 24: 1
Isopropanol
Etanol

Células de lisis SDS
La proteinasa K inactiva las nucleasas
NaCl neutraliza las cargas en el ADN
El fenol / cloroformo / isoamilo se separa en fases y elimina & # 039gunk & # 039
El isopropanol precipita el ADN
El etanol elimina la sal

El resto estoy tan confundido.

Este es uno de los muchos protocolos de aislamiento de ADN genómico diferentes, ¡aunque nos deja con algunas conjeturas sobre el protocolo exacto! Este tipo de método también se modifica ocasionalmente para su uso en minipreparaciones de ADN plasmídico. El SDS, un tensioactivo aniónico (que a menudo se encuentra en muchos productos de limpieza como el champú para el cabello), lisa las bacterias. En la lisis alcalina, las minipreparaciones de ADN plasmídico, el SDS a menudo se usa junto con NaOH (por ejemplo, 0,2 N) después de una digestión con enzima lisozima, y ​​entonces normalmente no tendría un paso de proteinasa K. La PK se usa con más frecuencia con el aislamiento de ADN genómico (sin lisis alcalina) o incluso después de una digestión con enzimas de restricción. Entonces, la proteinasa K inactivará las nucleasas (por ejemplo, DNasas / RNasas) particularmente en presencia de SDS, pero es una proteasa de amplio espectro que también digiere proteínas para asegurar la lisis completa de las células.

CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) es un tensioactivo catiónico que solubiliza aún más las células. En general, el ADN es "feliz" en NaCl: los iones de Na + neutralizan los fosfatos cargados negativamente en el ADN y facilitan la unión de las moléculas de ADN (las moléculas son menos hidrófilas). Se requiere una alta concentración de NaCl, de lo contrario se pueden formar precipitados de ácido nucleico de CTAB; lo que está tratando de hacer aquí es eliminar toda la basura (restos de la pared celular bacteriana, proteínas desnaturalizadas, polisacáridos) complejados con CTAB y dejar el ADN bacteriano en solución. La extracción de cloroformo / IAA (con microfusión) deja estos complejos en una interfaz blanquecina (cloroformo en la parte inferior, ADN en la parte superior IAA ayuda a estabilizar la interfaz). El ADN se 'limpia' con fenol / cloroformo / IAA para eliminar cualquier complejo restante y se precipita del sobrenadante con isopropanol (el ADN cromosómico grande se precipita fácilmente con este alcohol no polar, incluso sin la adición de sal extra o utilizando bajas temperaturas). El sedimento se lava con EtOH (normalmente pero no siempre al 70-75%) para eliminar el isopropanol restante y las sales residuales.


Abstracto

Diferentes especies de Cinnamomum son ricas en polisacáridos y metabolitos secundarios, que dificultan el proceso de extracción de ADN. El ADN de alta calidad es un requisito previo para cualquier estudio de biología molecular. En este artículo presentamos un método modificado para la extracción de ADN de alta calidad y cantidad de muestras de hojas tanto liofilizadas como no liofilizadas. El protocolo informado difiere del procedimiento CTAB por la adición de una mayor concentración de sal y carbón activado para eliminar los polisacáridos y polifenoles. La amplia utilidad del protocolo modificado se demostró mediante la extracción de ADN de diferentes especies leñosas y 4 Cinnamomum especies. Por tanto, este protocolo también ha sido validado en diferentes especies de plantas que contienen altos niveles de polifenoles y polisacáridos. El ADN extraído mostró una amplificación perfecta cuando se sometió a RAPD, digestión de restricción y amplificación con cebadores de códigos de barras de ADN. El protocolo de extracción de ADN es reproducible y se puede aplicar a cualquier estudio de biología molecular vegetal.


Extracción bruta de ADN

Apuntar: Conocer el procedimiento de extracción de ADN con materiales domésticos.

Introducción: ¿Cómo identifica el investigador de la escena del crimen al sospechoso del caso de asesinato? ¿Cómo detecta el pescador la enfermedad viral que provoca brotes en sus estanques? ¿Cómo le dice tu sangre a la gente quiénes son tus padres? ¿Cómo descubre el científico el gen de resistencia a la sequía en las plantas? Esas respuestas se pueden encontrar en el trabajo de campo de la tecnología del ADN.

  1. Extracción, para separar el ADN de la célula. Esta etapa generalmente utiliza SDS / CTAB / Triton-X como detergente activo y NaCl saturado.
  2. Purificación, para separar el ADN extraído de cualquier contaminante, restos celulares, proteína y ARN. Los científicos utilizan fenol: cloroformo: isoamiletanol (PCIA) para este propósito y
  3. Precipitación, para precipitar el ADN y formar hebras delgadas, transparentes o blancas. En esta etapa se puede utilizar etanol helado al 96%.
  1. Triturar 0,5 gramos de muestra en el mortero estéril y homogeneizar con la solución tampón,
  2. Filtrar el homogeneizado con papel de filtro y colocar en la centrífuga estéril.
  3. Mezclar el filtrado con 5 ml de SDS al 20% y 5 ml de NaCl 5 M usando un vórtex.
  4. Centrifugue la suspensión para separar los componentes celulares de los restos celulares.
  5. Retire el sobrenadante en un tubo nuevo.

Agregue etanol al 96% helado con cuidado al nuevo tubo a través del costado del tubo. Aparecerán hebras blancas en la superficie de la suspensión si realiza la extracción de ADN correctamente.


Comparación de métodos de extracción de ADN total para suelo contaminado de forma de comunidad microbiana ☆

El aislamiento de ADN representa el paso básico y probablemente el más importante de la biología molecular para las cepas microbianas, y más aún, para los análisis de comunidades microbianas. A pesar del desarrollo de protocolos moleculares para el aislamiento de la comunidad microbiana de ADN, todavía existen muchos inconvenientes que dependen de la composición de las muestras, e incluso los kits de aislamiento genómico disponibles comercialmente tienen limitaciones significativas para recuperar altas cantidades de ADN genómico, especialmente de muestras de suelo. Nuestro estudio tiene como objetivo comparar y optimizar un protocolo de aislamiento de ADN de la comunidad microbiana total a partir de muestras de suelo contaminado, estimando la cantidad y la pureza del ADN genómico por g de suelo, versus los requisitos de tiempo para cada protocolo, teniendo en cuenta que nuestras muestras de suelo tienen un alto contenido de ácidos húmicos. Verificamos varios protocolos para la extracción total de ADN, basados ​​en CTAB, incluido un kit específico para el aislamiento de ADN del suelo NorgenBiotek. Estimamos el tiempo necesario para cada protocolo, la cantidad de ADN por gramo de suelo contaminado, las proteínas y el grado de contaminación del ARN, mediante análisis espectrofotométrico, pero también el grado de inhibición de la amplificación por PCR. El método más eficiente para nuestras muestras de suelo con alto contenido de ácido húmico, adecuado para análisis moleculares adicionales, fue la muestra de comunidad microbiana de ADN total extraída de Sagova et al. (2008) basado en protocolo, con varios ajustes. Este protocolo será valioso para el análisis molecular de perfiles de comunidades microbianas a partir de muestras ambientales, especialmente de suelos contaminados.


Ver el vídeo: Extracción de ADN de una banana (Diciembre 2022).