Información

3.5: Inducir proteínas y evaluar el ADN - Biología

3.5: Inducir proteínas y evaluar el ADN - Biología


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Introducción

La última vez que transformó su ADN mutante en células BL21 (DE3). ¡No dejaré de decirte que hay muchas cosas que pueden salir mal en esta etapa! Sin embargo, cada uno es ciertamente una experiencia de aprendizaje.

Como lo demuestra el trabajo de Nagai, el pericam inverso de tipo salvaje no es tóxico para las células BL21 (DE3). Aunque es poco probable que su pequeña mutación cambie drásticamente este hecho, en general, una proteína nueva puede resultar tóxica. Si este es el caso, solo se producen cantidades muy pequeñas de proteína antes de que la bacteria muera. Tenga en cuenta que la sobreexpresión de una sola proteína puede producirse a expensas de la producción de proteínas necesarias para la supervivencia, y lo más probable es que eventualmente cause la muerte celular; sin embargo, las proteínas tóxicas aceleran esta desaparición. La toxicidad aberrante a veces se puede aliviar reduciendo la temperatura del cultivo (por ejemplo, a 30 ° C).

En función de su actividad de fluorescencia, la pericam inversa de tipo salvaje permite el plegado adecuado de (cp) EYFP y, según su respuesta al calcio, también permite que la calmodulina se doble. Un problema que puede encontrar es que sus proteínas mutantes ya no se plegarán correctamente. Dado que realizó mutaciones en la parte del sensor de calcio de IPC, en lugar de la parte fluorescente, es poco probable que su proteína destruya la fluorescencia de EYFP. Sin embargo, un problema común con las proteínas mal plegadas es la formación de agregados insolubles, debido, por ejemplo, a superficies hidrófobas expuestas incorrectamente. Las proteínas se pueden purificar a partir de estos agregados, llamados cuerpos de inclusión, pero el proceso es más laborioso que para las proteínas solubles. (Las proteínas deben extraerse en condiciones más duras de las que usará la próxima vez, luego purificarse en condiciones de desnaturalización, antes de intentar finalmente renaturalizar las proteínas). Los cuerpos de inclusión a veces se forman simplemente debido a una expresión muy alta de la proteína de interés, lo que provoca que para pasar su límite de solubilidad. Este resultado se puede prevenir reduciendo la temperatura o el tiempo de cultivo, la cantidad de IPTG o la fase de crecimiento de las bacterias.

Un último punto a tener en cuenta es que no todas las proteínas pueden producirse en bacterias. Las proteínas eucariotas que requieren modificaciones postraduccionales (como la glicosilación) para su actividad requieren huéspedes eucariotas (como la levadura o las ubicuas células CHO (ovario de hámster chino)). A veces, las proteínas derivadas de eucariotas serán truncadas o mal traducidas por E. coli debido al sesgo diferencial de codones (Kane, 1995); Los errores de traducción se pueden prevenir proporcionando ARNt adicionales al cultivo o directamente a las bacterias a través de plásmidos (McNulty, et al., 2003). A pesar de toda esta complejidad, los huéspedes procariotas han sido lo suficientemente buenos como para producir proteínas para ciertas terapias, en particular la citocina G-CSF para pacientes que necesitan reponer sus glóbulos blancos (por ejemplo, después de la quimioterapia), que se vende como Neupogen® por Amgen.

Después de inducir sus células con IPTG, dejará que las fábricas de proteínas resultantes hagan su trabajo durante 2-3 horas. Durante este tiempo, evaluará el ADN de sus dos candidatos X # Z (y del mutante M124S). Primero, ejecutará sus resúmenes de diagnóstico de la última vez en un gel. Los patrones de bandas le permitirán determinar (o diagnosticar) si alguno de sus supuestos mutantes X # Z contiene realmente el nuevo sitio de restricción que introdujo. Por supuesto, existe una pequeña posibilidad de que se haya incorporado la mutación silenciosa, pero no la mutación no silenciosa. Para obtener evidencia más directa de si la mutagénesis dirigida al sitio funcionó, analizará los datos de las reacciones de secuenciación que configuró la última vez.

La invención de las máquinas secuenciadoras automáticas ha hecho que la determinación de la secuencia sea un esfuerzo relativamente rápido y económico. El método para secuenciar el ADN no es nuevo, pero la automatización del proceso es reciente, desarrollada junto con los esfuerzos masivos de secuenciación del genoma de la década de 1990. En el corazón de las reacciones de secuenciación se encuentra la química desarrollada por Fred Sanger en la década de 1970 que usa didesoxinucleótidos (vea el esquema arriba a la izquierda). Estas bases de terminación de cadena se pueden agregar a una cadena de ADN en crecimiento, pero no se pueden extender más. Al realizar cuatro reacciones, cada una con una base de terminación de cadena diferente, se generan fragmentos de diferentes longitudes que terminan en G, A, T o C. Los fragmentos, una vez separados por tamaño, reflejan la secuencia del ADN. En los "viejos tiempos" (¡hace 10 años!), Se incorporaba material radiactivo en los fragmentos de ADN que se alargaban para que pudieran visualizarse en una película de rayos X (imagen arriba del centro). Más recientemente, se han utilizado en su lugar tintes fluorescentes, un color ligado a cada base didesoxi. Los cuatro fragmentos de colores se pueden pasar a través de capilares a una computadora que puede leer la salida y rastrear las intensidades de color detectadas (imagen de arriba a la derecha). Su muestra se secuenció de esta manera en un analizador de ADN ABI 3730.

El análisis de los datos de secuencia no es una tarea pequeña. La "observación de secuencias" puede absorber horas de tiempo con pocos o ningún resultado. También hay muchos programas basados ​​en la web para descifrar patrones. El nucleótido o su proteína traducida pueden examinarse de esta forma. Gracias a la información de la secuencia del genoma que ahora está disponible, se ha acuñado un nuevo verbo, "BLAST", para describir la comparación de su propia secuencia con secuencias de otros organismos. BLAST es un acrónimo de Basic Local Alignment Search Tool, y se puede acceder a él a través del Página de inicio del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI).

Quizás se pregunte por qué alguna vez se tomaría la molestia de diseñar y realizar resúmenes de diagnóstico, cuando la secuenciación es relativamente simple y proporciona más información. Aquí, la idea de escala se vuelve importante. La secuenciación cuesta $ 8 por reacción, lo que puede sumar si necesita examinar, digamos, 10 o más candidatos. La electroforesis en gel de agarosa, en comparación, cuesta quizás 1 dólar por candidato. Dado que ambos métodos requieren el aislamiento del ADN, uno no es mucho más laborioso que el otro. (Un método llamado PCR de colonias evita este trabajo. ¿Puede adivinar lo que podría implicar?) Finalmente, los patrones de bandas pueden dar una lectura rápida de muchas colonias candidatas en comparación con el tiempo que toma el análisis de secuenciación individual que realizará hoy. Por supuesto, no hay razón para que uno no pueda automatizar el proceso de análisis con un poco de código (de computadora, no de ADN).

Protocolos

Parte 1: Medición celular e inducción de IPTG

  1. Para cada proteína mutante (candidatos 1 y 2 de X # Z, M124S), se le dará una alícuota de 6 ml de células BL21 (DE3) que llevan el plásmido mutante; también recibirá un tubo de BL21 (DE3) que lleva pericam inversa de tipo salvaje. Estas células deben estar en o cerca de la fase de crecimiento medio logarítmico para una buena inducción, tal como lo estaban para la transformación. Como la última vez, verifique los valores de DO600 de sus celdas hasta que caigan entre 04 y 06 (es mejor sobrepasar un poco que subimpulsar).
  2. Una vez que sus células hayan alcanzado la fase de crecimiento adecuada, reserve, en hielo, 1,5 ml de células de cada tubo como muestra de control (sin IPTG). Luego, tome una alícuota de IPTG frío (0,1 M) y agréguelo a las células restantes a una concentración final de 1 mM. Debes preparar tres tubos mutantes y uno salvaje.
  3. Regrese sus tubos al agitador rotatorio en la incubadora a 37 ° C y anote el tiempo.
  4. Mientras sus células estimuladas con IPTG están produciendo proteínas, analizará los datos de secuencia y los digestiones de los plásmidos que transportan. Al final del día, elegirá solo uno de sus candidatos X # Z para guardar y entregará la otra muestra a la facultad de enseñanza para que la blanqueen y la desechen.

Parte 2: Ejecute el gel de diagnóstico

El siguiente esquema asume que tanto Digest 1 (D1, usado para analizar el mutante M124S) como Digest 2 (D2, usado para analizar sus candidatos mutantes X # Z) usan solo una enzima. Si está haciendo doble digestión y necesita ejecutar controles de una sola enzima, es de esperar que haya hablado con el profesorado sobre esto la última vez. Cargue sus muestras en un gel de agarosa al 1% en el siguiente orden, utilizando 10 μL por escalera y 20 μL por plásmido:

CARRILMUESTRADIGERIR
1IPCsin cortar
2IPCD1
3M124SD1
4Marcador de 1 Kb
5IPCD2
6X # Z-1D2
7X # Z-2D2
8Marcador de 100 pb(si es relevante para el tamaño de su banda)
9X # Z-1sin cortar
10X # Z-2sin cortar

Una vez cargadas todas las muestras, se aplicará la energía (100 V durante 45 minutos) y se fotografiará el gel. Cuando el gel esté listo, comparará los tamaños de banda en la fotografía con los tamaños de banda esperados que calculó previamente. Mientras tanto, puede analizar sus datos de secuencia.

Parte 3: Analizar datos de secuencia

Su objetivo hoy es analizar los datos de secuenciación de tres muestras (dos colonias independientes de su mutante X # Z y un clon de M124S para la práctica) y luego decidir con qué colonia proceder para el mutante X # Z. Querrá tener a mano este documento de secuencia del día 4 (DOC) y para marcar la ubicación esperada de su mutación con texto en negrita antes de continuar. (Simplemente compárelo con su anotación del documento de secuencia de la IPC del día 1 (DOC) usando Word Count o la herramienta Find.) El nuevo archivo contiene la secuencia pericam inversa como antes, pero también las secuencias flanqueantes (del vector pRSET) antes y después de IPC, que están separadas de IPC por una línea en blanco. La segunda página del documento contiene el complemento inverso de IPC / pRSET, que se generó utilizando esta herramienta de sitio web "Secuencias de ADN inversas y / o complementarias."Asegúrese también de poner en negrita su codón mutante en la secuencia del complemento inverso.

A continuación, utilizaremos algunos datos del Instalación de biopolímeros del MIT. [Solo disponible para estudiantes matriculados en la clase, no accesible para usuarios de OCW.] Desde este enlace, podemos ver trazos de secuencia y texto de secuencia.

En lugar de mirar a través de la secuencia para encontrar mágicamente la parte relevante, puede alinear los datos que acaba de obtener con la secuencia estándar de pericam inversa y las diferencias se identificarán rápidamente. Hay varios programas basados ​​en la web para alinear secuencias y aún más programas que se pueden comprar. Los pasos para usar una herramienta basada en web se describen a continuación.

Alinear con "bl2seq" de NCBI

  1. Se puede acceder al programa de alineación a través del EXPLOSIÓN NCBI página o directamente desde esta Enlace.
  2. Para permitir espacios en la alineación de la secuencia, desmarque la casilla "filtro". Todas las demás configuraciones predeterminadas deberían estar bien.
  3. Pegue el texto de la secuencia de su ejecución de secuenciación en el cuadro "Secuencia 1". Esta será ahora la "consulta". Si hubo áreas ambiguas de los resultados de la secuenciación, se enumerarán como "N" en lugar de "A" "T" "G" o "C" y está bien incluir N en la consulta.
  4. Pegue la secuencia de pericam inversa en el cuadro "Secuencia 2". Para muestras probadas con el cebador directo, use la secuencia IPC regular; para aquellos que usan una imprimación inversa, debe colocar el complemento inverso. Qué alineación será más útil depende de la ubicación de su mutación.
  5. Haga clic en Alinear. Las coincidencias se mostrarán mediante líneas verticales entre las secuencias alineadas. Debería ver un gran flujo de coincidencias, seguido de muchos errores en los últimos ~ 200 pb de la secuencia; ignore la parte de los datos con errores, ya que es posible que no refleje con precisión su plásmido mutante. En este flujo de coincidencias, deben destacarse las 1-3 líneas faltantes que indican su codón mutante. Si no es así, utilice la herramienta de numeración o Buscar para localizar el codón apropiado.
  6. Debe imprimir una captura de pantalla de cada alineación en PDF (y en papel si lo desea). Estos se utilizarán para preparar una figura que muestre lo que encontró hoy.

Si ambas colonias de tu mutante tienen la secuencia correcta, lanza una moneda y procede con una u otra; lo mismo si ambos no son concluyentes. Si uno parece correcto y el otro no, por supuesto, proceda con el primero. Finalmente, si ambos están claramente equivocados, hable con un miembro del cuerpo docente.

Para su referencia, otro programa popular de alineación de secuencias es "CLUSTAL-W" de EMBL-EBI.

Parte 4: Observar colonias mutantes

La última vez transformó células BL21 (DE3) con tres plásmidos diferentes (dos candidatos para el mutante X # Z y un clon M124S). Compare la formación relativa de colonias de células que llevan los diferentes plásmidos. Si todas las placas tienen un crecimiento celular denso, no es necesario que obtenga un recuento exacto de colonias; simplemente haga todo lo posible para obtener una estimación relativa y describa cualquier hallazgo en su cuaderno.

Parte 5: Observación y recolección de células

  1. Después de ~ 2-3 horas, verterá 1,5 ml de cada tubo (de la Parte 1) en un eppendorf etiquetado y luego centrifugará durante 1 min. a máxima velocidad. ¡Guarde los otros 3 ml!
  2. Aspire el sobrenadante de cada eppendorf, usando una punta de pipeta amarilla nueva en el extremo de la pipeta de vidrio cada vez.
  3. Observe el color de cada uno de sus gránulos y compárelo con el ejemplo anterior. Si los gránulos de tipo salvaje y ambos mutantes aparecen de color amarillo verdoso a la vista, proceda de la siguiente manera:
    • NO arroje el resto de cultivos líquidos. Primero, mida su OD600 valores, de acuerdo con la parte 6 del protocolo de hoy.
    • A continuación, vierta 1,5 ml más del cultivo líquido relevante en la parte superior de cada sedimento, vuelva a girar y aspire el sobrenadante.
    • Los últimos 1,5 mL de cultivo se pueden aspirar en su matraz de vacío, para luego blanquearlos y desecharlos.
  4. Si uno o más de sus gránulos son blancos o solo de color tenue, pídale a un miembro del personal docente que le muestre el agitador rotatorio a temperatura ambiente. Continuará cultivando sus bacterias durante la noche. Mañana por la mañana, el profesorado recogerá sus pellets y los congelará. Como puede ver arriba, los sedimentos + IPTG provienen de 3 mL de cultivo, mientras que los sedimentos -IPTG provienen de 1.5 mL de cultivo.

Parte 6: Preparación para la próxima vez

La próxima vez, lisará sus muestras bacterianas para liberar sus proteínas y las ejecutará en un gel de proteína. Para comparar la cantidad de proteína en las muestras -IPTG versus + IPTG, le gustaría normalizar por el número de células. En este punto, puede tener solo tres muestras listas (solo -IPTG), o puede tener las seis. En cualquier caso, mida el OD600 de una dilución 1:10 de células para cada muestra terminada (para -IPTG ya lo ha hecho), y anote este número en su cuaderno. Luego centrifugue las células y aspire el sobrenadante. Entregar los gránulos celulares al profesorado; se almacenarán congelados. (Asegúrese de hacer una pastilla 2X para las muestras + IPTG).

Para la proxima vez

  1. Prepare una figura que represente los resultados de su resumen de diagnóstico. Tenga en cuenta las mejores prácticas para las figuras que hemos discutido, desde el contenido hasta la presentación. Por ejemplo, el contenido debe incluir los tamaños de banda esperados y la presentación debe incluir el etiquetado de los carriles, así como algunas bandas de referencia.
  2. Escriba algunas frases del texto de la sección de resultados para acompañar su figura de resumen de diagnóstico.
  3. El día 6 de este módulo será intenso y tiene el potencial de durar mucho. Se hará un gran servicio si lee detenidamente el texto con anticipación, luego considera qué preparativos tendrá que hacer ese día y organice sus pensamientos en su cuaderno y / o con su pareja. Esta parte no se recopilará ni evaluará.
  4. La revisión del informe del Módulo 1 vence la próxima vez a las 11 a. M.

Lista de reactivos

  • IPTG (isopropil β-D-1-tiogalactósido), 0,1 M
  • Carga de tinte
    • 0,25% de xileno cianol
    • 30% de glicerol
    • ARNasa
  • Geles de agarosa al 1% y al 1,2% con 0,3 μg / ml de bromuro de etidio
  • Geles fabricados y procesados ​​en tampón TAE 1X
    • Tris de 40 mM
    • Ácido acético 20 mM
    • EDTA 1 mM, pH 8,3

Mecanismos de acción del acetaldehído en la regulación positiva del gen del colágeno α2 (I) humano en las células estrelladas hepáticas: funciones clave de Ski, SMAD3, SMAD4 y SMAD7

La fibrosis hepática inducida por el alcohol y eventualmente la cirrosis es una de las principales causas de muerte. El acetaldehído, el primer metabolito del etanol, regula al alza la expresión del gen del colágeno α2 (I) humano (COL1A2). Los primeros efectos mediados por acetaldehído implican la fosforilación y la translocación nuclear de complejos que contienen SMAD3 / 4 que se unen al promotor COL1A2 para inducir la fibrogénesis. Usamos células estrelladas hepáticas humanas y de ratón para dilucidar los mecanismos por los cuales el acetaldehído regula positivamente COL1A2 modulando el papel de Ski y la expresión de SMADs 3, 4 y 7. El acetaldehído indujo la regulación positiva de COL1A2 3,5 veces, con concomitante aumentos en los niveles de ARNm (tres veces) y proteínas (4.2 y 3.5 veces) de SMAD3 y SMAD4, respectivamente. También provocó una disminución del 60% en la expresión de SMAD7. Ski, un miembro de la familia de oncogenes Ski / Sno, está colocalizado en el núcleo con SMAD4. El acetaldehído induce la translocación de Ski y SMAD4 al citoplasma, donde Ski sufre degradación proteasomal, como lo confirma la capacidad del inhibidor proteasómico lactacistina para mitigar la regulación positiva de COL1A2 dependiente de acetaldehído, pero no del gen de fibronectina inespecífico (FN1). Concluimos que el acetaldehído regula al alza COL1A2 al mejorar la expresión de los transactivadores SMAD3 y SMAD4 mientras inhibe el represor SMAD7, junto con la promoción de la translocación de Ski desde el núcleo al citoplasma. Especulamos que los fármacos que previenen la degradación proteasomal de los represores que se dirigen a COL1A2 pueden tener propiedades antifibrogénicas.

Copyright © 2014 Sociedad Estadounidense de Patología en Investigación. Publicado por Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.

Cifras

Efecto del acetaldehído, TGF-β1 o…

Efecto del acetaldehído, TGF-β1 o los dos en combinación sobre la expresión de…

TGF-β1 está involucrado en tarde ...

TGF-β1 está involucrado en la regulación positiva tardía dependiente de acetaldehído de COL1A2 . Ensayos de transcripción continuos ...

Aumento de SMAD3 y SMAD4…

El aumento de ARNm y proteínas de SMAD3 y SMAD4 se retrasa después del tratamiento con acetaldehído.…

SMAD3 y SMAD4 son limitantes ...

SMAD3 y SMAD4 son factores limitantes para la mediada por acetaldehído COL1A2 regulación al alza en las HSC. Efecto…

El acetaldehído modula la expresión de SMAD7. A:…

El acetaldehído modula la expresión de SMAD7. A: El ARN total se obtuvo de HHSC cultivadas en…

El acetaldehído modifica la distribución celular de…

El acetaldehído modifica la distribución celular de Ski. Microscopía de inmunofluorescencia de células madre hematopoyéticas de ratón cultivadas en…

El acetaldehído y el TGF-β1 regulan negativamente el…

El acetaldehído y el TGF-β1 regulan negativamente la expresión de Ski en las HSC. ANUNCIO: Análisis occidental ...

Ski y SMAD4 se ubican en…

Ski y SMAD4 se colocalizan en los núcleos de las HSC y se trasladan al…

Lactacistina, un inhibidor del proteasomal ...

La lactacistina, un inhibidor de la degradación proteasomal, inhibe la expresión mediada por acetaldehído de COL1A2 reportero impulsado por un promotor ...

Lactacistina bloquea mediada por acetaldehído COL1A2 gene…

Lactacistina bloquea mediada por acetaldehído COL1A2 transcripción génica, pero no transcripción génica de fibronectina mediada por acetaldehído. A…


Abstracto

La mutagénesis dirigida al sitio y la espectroscopia de fluorescencia resuelta en el tiempo se utilizaron para evaluar las contribuciones de las cadenas laterales de aminoácidos individuales a la unión de las plantillas de cebadores de ADN al sitio de exonucleasa 3'-5 'del fragmento proteolítico grande (fragmento de Klenow) de ADN. polimerasa I. Se introdujeron mutaciones en cadenas laterales que se ha demostrado cristalográficamente que están muy próximas a un extremo 3 'de ADN unido al sitio de exonucleasa 3'-5'. Los residuos de tipo salvaje fueron reemplazados por alanina en cada caso. Para evaluar los efectos de las mutaciones en la unión del ADN, se realizaron mediciones de anisotropía de fluorescencia resueltas en el tiempo en plantillas de cebadores marcadas con dansyl unidas a las enzimas mutantes. A diferencia de las técnicas que simplemente controlan la unión general de proteínas al ADN, se utilizó la técnica de anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo para determinar las ocupaciones fraccionales de los sitios activos de la polimerasa y la exonucleasa 3 '-5' del fragmento de Klenow. Se obtuvieron constantes de equilibrio que describen el reparto del ADN entre los dos sitios activos para nueve enzimas mutantes diferentes unidas a secuencias de ADN coincidentes y no coincidentes. Las mutaciones de Leu361 y Phe473 causaron los efectos más grandes, desestabilizando significativamente la unión de sustratos de ADN no emparejados al sitio de exonucleasa 3'-5 'en relación con el ADN unido en el sitio de la polimerasa, de acuerdo con los datos estructurales que muestran que las cadenas laterales de estos residuos están involucradas. en interacciones hidrofóbicas íntimas con las bases 3 'terminal y penúltima de la cadena del cebador [Beese, L. y Steitz, TA (1991) EMBO J. 10, 25-33]. Las mutaciones de las cadenas laterales His660 y Glu357 también resultaron en efectos significativos sobre la unión del ADN mal emparejado al sitio de la exonucleasa 3 '-5'. Sorprendentemente, la mutación de Tyr497 aumentó la partición del ADN desajustado en el sitio de la exonucleasa 3'-5 ', lo que sugiere que la cadena lateral de tirosina en la enzima de tipo salvaje desestabiliza la unión del sustrato, a pesar de los datos cristalográficos que muestran que Tyr497 tiene un enlace H al ADN sustrato. Los efectos de la mutación de las cadenas laterales de aminoácidos que sirven como ligandos a dos iones metálicos divalentes unidos al sitio de la exonucleasa 3'-5 ', designado A y B, indicaron que el metal A también ayuda a unir el ADN al 3'-5' sitio de exonucleasa. Estos resultados demuestran que la técnica de anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo se puede utilizar para cuantificar las contribuciones energéticas asociadas con cada uno de los contactos ADN-proteína definidos cristalográficamente en el sitio de la exonucleasa 3 '-5'.


Agentes caotrópicos

Un agente caotrópico es una sustancia que desnaturaliza proteínas, ADN o ARN al alterar la estructura tridimensional de la molécula. Los agentes caotrópicos interfieren con la estabilización de interacciones intramoleculares que están mediadas por fuerzas no covalentes como enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals y efectos hidrófobos. Los agentes caotrópicos comúnmente usados ​​incluyen urea (6–8 M), guanidina HCL (6 M) y perclorato de litio (4.5 M). El tiocianato de guanidina es un potente desnaturalizante de proteínas que es más fuerte que la guanidina HCl y se usa a menudo durante el aislamiento de ácido ribonucleico intacto para eliminar la actividad de la RNasa. Muchos protocolos de aislamiento de ARN incluyen la adición de mercaptoetanol, además de un caótropo, para proporcionar un entorno reductor que desnaturalice los cuatro puentes disulfuro formados entre los ocho residuos de cisteína de Ribonucleasa A (RNasa A). La combinación de un agente caotrópico y un agente reductor como el mercaptoetanol hace que la ribonucleasa se despliegue y pierda por completo su actividad.


& ltp> Esta sección proporciona información sobre la ubicación y topología de la proteína madura en la célula. & ltp> & lta href = '/ help / subcellular_location_section' target = '_ top'> Más. & lt / a> & lt / p> Ubicación subcelular i

Citoplasma y citosol

Afirmación manual basada en el experimento en i

Núcleo

Afirmación manual basada en el experimento en i

Aserción manual inferida de la similitud de secuencia ai

Afirmación manual basada en el experimento en i

Núcleo
Otras localizaciones

Palabras clave: componente celular i


Resultados

Inducción del daño del ADN por peróxido de hidrógeno

Daño y reparación del ADN en células FA tratadas con H2O2 se evaluaron midiendo tanto 8-OHdG en ADN (análisis HPLC-EC) como roturas de ADN en núcleos intactos (ensayo SCGE).

El análisis del contenido de 8-OHdG en el ADN de las células no tratadas mostró un aumento del nivel basal de daño oxidativo del ADN en las células de los grupos de complementación FA-C y FA-E (Tabla I). H2O2 el tratamiento dio como resultado un aumento del nivel de 8-OHdG en el ADN de todas las líneas celulares. Todas las líneas celulares FA fueron más susceptibles a este agente que los linfoblastos normales. La integración de los datos cinéticos para la reparación de 8-OHdG mostró que la capacidad de eliminar este aducto se redujo para todas las líneas celulares FA examinadas, sin embargo, esta diferencia fue estadísticamente significativa solo para FA-A y FA-E (Figura 1) . Es de destacar que las dos líneas celulares corregidas se comportaron de manera bastante similar a los controles, tanto en las fases de inducción como de reparación del proceso.

El ADN se rompe en FA y células normales tratadas con H2O2, fueron evaluados por el ensayo SCGE (Figura 2). La longitud de la cola de los cometas fue muy similar tanto inmediatamente después del tratamiento como en dos momentos posteriores al tratamiento, lo que indica que el daño se indujo en un grado similar y se reparó a un ritmo similar en todas las líneas celulares.

Para investigar si la eliminación de un H específico2O2-El daño inducido podría ser defectuoso en las células FA, se utilizó una modificación del ensayo cometa. Los sitios sensibles a la endonucleasa III, una enzima que reconoce las pirimidinas dañadas, se midieron en diferentes momentos después del tratamiento (Figura 3). El análisis de regresión lineal mostró que todas las líneas celulares fueron capaces de eliminar eficazmente las pirimidinas dañadas. La tasa de eliminación fue algo menor en FA-E en comparación con las otras líneas celulares, pero esta diferencia no fue estadísticamente significativa.

Ensayo de micronúcleos

El ensayo de micronúcleos se utilizó para evaluar el daño cromosómico inducido por H2O2. Los resultados, presentados en la Tabla II, mostraron que el nivel de micronúcleo basal es aproximadamente un orden de magnitud mayor en las líneas de células FA que en los linfoblastos normales. Este hallazgo se informó anteriormente en fibroblastos de pacientes con AF (Raj et al., 1980) y está de acuerdo con el aumento del nivel de roturas cromosómicas que se encuentran normalmente en las células FA. En las células FA-C corregidas por el gen defectuoso, se restaura un nivel normal de micronúcleos.

Después de H2O2 Durante el tratamiento, las frecuencias de micronúcleos fueron 1,5 veces más altas en FA que en células normales o corregidas por FA-C, pero no se encontraron diferencias en el aumento neto (controles restados) de micronúcleos entre todas las líneas celulares examinadas. El índice mitótico no varió notablemente entre las líneas celulares estudiadas, ni fue influenciado por la H2O2 tratamiento.

Los micronúcleos pueden generarse mediante fragmentos cromosómicos o mediante la segregación incorrecta de cromosomas completos. Para investigar si podrían existir diferencias en el origen de los micronúcleos entre los FA y los linfoblastos normales, se examinaron las muestras para determinar la presencia de secuencias α-centroméricas en los micronúcleos, que luego se distinguieron como micronúcleos C–, fragmentos cromosómicos y micronúcleos C +, que contienen micronúcleos cromosómicos. Regiones centroméricas. Los resultados informados en la Tabla III muestran que las células normales y con corrección de FA contienen una proporción igual de micronúcleos C– y C +. Sin embargo, la mayoría de los micronúcleos en líneas celulares FA no tratadas y en H2O2las células normales tratadas se originaron a partir de fragmentos cromosómicos.

Ciclo celular y apoptosis

La acción de H2O2 sobre el ciclo celular y su capacidad para inducir apoptosis se determinaron por análisis FACS y por formación de escalera de ADN, respectivamente.

En el análisis FACS, la diferencia en el porcentaje de células en el G2 Se evaluó la fase del ciclo celular entre las células de control y las tratadas. Se utilizó MMC como control positivo. Como era de esperar (Tabla IV), las líneas celulares FA se vieron afectadas por MMC en mayor grado si se comparan con las líneas celulares normales. La reversión de genes mutantes restauró el fenotipo normal. Se encontró una situación diferente con H2O2. Primero, las diferencias entre las líneas celulares normales y FA no fueron tan marcadas. Además, el inducido G2 el retraso fue más marcado en el FA corregido que en las líneas celulares de FA correspondientes.

Cuando se evaluaron las células para determinar la formación de una escalera de ADN, no se observó ninguna escalera en las líneas celulares FA-C, FA-E y FA-C corregida, mientras que las líneas celulares normales, FA-A y FA-A corregidas mostraron la escalera de ADN típica, indicativa de fragmentación (Figura 4).

Evaluar si el comportamiento de las células FA-C se debió a un defecto en el mecanismo apoptótico o fue específico para H2O2 tratamiento, se probó el efecto de un agente apoptótico diferente, VP16: el efecto sobre las células FA-C no era específico para H2O2, ya que no se indujo formación de escalera ni siquiera con VP16 (datos no mostrados).


FKBP

Regulación endógena

Expresión de proteínas

Se demostró que la expresión proteica de FKBP52 estaba regulada por el crecimiento Doucet-Brutin et al (1995). Las proteínas de unión a FK506 se expresaron con éxito como proteínas de fusión con GST, por ejemplo, FKBP12 Chambraud et al (1996) y FKBP13 Walensky et al (1998).

Transcripción / Traducción

El ARNm de FKBP13 se induce en condiciones que mal pliegan proteínas en el retículo endoplásmico Bush et al (1994).

Expresión del desarrollo

FKBP65 está regulado por el desarrollo Patterson et al (2000).

Socios proteicos

Algunas proteínas de unión a FK506 interactúan específicamente con receptores como los canales de calcio de rianodina o los complejos de receptores de esteroides inactivados (revisado por Schiene-Fischer y Yu (2001)). Se describieron otras proteínas asociadas específicas para las FKBP: p. Ej., FKBP13 interactúa con un homólogo de la proteína citoesquelética de la membrana del eritrocito 4.1 Walensky et al (1998) la FKBP25 nuclear se asocia funcionalmente con histonas desacetilasas y con el factor de transcripción YY1 Yang et al (2001) FKBP52 y otras FKBP interactúan con una proteína asociada a FKBP recientemente identificada, FAP48 Chambraud y col. (1996). La tropoelastina es un ligando de FKBP65 Davis y col. (1998).


Abstracto

Las afinidades de unión de las interacciones proteína-ácido nucleico podrían alterarse debido a mutaciones de sentido erróneo que ocurren en las proteínas de unión al ADN o al ARN, lo que resulta en diversas enfermedades. Desafortunadamente, todavía falta una comparación y predicción sistemática de los efectos de las mutaciones en las interacciones proteína-ADN y proteína-ARN (estas dos clases de mutación se denominan MPD y MPR, respectivamente). Aquí, demostramos que estas dos clases de mutaciones podrían generar tendencias similares o diferentes para unir cambios de energía libre en términos de las propiedades de los residuos mutados. Luego, desarrollamos algoritmos de regresión por separado para MPD y MPR mediante la introducción de características de energía basadas en particiones geométricas novedosas y características estructurales basadas en interfaces. A través de la selección de características y el aprendizaje por conjuntos, se establecieron marcos computacionales similares que integraron modelos basados ​​en energía y no energéticos para estimar los cambios de afinidad de unión resultantes de MPD y MPR, pero las características seleccionadas para los modelos finales fueron diferentes y, por lo tanto, reflejaron la especificidad de estos. dos clases de mutaciones. Además, la metodología propuesta se amplió a la identificación de mutaciones que disminuyeron significativamente las afinidades de unión. Las validaciones exhaustivas indicaron que nuestro algoritmo generalmente funcionó mejor que los métodos de última generación tanto en las tareas de regresión como en las de clasificación. El servidor web y el software están disponibles gratuitamente en http://liulab.hzau.edu.cn/PEMPNI y https://github.com/hzau-liulab/PEMPNI.


Departamento de bioquímica

Nombre: Manuel Ascano, Jr.
Título: Profesor Asistente de Bioquímica, Profesor Asistente de Patología, Microbiología e Inmunología
Departamento: Bioquímica
Dirección de la oficina: 632 RRB
Número de teléfono: 615-875-8714
Correo electrónico: [email protected]
URL del laboratorio: https://medschool.vanderbilt.edu/ascano-lab
PubMed: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?cmd=search&term=ascano+manuel+OR+ascano+M+jr

Palabras clave de investigación: ARN, proteínas de unión a ARN, interacciones ARN-proteína, PAR-CLIP, entrecruzamiento de ARN-proteína, regulación génica postranscripcional, PTGR, inmunidad innata, detección de ADN, estrés celular

Especialidad de investigación: Regulación génica postranscripcional en la inmunidad innata y el estrés celular

Descripción de la investigación: El flujo de información genética del ADN al ARN y a la proteína requiere la orquestación de proteínas especializadas que se unen a los ARN y los regulan. El genoma humano codifica más de 1.400 proteínas de unión a ARN, la mayoría de cuyas funciones se desconocen a pesar de su importancia durante el desarrollo y en enfermedades humanas específicas. Los procesos mediante los cuales las proteínas de unión al ARN regulan el ARN, conocidos colectivamente como regulación génica postranscripcional, permiten que las células se adapten rápidamente a las señales ambientales cambiantes, de modo que los programas de expresión génica y, por lo tanto, la función celular se ajusten con precisión. For example, post-transcriptional gene regulatory processes serve to mitigate the effects of deleterious stresses that can potentially usurp or disrupt gene expression in cases of bacterial or viral infection, when foreign nucleic acids are introduced into cells. The post-transcriptional mechanisms that prevent aberrant or pathogen gene expression, while still coordinating the expression of host-specific innate immune- and stress-activated genes, remains poorly understood.

My laboratory is currently focused on two research areas:

1) To identify and functionally characterize the critical RNA-binding proteins utilized by cells during periods of nucleic acid-induced stress and innate immune gene activation.

A key prerequisite for characterizing the function of RNA-binding proteins is to identify its stress-regulated binding targets. My laboratory utilizes RNA biochemistry and molecular biology, in conjunction with modern high-throughput technologies such as PAR-CLIP, to elucidate RNA-protein interactions and gene regulatory function at a transcriptome-wide level. As a complementary approach, we investigate the composition and function of RNA-binding protein complexes (ribonucleoprotein particles) that assemble on specific stress-induced host- or pathogen-encoded transcripts, to understand how such relationships are important for host-cell response and survival.

2) To characterize the components and signaling mechanism of a major cytosolic DNA-sensing pathway.

Detection of cytosolic DNA potently activates multiple signaling pathways leading to the transcriptional activation of interferon and stress-activated genes. Thus, the cellular response and gene expression changes associated with DNA-sensing is an ideal model for investigating stress-induced post-transcriptional gene regulatory processes. My laboratory focuses on the innate immune signaling pathway initiated by the DNA sensor and nucleotidyl transferase superfamily member cyclic GMP-AMP synthase, cGAS. Binding of cytosolic DNA to cGAS leads to its production of cyclic GMP-AMP (cGAMP), which I discovered to be the founding member of metazoan cyclical second messenger molecules containing mixed phosphodiester bonds (2’,5’ and 3’,5’). We examine the mechanism of cGAS activation by structure-function and cell biological studies. My laboratory also investigates how natural and synthetic cyclic dinucleotides and related analogs promote innate immune gene activation through the only known cGAMP receptor, Stimulator of interferon genes (STING).


A form of gene expression maintenance in which the heritable state of gene activity neither requires the continuous presence of the initiating signal nor involves changes in the DNA sequence.

(HOX genes). A family of genes that encode transcription factors which are essential for patterning along the anterior–posterior body axis.

The consequences of mutations that lead to the transformation of the identity of one body segment into the identity of another.

(Su(var)3-9, Enhancer of Zeste, Trithorax). A motif ∼ 130 amino acids in length that provides histone methyltransferase activity. It is found in many chromatin-associated proteins, including some Trithorax group and Polycomb group proteins.

A family of histone acetyltransferases that is defined by the founding members Moz, Ybf2 (Sas3), Sas2 and Tip60.

An intracellular signal transduction pathway involving RAS. RAS activates many signalling cascades involved in multiple developmental events controlling cell proliferation, migration and survival.

(Switch/sucrose nonfermentable). A chromatin-remodelling complex family that was first identified genetically in yeast as a group of genes required for mating type switching and growth on alternative sugar sources to sucrose. This complex is required for the transcriptional activation of ∼ 7% of the genome.

A conserved protein module, which was first identified in the Drosophila melanogaster protein Brahma and has subsequently been found in many chromatin-associated proteins. This domain can recognize acetyl-Lys motifs.

A conserved histone-binding domain that takes its name from the proteins in which it was initially identified: Swi3, ADA2, N-CoR and TFIIB.

(NURF). A chromatin-remodelling complex identified in Drosophila melanogaster and belonging to the imitation switch subfamily.

A motif of ∼ 60 amino acids that is found in many chromatin-associated proteins and forms a binding pocket for methylated histone residues.

Bivalent chromatin domains

Domains that are characterized by the juxtaposition of active and inactive epigenetic histone marks.

(PHD finger). A PHD-linked zinc-finger that chelates double zinc ions. This protein motif is found in many chromatin regulators and binds histones in a methylation-dependent or -independent manner.

This term describes the fact that post-translational modifications on one histone tail can influence those on another, even when they are located on different histones, resulting in a specific gene expression output.

(Cyclin-dependent kinase inhibitor). Members of the CIP and KIP family of CDKIs (p21, p27 and p57) inhibit CDK2- and CDK1-containing complexes, and members of the INK4 family (p15, p16, p18 and p19) inhibit cyclin D-containing complexes. Expression of CDKIs generally causes growth arrest and, when CDKIs are acting as tumour suppressors, may cause cell cycle arrest and apoptosis.

(Skp–cullin–F box and anaphase-promoting complex (also known as the cyclosome)). Multiprotein E3 ubiquitin ligase complexes that are involved in the recognition and ubiquitylation of specific cell cycle target proteins for proteasomal degradation.

Enzymes that target specific proteins for degradation by the proteasome by causing the attachment of ubiquitin to Lys residues on their substrates.

A change undergone by animal cells, caused by escape from control mechanisms (for example, upon infection by a cancer-causing virus). Transformed cells have increased growth potential, alterations in cell surface, karyotypic abnormalities and the ability to invade and metastasize.

(Ataxia-telangiectasia- and RAD3-related). A caffeine-sensitive, DNA-activated protein kinase that is involved in DNA damage checkpoints.

Radioresistant DNA synthesis

(RDS). When mutant cells fail to repress the firing of DNA replication origins in the presence of ionizing radiation-induced DNA damage.

This pathway is a highly conserved intercellular signalling mechanism that is essential not only for cell proliferation but also for numerous cell fate-specification events.

Extracellular signal-regulated kinase

(ERK). A protein involved in a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway that functions in cellular proliferation, differentiation and survival. Its inappropriate activation is a common occurrence in the human cancers.

The rapid phosphorylation of histone H3 that occurs concomitantly with the induction of immediate early genes, which is mediated through alternative mitogen-activated protein kinase cascades.

A signalling pathway involving widely conserved secreted signalling molecules of the Wingless family, which regulate many processes during animal development.

(Janus kinase–signal transducer and activator of transcription). A rapid signal transduction pathway used by a range of cytokines and growth factors. Binding of a cytokine or growth factor to its receptor activates cytoplasmic JAK, which then phosphorylates STAT and triggers its translocation into the nucleus, where it induces the transcription of specific genes.

(NPCs). A stem cell type found in adult neural tissue that can give rise to neuron and supporting cells (glia). During development, NPCs produce the enormous diversity of neurons and glia in the developing central nervous system, and they have been also shown to engage in the replacement of dying neurons.

(LT-HSCs). Haematopoietic stem cells that have long-term regeneration capacities and can restore the haematopoietic system of an irradiated mouse over months.

(ST-HSCs). Haematopoietic stem cells that, under normal circumstances, cannot renew themselves over a long term. They are also referred to as progenitor or precursor cells, as they are relatively immature cells that are precursors to a fully differentiated cell of the same tissue type.


Ver el vídeo: Interacción ADN-proteína y replicación de ADN (Febrero 2023).