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¿Por qué utilizar neuronas embrionarias para estudiar los knockouts / mutantes de proteínas en la potenciación a largo plazo?

¿Por qué utilizar neuronas embrionarias para estudiar los knockouts / mutantes de proteínas en la potenciación a largo plazo?


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Solo me preguntaba si alguien tenía algunas ideas sobre la pregunta del título. Me pregunto por qué algunos artículos usan cultivos embrionarios de regiones cerebrales específicas para neuronas para probar los efectos de los knockouts / mutaciones en la plasticidad sináptica (por ejemplo, potenciación a largo plazo, LTP) en lugar de cultivos adultos.

Muchas gracias


Algunas sugerencias, puede haber más:

1) El nocaut puede no ser viable hasta la edad adulta (los animales mueren). Quizás los heterocigotos sean viables, pero para probar el knockout completo se necesita un homocigoto.

2) Incluso si el knockout es viable hasta la edad adulta, el cerebro puede desarrollar adaptaciones al knockout que no son específicas del knockout en sí: regulación hacia arriba o hacia abajo de ciertos canales, por ejemplo.

3) La plasticidad se regula al alza en los cerebros en desarrollo en comparación con los cerebros adultos, por lo que los efectos pueden ser más pronunciados en el tejido joven.

4) Cultivos de tejidos más jóvenes mejor: puede mantener las células vivas por más tiempo y más fácilmente.

También es bueno tener en cuenta que las células madre indiferenciadas tienden a ser "predeterminadas por neuronas", es decir, si solo cultivas células madre embrionarias y no les haces nada especial, tenderán a generar células similares a neuronas. En el adulto, las neuronas siempre estarán junto a otros tipos de células: glía, tejido vascular, etc.


Interrupción genómica dirigida de H-ras y N-ras, Individualmente o en combinación, revela la capacidad de ambos loci para el crecimiento y desarrollo del ratón

Centro de Investigaci & # x000f3n del C & # x000e1ncer, IBMCC, CSIC-USAL, Universidad de Salamanca, Salamanca, 1 y Departamento Bioqu & # x000edmica y Biolog & # x000eda Molecular, Universidad de Extremadura, Badajoz, 4 España Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Nacional Instituto del Cáncer, 2 y Laboratorio de Biología Molecular, Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares, 3 Bethesda, y Sección de Patología Veterinaria y Tumoral, Instituto Nacional del Cáncer, Frederick, 6 Maryland y Departamento de Patología y Centro Oncológico Kaplan, Centro Médico de la Universidad de Nueva York , Nueva York, Nueva York 5

Carlos Vicario-Abej & # x000f3n

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Pedro Fern & # x000e1ndez-Salguero

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Alberto Fern & # x000e1ndez-Medarde

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Nalini Swaminathan

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Kate Yienger

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Eva Lopez

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Marcos Malumbres

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Ron McKay

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Jerrold M. Ward

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Ángel Pellicer

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Eugenio Santos

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1. Introducción

L1cam es un gen ligado al cromosoma X que codifica la molécula de adhesión de células neurales L1. L1cam es un miembro de la superfamilia de genes de inmunoglobulina transmembrana y uno de los cuatro genes en el L1cam subfamiliaChl1, Nrcam, Nfasc, y L1cam sí mismo). L1cam y sus otros miembros de la subfamilia se expresan ampliamente en el sistema nervioso en desarrollo y adulto (Allen Brain Atlas). Se sabe que L1 en particular juega un papel esencial durante el neurodesarrollo (Kenwrick et al., 2000 Hortsch et al., 2014 Sytnyk et al., 2017).

El dominio extracelular de L1 puede interactuar con muchos otros ligandos y receptores de la superficie celular y su dominio intracelular puede activar cascadas de señalización. En los seres humanos, la pérdida de ingeniería L1CAM La expresión en neuronas cultivadas derivadas de ES conduce a déficits en la arborización axonal y dendrítica (Patzke et al., 2016). Más de 350 mutaciones hereditarias y espontáneas en L1CAM, que se predice que conducirán a la pérdida de la función L1, se han identificado en la población humana (NIH, Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU., Genetics Home Reference). Estas mutaciones a menudo conducen al & # x0201cL1 síndrome & # x0201d, casi exclusivamente en varones debido a la naturaleza ligada al cromosoma X de L1CAM. Los individuos afectados exhiben una variedad de defectos del sistema nervioso con las manifestaciones más comunes que incluyen hidrocefalia debido a estenosis, paraplejía espástica tipo 1, marcha anormal, agenesia del cuerpo calloso, afasia y discapacidades intelectuales (incluyendo autismo y esquizofrenia) (Wong et al., 1995) Christaller et al., 2017).

Este espectro de defectos del sistema nervioso humano se superpone con el espectro observado en L1cam ratones y ratas knockout. L1cam Los roedores knockout exhiben hidrocefalia y ventrículos agrandados, control motor de las extremidades traseras deteriorado, cuerpo calloso reducido y tractos corticoespinales, mayor letalidad perinatal, tamaño corporal más pequeño, defectos cerebelosos y otros déficits neurológicos (Dahme et al., 1997 Cohen et al., 1997 Fransen et al., 1998 Emmert et al., 2019). La importancia de L1 para el desarrollo del sistema nervioso se conserva más allá de los vertebrados. En el gusano C. elegans, por ejemplo, el homólogo L1 SAX-7 es necesario para el posicionamiento y ramificación de neuronas (Dong et al., 2013 Salzberg et al., 2013 Diaz-Balzac et al., 2015 Zou et al., 2016 Yang et al., 2019).

En gusanos y moscas de la fruta, el crecimiento y ramificación de axones y dendritas en algunos casos está mediado por una interacción entre L1 y los homólogos de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) (Diaz-Balzac et al., 2015 Forni et al., 2004 ). Una interacción L1-FGFR para promover la maduración neuronal se extiende a las células de mamíferos, como se muestra en varios ensayos de cultivo definidos (Doherty y Walsh, 1996 Saffell et al., 1997) y en la proliferación y movilización de células de glioblastoma (Anderson y Galileo, 2016) . L1 puede actuar como un ligando que activa no solo los FGFR, sino también los receptores de neurotrofinas (Colombo et al., 2014). Los FGFR y los receptores de neurotrofinas desempeñan múltiples funciones a lo largo del neurodesarrollo (Guillemot y Zimmer, 2011 H & # x000e9bert, 2011 Park y Poo, 2013). Además, los receptores de FGF y neurotrofina son importantes para promover múltiples pasos de la neurogénesis del hipocampo en la circunvolución dentada del adulto (DG) donde la actividad de FGFR es necesaria y suficiente para promover tanto la neurogénesis como la dendritogénesis y la actividad del receptor de tirosina quinasa B (TRKB) promueve la maduración de las dendritas ( Kang y H & # x000e9bert, 2015 de Vincenti et al., 2019).

Sin embargo, se desconoce hasta qué punto L1 juega un papel coincidente con el de los FGFR y TRK en el DG adulto. Basándonos en los roles esenciales de L1 & # x02032 durante el neurodesarrollo entre especies y, en algunos casos, su acción directa a través de los receptores de tirosina quinasa, planteamos la hipótesis de que L1 es necesaria para uno o más pasos en el linaje de diferenciación de las neuronas recién nacidas en el hipocampo DG adulto. Usando varias líneas de mouse Cre-driver para eliminar condicionalmente L1cam En diferentes tipos de células del linaje neurogénico y las neuronas circundantes, encontramos defectos en la producción de neuronas, la dendritogénesis y el comportamiento, lo que sugiere que L1 es fundamental no solo durante la neurogénesis del desarrollo, sino también durante la neurogénesis del hipocampo del adulto.


Capítulo 184 - Efectos de los knockouts de la proteína quinasa dependiente de cGMP

Las proteína quinasas cíclicas dependientes de GMP (cGK) son serina / treonina quinasas que son activadas por el segundo mensajero cGMP. El término amino de cGKI está codificado por dos exones usados ​​alternativamente, lo que da como resultado la producción de dos isoformas de cGKI, cGKIα y cGKIβ. El óxido nítrico (NO) y el péptido natriurético auricular (ANP) estimulan la síntesis de GMPc y relajan las pequeñas arterias y arteriolas, lo que provoca una disminución de la presión arterial. La inactivación dirigida del gen del receptor de la NO-sintasa III (NOS III), ANP o ANP provocó hipertensión. El NO es de gran importancia para la homeostasis de las interacciones plaquetas-endotelio y plaquetas-plaquetas al inhibir la adhesión de plaquetas al endotelio lesionado y la activación y agregación plaquetarias. La cGKI plaquetaria es esencial para prevenir la adhesión intravascular y la agregación de plaquetas después de la isquemia, probablemente al inhibir la activación del receptor de fibrinógeno plaquetario, la glicoproteína IIb-IIIa. Lo más probable es que estos efectos de cGKIβ estén mediados por IRAG y una liberación reducida de Ca 2+ de las reservas intracelulares. cGKI juega un papel importante para la homeostasis cardiovascular y gastrointestinal, y tiene funciones discretas en el sistema nervioso central y periférico. La deleción del gen cGKI altera la relajación inducida por NO / cGMP del músculo liso del pene, lo que conduce a disfunción eréctil, pero no afecta la motilidad y fertilidad de los espermatozoides. Además, la relajación dependiente de NO / cGMP del músculo liso del tracto urinario se suprime en mutantes nulos de cGKI. La cGKII regula el crecimiento óseo longitudinal, el transporte de iones intestinales y la liberación de renina en el riñón, y puede estar involucrado en la generación de comportamientos complejos como ansiedad y adicción.


Resultados

Expresión y caracterización de isoformas mutantes de efrinaB2

En una comunicación anterior (Makinen et al., 2005), habíamos demostrado que las isoformas efrinaB2 5Y y efrinaB2 & # x00394V mutantes se expresaban a niveles iguales en lisados ​​de cerebro adulto, se fosforilaban tirosina en grados similares en lisados ​​de proteínas embrionarias y se expresaban en la superficie celular de las células transfectadas a niveles similares en comparación con la efrinaB2 de tipo salvaje. Aunque esto fue una fuerte evidencia de la focalización subcelular normal de la proteína efrinaB2 mutante, ahora investigamos la expresión superficial y el comportamiento de agrupamiento de la efrinaB2 endógena en neuronas cultivadas. Se establecieron cultivos de neuronas del hipocampo a partir de embriones knock-in homocigotos de control (en E16.5) que expresan efrina B2 de tipo salvaje (ephrinB2 PESO / PESO ), o isoformas de efrinaB2 mutante (ephrinB2 5Y / 5Y y efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V ). Después de 2 DIV, usamos proteína de fusión soluble EphB4-Fc para inducir específicamente agrupaciones de proteínas ephrinB2. En presencia de la proteína Fc de control, no se indujeron agrupaciones de efrinaB2 (datos no mostrados). Se visualizaron agrupaciones de proteínas endógenas de efrinaB2 mediante tinción frente a la porción Fc de EphB4-Fc y se cuantificaron utilizando el software MetaMorph. No detectamos diferencias marcadas en las densidades y tamaños de los grupos de efrinaB2 en las neuronas que expresan las isoformas de efrinaB2 mutante en comparación con la efrinaB2 de tipo salvaje (Fig. A & # x02013E). Tinción de efrinaB2 nocauts condicionales [ephrinB2-Nestincre (Grunwald et al., 2004)] con EphB4-Fc no revelaron agrupaciones fluorescentes, lo que indica una unión específica a ephrinB2 (Fig. S1 suplementaria, disponible en www.jneurosci.org como material suplementario). Estos hallazgos sugieren que la mayoría de las proteínas mutantes de efrinaB2 fueron transportadas a las ubicaciones subcelulares apropiadas en las neuritas del hipocampo. Para visualizar directamente efrinaB2 endógena en la sinapsis CA3 & # x02013CA1, aplicamos análisis microscópico inmunoelectrónico utilizando un anticuerpo efrinaB2 específico (Fig.1 F & # x02013H). Usando esta técnica, habíamos demostrado previamente que el etiquetado de efrinaB2 en el lado postsináptico se redujo casi cuatro veces en efrinaB2 knock-outs condicionalesephrinB2-CamKIIcre) (Grunwald et al., 2004). Aquí, encontramos que el número de partículas de oro en las sinapsis positivas a efrinaB2 y el número de sinapsis marcadas eran menores en los mutantes que en los controles (Fig.1 I). Junto con los resultados de trabajos anteriores (Makinen et al., 2005), estos datos sugieren que la focalización de ephrinB2 en sitios subcelulares no se vio afectada principalmente en el ephrinB2 5Y / 5Y y efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V ratones (ver Discusión).

Expresión y caracterización bioquímica de proteínas mutantes efrinaB2. A & # x02013C, Imágenes representativas de dendritas de neuronas hipocampales cultivadas derivadas de la indicada efrinaB2 ratones knock-in. Las células se incubaron con EphB4-Fc, y los grupos positivos a efrinaB2 se visualizaron mediante inmunotinción anti-Fc. D, Cuantificación de la densidad de racimos anti-Fc-positivos por micrómetro de dendrita. mi, Cuantificación de los tamaños de los clusters anti-Fc-positivos. F & # x02013H, Sinapsis de la región CA1 inmunomarcadas con anticuerpo ephrinB2 y analizadas por microscopía electrónica. Los asteriscos indican el lado presináptico de cada sinapsis mostrada. Las puntas de flecha apuntan a las densidades postsinápticas. Las partículas de oro inmunológico aparecen como pequeños puntos negros. I, Cuantificación de microscopía inmunoelectrónica de efrinaB2. Se muestran los números de granos de oro por sinapsis versus los números de sinapsis etiquetadas en un grupo de 300 sinapsis. Una mayor proporción de sinapsis no están marcadas en los dos ratones mutantes. El número de partículas de oro en las sinapsis positivas a efrinaB2 es similar entre mutantes y controles (norte = 2 ratones por grupo *pag & # x0003c 0.05, t prueba). J, Coinmunoprecipitación (IP) de ephrinB2 con GRIP1. Las células HeLa transfectadas transitoriamente con construcciones que codifican efrina B2 de tipo salvaje (wt) marcada con GFP, deficiente en el sitio PDZ (& # x00394V) o mutante de tirosina (5Y) se lisaron e inmunoprecipitaron usando anticuerpo anti-GFP. Las proteínas se inmunotransfirieron con anticuerpos anti-GFP (centro) o anti-GRIP (arriba). Se probó una pequeña cantidad del lisado total con anticuerpos anti-GRIP para visualizar los niveles de GRIP en las células (abajo). Tenga en cuenta que GRIP no se coinmunoprecipita con ephrinB2 & # x00394V. K, Cuantificación de la coinmunoprecipitación de ephrinB2 (eB2) con GRIP1 [relación entre GRIP y la densidad óptica (DO) de eB2]. L, Fosforilación de tirosina de proteínas efrinaB2 mutantes en cortes de hipocampo de adultos. Rebanadas derivadas de ephrinB2 PESO / PESO control, ephrinB2 5Y / 5Y , y efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V los ratones se dejaron sin estimular o se estimularon con el inhibidor general de la proteína tirosina fosfatasa ortovanadato. Se lisaron las rodajas y se inmunoprecipitó ephrinB2 usando anticuerpos anti-ephrinB2. Las proteínas se inmunotransfirieron con anticuerpos anti-ephrinB2 (abajo) o anti-fosfotirosina (4G10 arriba). La flecha apunta a ephrinB2. Las barras de error indican SEM.

Para evaluar la unión de PDZ por proteínas mutantes efrinaB2, investigamos la interacción con GRIP1, una proteína que contiene siete dominios PDZ enriquecida en sinapsis excitadoras (Dong et al., 1997) y que probablemente interactúe con efrinaB2 (Bruckner et al., 1999 Lin et al., 1999). Expresamos isoformas de efrinaB2 en células HeLa y comparamos los niveles de proteína relativos mediante análisis de transferencia Western contra GFP, que estaba unida a su extremo N terminal, una modificación que no interfiere con la expresión de la superficie y la unión del receptor (Zimmer et al., 2003 Makinen et al. ., 2005) (Figura 1 J). Las isoformas EphrinB2 WT y ephrinB2 5Y coinmunoprecipitadas con GRIP1, lo que demuestra que la unión de GRIP1 dependiente del dominio PDZ no se vio afectada por la eliminación de residuos de tirosina en ephrinB2. Por el contrario, GRIP1 no se detectó en inmunoprecipitados de efrinaB2 & # x00394V, lo que indica que la unión a PDZ de GRIP1 se destruyó [como se mostró anteriormente para la sinntenina (Makinen et al., 2005)]. La cuantificación de seis experimentos separados reveló que la capacidad de ephrinB2 & # x00394V para coinmunoprecipitar GRIP era 10 veces menor en comparación con las isoformas ephrinB2 WT y ephrinB2 5Y (Fig.1 K). Para evaluar la fosforilación de tirosina de las isoformas endógenas de efrinaB2 en cortes de hipocampo agudo de ratones adultos, tratamos los cortes con el inhibidor de tirosina fosfatasa vanadato para permitir la máxima actividad de tirosina quinasa. En presencia de vanadato, la proteína ephrinB2 & # x00394V se fosforiló en tirosina en un grado similar a la efrinB2 de tipo salvaje, lo que sugiere que puede ser un sustrato para las tirosina quinasas en el hipocampo adulto (Fig.1 L). Como era de esperar, la isoforma mutante ephrinB2 5Y no consiguió fosforilar la tirosina en estas condiciones (Fig.1 L). Estos resultados también confirmaron que los niveles generales de proteínas efrinaB2 en el hipocampo mutante adulto eran normales en los mutantes knock-in. En conjunto, estos hallazgos indican que las proteínas efrinaB2 mutantes están dirigidas a corregir sitios subcelulares y se comportan como se esperaba con respecto a la unión dependiente del dominio PDZ y la susceptibilidad a la fosforilación de tirosina.

Morfología ultraestructural normal de ephrinB2 5Y / 5Y ratones

Informes anteriores habían indicado que los receptores neuronales para ephrinB2, a saber, EphB1-B3 y EphA4, tienen funciones (parcialmente redundantes) en la formación de sinapsis y espinas (Dalva et al., 2000 Henkemeyer et al., 2003 Murai et al., 2003 Kayser y col., 2006). En análisis de EM de efrinaB2 knock-outs condicionales, anteriormente no habíamos encontrado diferencias en el número de sinapsis CA1 en comparación con los controles de los compañeros de camada (Grunwald et al., 2004). Porque el efrinaB2 los knock-ins de isoformas no son condicionales y las proteínas efrinaB2 mutantes están presentes durante todo el desarrollo, es posible que se produzcan efectos sobre el número de sinapsis que no se observan en los knock-out condicionales. Por lo tanto, cuantificamos el número de sinapsis en la región CA1 y evaluamos la morfología de los PSD. Encontramos una reducción modesta, pero significativa, en el número de sinapsis CA1 en ambos efrinaB2 mutantes knock-in en comparación con ephrinB2 PESO / PESO controles (20% para efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V y 15% para ephrinB2 5Y / 5Y a las 6 semanas de edad) (Fig.2 A & # x02013D). Esta reducción en el número de sinapsis fue más leve en el día 15 posnatal (P15 14% para efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V y 10% para ephrinB2 5Y / 5Y ) (Fig. complementaria S2, disponible en www.jneurosci.org como material complementario). Un informe anterior había indicado una reducción modesta de la longitud de PSD en las regiones CA1 y CA3 de triple EphB ratones knock-outEphB1 & # x02212 / & # x02212 B2 & # x02212 / & # x02212 B3 & # x02212 / & # x02212) (Henkemeyer et al., 2003). Encontramos una disminución modesta (10%) de la longitud de PSD en efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V pero no en ephrinB2 5Y / 5Y ratones, en comparación con ephrinB2 PESO / PESO controles (Fig.2 mi). Además, notamos un aumento significativo en el ancho de PSD en efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V pero no en ephrinB2 5Y / 5Y ratones, en comparación con ephrinB2 PESO / PESO controles (32 y 7%, respectivamente) (Fig.2 F). El patrón de las dendritas del hipocampo en el estrato radial del CA1 fue similar basado en la tinción MAP2 en las tres líneas (Fig. S3 suplementaria, disponible en www.jneurosci.org como material suplementario).

Morfologías de sinapsis derivadas de efrinaB2 ratones mutantes. A & # x02013C, Micrografías electrónicas que muestran la morfología de las sinapsis asimétricas en la región CA1 del hipocampo de los ratones indicados. Los PSD se indican con flechas. D, Número de sinapsis por 100 & # x003bcm 2 en la región CA1 (norte = 3 ratones por genotipo & # x0003e2000 sinapsis por animal contado) de ratones de 2 meses. Nótese una reducción pequeña pero significativa en ephrinB2 5Y / 5Y y efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V ratones en comparación con ephrinB2 PESO / PESO control S (*pag & # x0003c 0,01). mi, Cuantificación de la longitud de PSD. Nótese una reducción pequeña pero significativa en efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V ratones en comparación con ephrinB2 PESO / PESO control S (*pag & # x0003c 0.01) y sin cambios en ephrinB2 5Y / 5Y ratones. F, Cuantificación del ancho de PSD. Nótese un aumento pequeño pero significativo en efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V ratones en comparación con ephrinB2 PESO / PESO control S (*pag & # x0003c 0.01) y sin cambios en ephrinB2 5Y / 5Y ratones. Las barras de error indican SEM.

Debido a que la efrinaB2 se localiza predominantemente postsinápticamente en las sinapsis CA3 & # x02013CA1, a continuación preguntamos si la modificación del dominio citoplasmático de la efrinaB2 alteraría el número de especializaciones postsinápticas. in vitro. Cultivamos neuronas del hipocampo de efrinaB2 mutantes (como se describe para la Fig. 1) y puncta postsináptica PSD-95-inmunorreactiva visualizada por inmunofluorescencia después de 20 DIV. No encontramos diferencias significativas en el número de puntos puntuales positivos para PSD-95 entre efrinaB2 mutantes y ephrinB2 PESO / PESO controles (Fig. 3). Juntos, estos resultados sugieren que la proteína efrinaB2 mutante que carece de todos los residuos de tirosina (efrinaB2 5Y) media la morfología normal de la sinapsis en vivo y especializaciones postsinápticas en neuronas cultivadas. La expresión de la proteína ephrinB2 & # x00394V conduce a una morfología de sinapsis ligeramente alterada pero a especializaciones postsinápticas normales en neuronas cultivadas.

Análisis de fluorescencia de PSD-95 puncta en neuronas de hipocampo cultivadas. A & # x02013CSe obtuvieron imágenes representativas de células a partir de embriones E16.5 de las líneas de ratón indicadas, se cultivaron para 20 DIV y se inmunotiñeron usando anticuerpos anti-PSD-95. D, Cuantificación de PSD-95 puncta por 100 & # x003bcm 2. No se observaron diferencias significativas (norte = 3 embriones y 90 & # x02013130 ​​neuronas por genotipo pag & # x0003e 0,05). Las barras de error indican SEM.

Los parámetros sinápticos basales no se modifican en efrinaB2 mutantes citoplasmáticos

A continuación, examinamos las consecuencias funcionales de las mutaciones en el dominio citoplasmático ephrinB2. Realizamos una serie de pruebas electrofisiológicas comparando efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V y ephrinB2 5Y / 5Y ratones a ephrinB2 PESO / PESO controles, que no mostraron diferencias significativas con los ratones de tipo salvaje (datos no mostrados). Primero, comparamos la transmisión sináptica basal entre ephrinB2 PESO / PESO y ratones mutantes. Las fEPSP se provocaron con intensidades de estímulo crecientes en las sinapsis de CA1 estimulando las colaterales de Schaffer, una de las tres vías excitadoras principales. Los tamaños de los VF presinápticos, que son proporcionales al número de axones presinápticos reclutados por la estimulación, se compararon con la pendiente de la respuesta de fEPSP, para establecer relaciones de entrada y salida (Fig.4 A). No observamos diferencias entre ephrinB2 PESO / PESO y efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V o ephrinB2 5Y / 5Y ratones, respectivamente (efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V ratones: pendiente y porcentaje del control, 93 & # x000b1 5,6% ephrinB2 5Y / 5Y ratones: pendiente y porcentaje del control, 115 & # x000b1 13,2% pag & # x0003e 0,2, t prueba).

Los parámetros sinápticos basales no se modifican en efrinaB2 mutantes citoplasmáticos. A, pendiente de fEPSP a diversas intensidades de estímulo (FV). En el rango de 0.1 & # x020130.6 mV, los tres grupos de ratones mostraron valores similares (ephrinB2 PESO / PESO , norte = 17 rodajas efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V , norte = 15 rodajas ephrinB2 5Y / 5Y , norte = 19 rodajas pag & # x0003e 0,05, t prueba). B, Relación NMDA / AMPA. Las EPSC del receptor de AMPA se provocaron a un potencial de membrana de & # x0221270 mV, y las EPSC del receptor de NMDA se provocaron a +40 mV. Para las neuronas de control, la relación NMDA / AMPA fue 1,6 & # x000b1 0,1 (norte = 10 lonchas). La proporción de NMDA a AMPA no cambió significativamente en los ratones mutantes (efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V : 1.7 & # x000b1 0.3, norte = 11 rodajas ephrinB2 5Y / 5Y : 1.8 & # x000b1 0.2, norte = 9 rodajas pag & # x0003e 0,05, t prueba). C, PPF del EPSP en un intervalo entre estímulos (ISI) de 40 ms de los tres grupos de ratones no fue significativamente diferente (ephrinB2 PESO / PESO : 1,5 & # x000b1 0,1, norte = 9 rodajas efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V : 1.6 & # x000b1 0.2, norte = 9 rodajas ephrinB2 5Y / 5Y : 1.6 & # x000b1 0.1, norte = 8 rodajas pag & # x0003e 0,05, t prueba). D, Gráfica de probabilidad acumulada de las amplitudes de mEPSC (D1, D2) y frecuencias (D3, D4) en los ratones de control y mutantes. Ni las amplitudes de mEPSC ni las frecuencias de mEPSC cambiaron significativamente en los ratones mutantes (AV50 amplitud para mEPSCs: ephrinB2 PESO / PESO , & # x0221213.3 & # x000b1 0.9 pA, norte = 19 rodajas ephrinB2 5Y / 5Y , & # x0221214.4 & # x000b1 0.8 pA, norte = 19 rodajas efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V , & # x0221214.2 & # x000b1 4 pA, norte = 18 rodajas pag & # x0003e 0,05, t Prueba de frecuencia de eventos: ephrinB2 PESO / PESO , 0,9 y # x000b1 0,2 Hz, norte = 19 rodajas ephrinB2 5Y / 5Y , 1.0 y # x000b1 0.2 Hz, norte = 19 rodajas efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V , 1.0 y # x000b1 0.2 Hz, norte = 18 rodajas pag & # x0003e 0,05, t prueba). Las barras de error indican SEM.

Para determinar si el número de receptores AMPA y / o NMDA sinápticos era diferente en ratones mutantes, comparamos los tamaños de las EPSC del receptor de AMPA con los de las EPSC del receptor de NMDA mediante grabaciones de células completas de neuronas CA1 en cortes de hipocampo. Las EPSC del receptor de AMPA se provocaron a un potencial de membrana de & # x0221270 mV, y las EPSC del receptor de NMDA se provocaron a +40 mV para aliviar el bloqueo de magnesio. La magnitud de la EPSC del receptor NMDA se determinó midiendo la amplitud de las EPSC 70 ms después del estímulo. Para las neuronas de control, la relación NMDA / AMPA fue 1,6 & # x000b1 0,1 (norte = 10) (Figura 4 B). La proporción de NMDA a AMPA no cambió significativamente en los ratones mutantes (efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V : 1.7 & # x000b1 0.3, norte = 11 ephrinB2 5Y / 5Y : 1.8 & # x000b1 0.2, norte = 9 pag & # x0003e 0.05, t prueba).

A continuación, medimos PPF, una medida sensible de cambios en la probabilidad de liberación del transmisor (Pr). Para evaluar los efectos de las mutaciones del dominio citoplasmático de ephrinB2 sobre el Pr, medimos el PPF utilizando las proporciones de la segunda y la primera pendiente de EPSP en un intervalo entre pulsos de 40 ms. Como se muestra en la Figura 4 C, encontramos que las sinapsis en ratones de tipo salvaje y mutantes exhibían PPF muy similares durante la transmisión sináptica basal. Estos resultados indican que las funciones presinápticas en estos ratones eran normales.

Finalmente, diseñamos experimentos para buscar cambios en los números de sinapsis funcionales. La amplitud de las mEPSC es una medida del número de receptores AMPA por sinapsis, mientras que un cambio en la frecuencia de las mEPSC refleja un cambio en el número de sinapsis funcionales. Comparación de las amplitudes y frecuencias acumuladas de EPSC (Fig.4 D) para los ratones de tipo salvaje y mutantes no revelaron diferencias significativas. Las frecuencias de mEPSC se midieron en ratones de 2 a 3 semanas de edad, en un momento en que la microscopía electrónica reveló reducciones leves en el número de sinapsis (14% para efrinaB2 & # x00394V /& # x00394V y 10% para ephrinB2 5Y / 5Y ratones). Debido a que varios parámetros de mEPSC (como probabilidad de fusión de vesículas espontáneas, nivel de detección, atenuación en la dendrita) son heterogéneos de sinapsis a sinapsis, no es sorprendente que los pequeños cambios en el número de sinapsis no se detecten como un cambio en la frecuencia de mEPSC. Juntos, estos hallazgos indican que las mutaciones del dominio citoplásmico de ephrinB2 no causaron cambios aparentes en los circuitos excitadores.

EphrinB2–PDZ interaction and tyrosine phosphorylation sites participate in CA3� hippocampal LTP

Using two different protocols to induce LTP (tetanic and theta burst see Materials and Methods), we investigated the consequences of ephrinB2 cytoplasmic domain mutations in CA3� hippocampal LTP. Using acute slices from adult mice, either tetanic stimulation ( Fig. 5 A) or TBS ( Fig. 5 B) were applied to fibers of the CA3 presynaptic neurons, and LTP was recorded from CA1 neurons for up to 1 h after stimulation. In both stimulation protocols, the magnitude of the potentiation was different between controls and mutants. After tetanic stimulation ( Fig. 5 A), the mean EPSP slope as a percentage of baseline 55� min after stimulation was 156.4 ± 6.9% in the ephrinB2 WT/WT controls (norte = 13 slices), whereas ephrinB2 & # x00394V/& # x00394V y ephrinB2 5Y/5Y mice showed significantly lower normalized slopes (117.7 ± 3.8 and 120.6 ± 8.9%, respectively pag < 0.01, t prueba). Similar differences were observed after TBS ( Fig. 5 B), indicating that the impairments in LTP were not specific to a single induction protocol. We next investigated slices taken from P14–P20 animals. As shown in Figure 5 C, both ephrinB2 & # x00394V/& # x00394V y ephrinB2 5Y/5Y mice displayed reduced LTP compared with ephrinB2 WT/WT controls, although the difference was less dramatic than in adult slices (ephrinB2 WT/WT , 141.5 ± 5.7% ephrinB2 & # x00394V/& # x00394V , 120.8 ± 5.5% ephrinB2 5Y/5Y , 120.9 ± 4.6% pag < 0.01, t prueba). These data indicate that hippocampal LTP requires both intact PDZ target and tyrosine phosphorylation sites in the ephrinB2 cytoplasmic domain.

EphrinB2 tyrosine phosphorylation sites are not required for LTD and depotentiation

Because LTD at CA3� hippocampal synapses requires the presence of ephrinB2 (Grunwald et al., 2004), we analyzed hippocampal LTD in slices taken from ephrinB2 WT/WT control knock-in mice and ephrinB2 signaling mutants. After recording stable baseline responses (see Materials and Methods), LTD was induced by low-frequency stimulation (LFS) of 900 stimuli at 1 Hz (15 min). As shown in Figure 6 A, ephrinB2 WT/WT controls showed a persistent decrease in fEPSPs, which lasted for at least 60 min. EphrinB2 & # x00394V/& # x00394V slices were defective in LTD and returned to baseline at 40 min after LTD induction (ephrinB2 & # x00394V/& # x00394V slices, 97.9 ± 2.2% vs ephrinB2 WT/WT slices, 84.1 ± 1.7% pag < 0.01, t prueba). Unexpectedly, ephrinB2 5Y/5Y slices showed LTD nearly indistinguishable from ephrinB2 WT/WT controls (ephrinB2 5Y/5Y , 82.3 ± 3.4% vs ephrinB2 WT/WT slices, 84.1 ± 1.7% pag = 0.56, t prueba).

EphrinB2 tyrosine phosphorylation sites are not required for LTD and depotentiation. A, EphrinB2–PDZ interaction but not tyrosine phosphorylation sites are required for LTD in young hippocampal slices (P14–P20). LFS induced a significant long-lasting decrease in fEPSPs in ephrinB2 WT/WT control y ephrinB2 & # x00394V/& # x00394V slices but not in ephrinB2 5Y/5Y slices (97.9 ± 2.2% in ephrinB2 & # x00394V/& # x00394V mutants compared with 82.3 ± 3.4% in ephrinB2 5Y/5Y mutants and 84.1 ± 1.7% in ephrinB2 WT/WT controls at 55� min after LFS pag < 0.05). B, Depotentiation is impaired in ephrinB2 & # x00394V/& # x00394V pero no ephrinB2 5Y/5Y mutantes. Ten minutes after tetanus (arrow) to produce the initial phase of LTP, slices were subjected to a 15 min LFS train (horizontal line 1 Hz). The fEPSPs from ephrinB2 WT/WT control y ephrinB2 5Y/5Y slices returned to baseline (ephrinB2 WT/WT slices, 104.0 ± 7.6% ephrinB2 5Y/5Y slices, 98.9 ± 6.2%), whereas ephrinB2 & # x00394V/& # x00394V slices remained potentiated (126.9 ± 4.6% pag < 0.05, compared with ephrinB2 WT/WT controls).

We additionally analyzed another form of long-term plasticity known as depotentiation, the depression of synaptic efficacy at synapses that have recently undergone LTP (O'Dell and Kandel, 1994). Although the induction protocol for depotentiation is identical to LTD, they may represent distinct processes (Montgomery and Madison, 2002, and references within). After recording a stable baseline, we applied a tetanic stimulation to induce LTP, followed (after 10 min) by a depotentiation stimulus (LFS of 900 stimuli at 1 Hz for 15 min). Slices derived from ephrinB2 WT/WT controls showed a normal initiation phase of LTP (first 10 min after tetanus application) and complete depotentiation after 15 min of LFS ( Fig. 6 B). As expected from the LTP results, both ephrinB2 & # x00394V/& # x00394V y ephrinB2 5Y/5Y slices displayed reduced early LTP, but their reaction to LFS varied: ephrinB2 & # x00394V/& # x00394V slices were defective in depotentiation and remained potentiated 55� min after LFS application (fEPSP slope size: ephrinB2 & # x00394V/& # x00394V slices, 126.9 ± 4.6% vs ephrinB2 WT/WT slices, 104.0% ± 7.7% pag < 0.05, t prueba). A diferencia de, ephrinB2 5Y/5Y slices displayed complete depotentiation 1 h after the application of the LFS protocol (98.9 ± 6.2% fEPSP slope) ( Fig. 6 B), following a time course indistinguishable from controls. These findings suggest that the required function of ephrinB2 in LTD as well as in depotentiation is independent of phosphotyrosine signaling.

EphrinB2 reverse signaling in cultured neurons induces phosphorylation of NMDA receptors

In a number of different cell types, including excitatory neurons, ephrinB reverse signaling involves the rapid recruitment and activation of SFKs to ephrinB clusters (Palmer et al., 2002 Georgakopoulos et al., 2006). SFKs bind to the ephrinB cytoplasmic domain and phosphorylate ephrinB on tyrosine residues. SFKs are also the major protein tyrosine kinases that upregulate the activity of NMDA receptors (reviewed in (Salter and Kalia, 2004 Lee, 2006). SFK-mediated tyrosine phosphorylation of NMDA receptors is critical for induction of NMDA receptor-dependent LTP (Lu et al., 1998). Tyrosine phosphorylation of NMDA receptor subunits regulates their membrane trafficking. To begin addressing the biochemical events mediated by ephrinB2 reverse signaling, we investigated the degree of tyrosine phosphorylation of the NR2A subunit of NMDA receptors in cultured forebrain neurons. Stimulation of neurons derived from ephrinB2 WT/WT mice with EphB4-Fc led to a robust increase in NR2A tyrosine phosphorylation compared with control Fc-treated cultures ( Fig. 7 A & # x02013C). Interestingly, NR2A tyrosine phosphorylation was abnormal in mutant neurons: in the presence of the ephrinB2 ΔV isoform, basal NR2A tyrosine phosphorylation was elevated and was not further enhanced by EphB4-Fc stimulation ( Fig. 7 B). In the presence of the ephrinB2 5Y isoform, basal NR2A tyrosine phosphorylation was comparable to wild-type neurons, but EphB4-Fc stimulation did not lead to an increase in NR2A tyrosine phosphorylation. The changes in NR2A tyrosine phosphorylation correlated with similar changes in Src phosphorylation as revealed by a phospho-Src ELISA ( Fig. 7 D). These results demonstrate NR2A tyrosine phosphorylation as a consequence of ephrinB activation in cultured neurons and that both ephrinB2 ΔV and ephrinB2 5Y isoforms fail to regulate NR2A tyrosine phosphorylation.

EphrinB2 activation causes NR2A and Src tyrosine phosphorylation. Dissociated cultures of embryonic forebrain neurons (8 DIV) derived from wild-type (A) or from the indicated mutant mice (B𠄽) were stimulated with control Fc or EphB4-Fc for the indicated times. A, Note the EphB4-Fc-induced increase in NR2A tyrosine phosphorylation in wild-type neurons. B, Independent experiment using ephrinB2 WT/WT y ephrinB2 & # x00394V/& # x00394V neuronas. Note the elevated basal and lack of stimulated NR2A tyrosine phosphorylation in ephrinB2 & # x00394V/& # x00394V neuronas. C, Independent experiment using ephrinB2 WT/WT y ephrinB2 5Y/5Y neuronas. There is no EphB4-Fc-induced increase in NR2A tyrosine phosphorylation in ephrinB2 5Y/5Y neuronas. D, Cell lysates were subjected to a phospho-Src ELISA. EphB4-Fc-stimulation of ephrinB2 WT/WT neurons led to a significant induction of Src phosphorylation at position 418, which is required for Src activation (*pag < 0.05, t prueba). Changes in Src phosphorylation observed in ephrinB2 & # x00394V/& # x00394V y ephrinB2 5Y/5Y neurons were not significant. p-NR2A, Phosphorylated NR2A.


Brain Extracellular Matrix in Health and Disease

Oleg Senkov , . Alexander Dityatev , in Progress in Brain Research , 2014

7 Reelin

Reelin is a large secreted ECM glycoprotein (400 kDa, gene RELN) that controls neuronal migration and brain development ( Cooper, 2008 Dɺrcangelo et al., 1995 Rice and Curran, 2001 Soriano and Del Rio, 2005 ). Reelin binds to the lipoprotein family receptors apolipoprotein E receptor 2 (ApoER2) and very-low-density lipoprotein receptor (VLDLR) ( Dɺrcangelo et al., 1999 Hiesberger et al., 1999 ) and induces the phosphorylation of the adaptor protein Dab1 ( Howell et al., 1997 Howell et al., 1999 ). The downstream Reelin cascade includes several signaling pathways, including distinct members of the Src kinase family ( Arnaud et al., 2003 ), Erk1/2 ( Simo et al., 2007 ), AKT/GSK3 ( Beffert et al., 2002 ), and ubiquitination/degradation of phosphorylated mDab1 triggered by Cul5 ( Simo and Cooper, 2013 Simo et al., 2010 ).

In addition to developmental stages, Reelin is expressed in the adult cerebral cortex mainly by γ-amino-butyric acid (GABA)-positive interneurons ( Alcantara et al., 1998 ) where it has been proposed to regulate plasticity processes ( Dityatev et al., 2010a Herz and Chen, 2006 ). For instance, it has been shown that Reelin potentiates glutamatergic neurotransmission, LTP, and synaptic maturation increases the expression of AMPA and NMDA receptor subunits and favors the trafficking and substitution of NR2B subunits by NR2A subunits ( Beffert et al., 2005 Chen et al., 2005 Groc et al., 2007 Qiu and Weeber, 2007 Qiu et al., 2006b ). Moreover, Reelin has been suggested to regulate the density and stabilization of dendritic spines ( Niu et al., 2008 Ventruti et al., 2011 ). Two models have been used to address specifically the role of Reelin in the adult brain. Local en vivo injections of Reelin increase spine density, modify spine morphology, and enhance LTP ( Rogers et al., 2011 Rogers et al., 2013 ). Similarly, transgenic mice overexpressing Reelin in the adult forebrain (Reelin-OE mice) show hypertrophy of dendritic spines and enhanced glutamatergic neurotransmission and LTP ( Pujadas et al., 2010 Teixeira et al., 2011 ). Moreover, both acute administration of Reelin in wild-type mice and studies in Reelin-OE mice show enhanced associative and spatial learning and memory ( Pujadas et al., 2010 Pujadas et al., 2014 Rogers et al., 2011 Rogers et al., 2013 ). Conversely, administration of recombinant receptor-associated protein (as a Reelin signaling blocking tool) is associated with impaired performance in a hippocampus-dependent MWM test ( Stranahan et al., 2011 ).

Reelin is also highly expressed in neurogenic niches, the subventricular zone (SVZ) and the dentate gyrus, and in rostral migratory stream and olfactory bulb ( Courtes et al., 2011 Dityatev et al., 2010b ). In the SVZ, Reelin was shown to control the behavior of SVZ-derived migrating neurons, triggering them to leave prematurely the rostral migratory stream leading to ectopic neurons both along the rostral migratory pathway and in the olfactory bulb ( Courtes et al., 2011 Pujadas et al., 2010 ). In the dentate gyrus, Reelin overexpression results in increased neurogenesis and accelerated dendritic maturation, likely reflecting increased functional integration into adult circuits. Conversely, inactivation of the Reelin signaling pathway specifically in adult neuroprogenitor cells resulted in aberrant migration, decreased dendrite development, and formation of ectopic dendrites in the hilus and in the establishment of aberrant circuits ( Teixeira et al., 2012 ). These studies support a critical role for the Reelin pathway in regulating adult neurogenesis and dendritic development of adult-generated neurons. Taken together with the above data, Reelin emerges as a key regulator of adult plasticity processes important for learning and memory including synaptic plasticity and remodeling and adult neurogenesis.

Reelin is also known to be involved in a spectrum of cognitive pathological conditions, for example, its expression is compromised in the brain of schizophrenic patients and in autism, bipolar disorder, major depression, AD, and several polymorphisms, and rare variants in the RELN gene have been associated with these disorders ( Botella-Lopez et al., 2006 Chin et al., 2007 Fatemi et al., 2000 Kramer et al., 2011 Liu et al., 2010 ). However, experimental evidence in heterozygous reeler mice, expressing a half of normal Reelin protein levels, has been contradictory. While some studies show that heterozygous reeler mice have cognitive ( Brigman et al., 2006 Qiu et al., 2006a ) and sensorimotor deficits as measured in the prepulse inhibition test (PPI) ( Barr et al., 2008 ), other studies have failed to find differences ( Krueger et al., 2006 Podhorna and Didriksen, 2004 Teixeira et al., 2011 ). Moreover, additional tests associated to psychiatric-related behavioral dysfunctions (e.g., OF, BW, and FST tests) also failed to demonstrate clear differences between heterozygous reeler y peso mice ( Podhorna and Didriksen, 2004 Teixeira et al., 2011 ). Finally, relatively mild behavioral deficits have been found in VLDLR or ApoER2 mutant mice ( Barr et al., 2007 ). Taking advantage of an experimentally different approach, Teixeira et al. (2011) investigated whether Reelin overexpression may modify psychiatric-related phenotypes. While increased Reelin expression does not alter mood-related behaviors under basal conditions, Reelin overexpression was found to be protective against PPI deficits induced by NMDA antagonists, cocaine sensitization (as a model of maniac disorder), and chronic stress-induced depression phenotypes.

In relation to AD pathology, it is noteworthy that Reelin is present in amyloid plaques ( Doehner et al., 2010 ), controls APP processing ( Hoe et al., 2006 ), and reduces tau phosphorylation by inhibiting glycogen synthase kinase 3 (GSK3 Ohkubo et al., 2003 ). Importantly, Reelin has been consistently found to counteract Aβ42-induced synaptic dysfunction including LTP ( Durakoglugil et al., 2009 ). In addition, AD brain samples show altered levels of Reelin and RELN polymorphisms have been associated with this disease ( Botella-Lopez et al., 2006 Botella-Lopez et al., 2010 Chin et al., 2007 Kramer et al., 2011 ). These studies suggest that dysfunction of the Reelin pathway may be at the root of the neuropathologic mechanisms leading to sporadic, late-onset AD ( Krstic and Knuesel, 2013 Krstic et al., 2012 ). This hypothesis has been experimentally addressed. Indeed, the reduction of Reelin in an AD mouse model crossed with heterozygous reeler accelerates the onset of plaque formation and tau pathology ( Kocherhans et al., 2010 ). Conversely, Reelin overexpression in hAPPSwe/ind (J20) mice reduces amyloid plaque load, rescues dendritic spine loss in J20 mice, and enhances cognitive performance in both aged wild-type and J20 mice. At the molecular level, Reelin delays Aβ42 fibril formation—by interacting with Aβ42 soluble species including oligomers—until it is sequestered into amyloid fibrils. Importantly, Reelin overcomes the toxicity of Aβ42 oligomers in neuronal cultures ( Pujadas et al., 2014 ). Taken together with Reelin's role in plasticity, these data support a model in which the Reelin pathway may exert beneficial effects on both AD pathology and cognition by at least two complementary mechanisms: in addition to extracellular Reelin delaying amyloid fibril formation and reducing neurotoxicity by interacting with Aβ42, the activation of the Reelin cascade itself would potentiate adult plasticity events, including synaptic plasticity and adult neurogenesis, and lead to decreased GSK3 activity and tau phosphorylation. It is thus likely that activation of the Reelin pathway might represent a therapeutic strategy for ameliorating the cognitive decline and neuropathologic hallmarks associated with AD.


Comentarios

This is a very interesting study that provides several important advances and insights for the field. It is particularly intriguing to see that BACE1 inhibition not only reduces plaque growth, but may even shrink existing plaques. If it also happens in patients this would be fantastic news for the clinical trials with BACE inhibitors. Because AD mouse models, including the 5xFAD model used in this study, typically mimic presymptomatic AD, it would appear possible that secondary prevention trials with BACE inhibitors may not only yield reduced growth or number of plaques, but even a shrinking of pre-existing plaques and a reduction of neuroinflammation—provided that the drugs are given early enough before the symptoms start. This should and will be tested in the trials’ participants using PET imaging. These new findings contradict a recent study that demonstrated that plaques remain stable in size when BACE1 is inhibited pharmacologically. I am sure that this discrepancy will be resolved with future experiments and may depend on the mouse line used, or the level or duration of BACE1 inhibition.

We also need to consider that the amazing effects of the mouse study were accompanied by an intriguingly gradual reduction of BACE1 protein levels. It is difficult to predict exactly which inhibition level of BACE1 would be needed in humans to achieve the same results. Potentially, the levels currently used in trials are already sufficient.

Another take-home message of the study is that memory and LTP deficits were improved in the AD mice as BACE1 was suppressed. While this is good news, the study also demonstrated that LTP did not fully recover. This indicates that the therapeutically desired BACE inhibition in adult mice may interfere with physiological BACE1 functions. Besides LTP, this includes muscle spindle formation/maintenance and dendritic spine densities in adult mice. Translated to humans, this could indicate a larger number of falls or psychiatric symptoms in individuals treated with BACE inhibitors. Whether this is a realistic concern will be seen from the results of the currently ongoing and recently terminated BACE inhibitor trials.

Constitutive BACE1-deficient mice show a number of different phenotypes. Another major insight of the new study is that adult deletion of BACE1 overcomes at least one of the symptoms—the hypomyelination. The new conditional BACE1-deficient mice are an excellent tool to analyze whether the other BACE1-deficient mouse phenotypes are also of developmental origin and which functions of BACE1 are relevant in adult mice. Taken together, the new study is an excellent basis both for basic and translational BACE1 research.

I am interested to know why, under BACE1 cKO, there is, in addition to an expected decrease in C99, a decrease in C83 as well. The authors suggest that a cKO of BACE1 improves autophagy, increasing turnover of C-terminal fragments. However, there is no change in C83 in the original KO (Cai, 2001). Have the authors looked at APP trafficking in their model? I would be interested to know if the amount of sAPPα is the same, i.e. is APP still being trafficked to the cell surface?


Jin-Yu Lee and Li-Jen Lee: These authors contributed equally to this work.

Afiliaciones

Institute of Biochemical Sciences, College of Life Science, National Taiwan University, Taipei, Taiwan

Jin-Yu Lee, Hsin-An Shih & Mau-Sun Chang

Graduate Institute of Anatomy and Cell Biology, National Taiwan University, Taipei, Taiwan

Institute of Brain and Mind Sciences National Taiwan University, Taipei, Taiwan

Neurobiology and Cognitive Science Center, National Taiwan University, Taipei, Taiwan

Department of Superintendent Office, Mackay Memorial Hospital, Taipei, Taiwan

Department of Medical Laboratory Science and Biotechnology, Yuanpei University, Hsinchu, Taiwan

Department of Medical Technology, Jen-Teh Junior College of Medicine, Nursing and Management, Miaoli, Taiwan

Department of Life Science, College of Life Science, National Taiwan University, Taipei, Taiwan


Resultados

SynGAP mutant mice die shortly after birth

To explore the possible role of SynGAP en vivo, the SynGAP gene was disrupted in mice. The genomic DNA containing the 5′ end of the mouse SynGAP gene was isolated and analyzed for targeting vector construction. SynGAP is extensively spliced at the 5′ end, leading to splice variants: SynGAP-a, -b, -c, and -d (Chen et al., 1998 Kim et al., 1998 Li et al., 2001) (Fig.1A). Therefore, the exon cassette containing the first common methionine present in the shortest splice variant, SynGAP-c, was chosen for deletion, along with an adjacent exon encoding a portion of the C2 domain by replacing it with a neo R gene cassette in the reverse orientation (Fig. 1B). The normal splicing events in the targeted SynGAP gene are predicted to yield transcripts with premature stop codons. The targeted and the wild-type alleles can be differentiated by performing Southern blotting after theKpnI digestion using the inner and outer probes (Fig.1B), and the genotyping result can also be confirmed by PCR using the primers shown (Fig. 1C,Derecha).

SynGAP splice variants and domain structure and gene targeting strategy. A, N-terminal splicing leads to different start sites and sequences in SynGAP-a, -b, -c, and -d. SynGAP protein contains a pleckstrin homology (PH) domain, a phospholipid-dependent Ca 2+ binding motif (C2) domain, a Ras GTPase-activation protein (RasGAP) domain, and a C-terminal sequence PSD-95/discs large/zona occludens-1 domain binding motif (QTRV). Alternative splicing occurs also at the C terminal with C-terminal sequences other than −QTRV.B, The SynGAP gene structure is shown (not drawn to scale) of the region analyzed for gene targeting. Targeting of the SynGAP gene was performed by replacing the SacoII andEcoRI fragments of the SynGAP gene containing two exons with the neo R cassette. The targeting construct spanning the XhoI and HindIII fragment of the SynGAP gene is 11.5 kb long. Outer and inner probes were used for Southern blotting. The PCR primers used for genotyping and the predicted amplified sizes are shown. TK, Thymidine kinase. C, Genotype analyses of tail DNA of second filial generation (F2) mice by PCR and Southern blotting. The wild-type allele is detected by Southern blotting after digestion with the KpnI restriction enzyme (izquierda). The size of the detected wild-type band is 1.8 kb longer than that of the targeted allele. Two alleles can be distinguished using PCR primer sets (Derecha).

The chimeric male mice from two independent ES clones (17.28 and 18.8) were mated with C57BL/6 female mice to generate heterozygotes, and sibling mating of heterozygotes produced homozygotes. La F2 mice genotypes exhibited a Mendelian ratio of 1:2:1, indicating that there is no embryonic lethality caused by the null mutation of the SynGAP protein or abnormal segregation of the gene. A database search revealed that the SynGAP gene is on mouse chromosome 17. A sample Southern blotting analysis of the F2 mice is shown in Figure 1C,izquierda, where the mobility of the targeted allele differs from that of the wild type after the KpnI digestion because the neo R gene does not contain the restriction site. The heterozygotes are indistinguishable from the wild types in their size and activity, and they breed normally. The homozygotes are indistinguishable from the wild types and the heterozygotes for the first 2 d after birth. By the third day the mutant mice begin to show less movement and do not feed from the mother mice. Between P4 and P6, the pups stay small in size, and they die between P5 and P7. These observations were confirmed in the two independent mutant mouse lines.

SynGAP gene targeting abolishes the expression of the wild-type SynGAP protein

Immunoblot analysis of mouse brain homogenates at P5 with the anti-GAP SynGAP antibody showed that expression of the 130 kDa SynGAP protein is abolished in the mutant mice (Fig.2A). However, overexposure of the immunoblot showed that a very low level of a smear of smaller proteins (∼120 kDa) could be detectable using the anti-GAP antibody. These are most likely protein products of the SynGAP gene from cryptic start sites downstream of the deleted exons in the targeted gene. These protein products are present at <2% the level of the wild-type SynGAP protein. To analyze whether deletion of SynGAP affected the expression of other neuronal proteins, various synaptic proteins were surveyed in the SynGAP mice at P5 (Fig.2B). NMDA receptor subunits, NR1 and NR2B, and associated proteins, PSD-95 and SAP102, were similar in expression level in all genotypes. Also, the level of the AMPA receptor subunit GluR1 and the AMPA receptor-associated proteins GRIP1 and GRASP1 were indistinguishable in the wild types, heterozygotes, and homozygotes.

A proper expression of SynGAP protein is abolished in the mutant mice, whereas other synaptic proteins are not affected at P5. A, Mouse brain homogenates were prepared and immunoblotted with the anti-GAP SynGAP antibodies at P5 and compared with that of rat brain homogenate at P4. With an equal amount of protein loaded in each carril, SynGAP protein expression is absent in the sample from a homozygous (Homoz) ratón.Heteroz, Heterozygous. B, The expression of proteins at synapses was examined in the SynGAP mice using the antibodies to the proteins indicated, and no detectable change in the expression was seen. C, Tissue distribution of SynGAP protein in the mutant and the wild-type mice at P5 was examined using the α-GAP domain antibody. In wild-type mice, a prominent band of ∼130 kDa was detected in the cortex and the cerebellum. In contrast, the ∼130 kDa protein was not detected in the homozygotes or in non-neuronal tissues.

Brain development in the SynGAP mutant mice

Examination of the SynGAP mutant mice at a gross anatomical level reveals typical development of tissues and organs, similar to the wild-type mice. Because SynGAP protein expression is selectively expressed in the brain (Fig. 2C), it seems likely that the prenatal development of non-neuronal tissues is not affected by the absence of SynGAP protein. Brain development at the gross anatomical level also seems normal in the mutant mice. The formation and organization of the forebrain appears to be similar in mice of all three genotypes at P5, as revealed by Nissl staining (data not shown). However, the size of the mutant mouse brain is significantly smaller, indicating that SynGAP may be crucial to the proliferation and development of neuronal tissues after birth, especially around P3. It is not clear why the SynGAP mutant mice die (see Discussion).

Decreased number of silent synapses in neurons cultured from homozygous mice

To investigate the role of SynGAP during synaptogenesis, cortical neuronal cultures were prepared from SynGAP mice and analyzed after 18–20 d in vitro (DIV). The neurons were fixed, and immunocytochemistry was performed using an anti-synaptophysin antibody to identify synapses, anti-GluR1 and anti-GluR2/3 antibodies to identify AMPA receptors, and anti-NR1 antibody for NMDA receptors. In heterozygote and homozygous neurons, synapses, identified by the anti-synaptophysin antibody, were present in similar numbers [heterozygote mice, 94.1 ± 4.7 (SD) of wild-type mice,pag < 0.68 homozygote mice 109.4 ± 4.9%,pag < 0.49 of wild-type mice] and pattern to those in wild-type neurons. Interestingly, AMPA receptor clusters, identified by the anti-GluR1 antibody, were present in a greater number in the homozygotes than in the heterozygotes and the wild-types (Fig.3A). A similar result was obtained using the anti-GluR2/3 antibody. Quantitation of the number of AMPA receptor puncta is shown in Figure 3B. The number of GluR1-positive clusters was increased in the homozygotes by 32.1 ± 9.0% (pag < 0.05 ANOVA) compared with the wild types (Fig. 3) and was also higher in the heterozygotes (21.4 ± 8.6%). There was a slight increase in the number of NMDA receptor puncta, although this was not statistically significant (pag > 0.05 ANOVA data not shown). Because the number of AMPA receptor clusters increased more than the number of NMDA receptor clusters, we determined whether the number of morphological silent synapses (synapses that contain NMDA receptors but not AMPA receptors) (Liao et al., 1999, 2001) was increased in the mutant mouse. The cultures from the SynGAP mutant mice had significantly fewer morphological silent synapses than their wild-type littermates (Fig.3C).

The number of AMPA receptor clusters in the SynGAP mutant mice is increased. A, Primary cortical cultures from the SynGAP mutant mice and their wild-type and heterozygous littermates were immunostained with anti-GluR1 antibodies after 18–20 DIV. There was an increase in the number of GluR1-positive clusters in the cultures prepared from the homozygous pups. B, Quantitation of GluR1-positive puncta in SynGAP mouse neuronal cultures at 18–20 DIV (norte = 14, norte = 19, and norte = 13, respectively pag < 0.05 ANOVA F = 3.52). C, The number of morphological silent synapses in the cultures was quantitated by comparing the number of AMPA receptor cluster/NMDA receptor cluster puncta (norte = 9, norte = 13, andnorte = 7, respectively) at 18–20 DIV.

Synaptic plasticity in SynGAP knock-out mice

We tested the role of SynGAP in hippocampal synaptic plasticity by comparing the magnitude of LTP and LTD in the CA1 region of adult wild-type and heterozygous mice. LTP induced by TBS was significantly decreased in slices from heterozygous mice (140 ± 6% of baseline at 1 hr after TBS norte = 20 slices from five animals) compared with their wild-type littermates (174 ± 9% of baseline norte = 16 slices from five animalspag < 0.01 Student's t test) (Fig.4A). Next we tested whether LTD is affected in the SynGAP heterozygotes. To examine LTD, we used paired pulses at an interstimulus interval of 50 msec repeated at 1 Hz for 15 min (PP-1 Hz), which has been used previously to induce LTD in hippocampal slices from adult rats (Kemp et al., 2000). As shown in Figure 4B, there was no difference in the magnitude of LTD in the heterozygous animals (80 ± 3% of baseline measured 1 hr after the start of PP-1 Hz norte = 21 slices from four animals) compared with wild-type littermates (82 ± 4% of baseline norte = 18 slices from four animalspag > 0.4 Student's t prueba). In mice, LTD induced by the PP-1 Hz protocol is completely blocked by bath application of the NMDA receptor antagonist APV (data not shown).

A, Schaffer collateral to CA1 LTP in adult SynGAP heterozygotes (● norte = 20 slices from 5 animals) are significantly reduced compared with wild-type littermates (○ norte = 16 slices from 5 animals). FP traces taken just before and 1 hr after TBS for wild types and heterozygotes are shown to the Derecha. B, No significant difference in PP-LTD (PP-1Hz) in SynGAP heterozygotes (● norte = 21 slices from 4 animals) and wild types (○ norte = 18 slices from 4 animals). FP traces taken just before and 1 hr after the initiation of PP-1 Hz are shown to the Derecha. C, AMPA receptor-mediated synaptic transmission measured as the initial FP slope plotted against fiber volley amplitude. Plots of both wild types (○ norte = 32 slices from 8 animals) and heterozygotes (● norte = 33 slices from 8 animals) essentially overlap, suggesting that synaptic transmission is normal in heterozygotes. D, No difference was observed in presynaptic function as monitored by paired-pulse facilitation between wild types (○ norte = 14 slices from 5 animals) and heterozygotes (● norte = 14 slices from 5 animals). Paired pulses were given at interstimulus intervals of 25, 50 100, 200, 400, 800, and 1600 msec at baseline stimulus intensity.mi, Pharmacologically isolated NMDA receptor-mediated synaptic transmission does not differ much between SynGAP heterozygous and wild-type littermates. NMDA receptor-mediated synaptic responses were pharmacologically isolated by bath application of ACSF with 0 m m Mg 2+ and 10 μ m NBQX. An input–output curve was generated by plotting the amplitude of NMDA receptor (NR)-mediated FP against fiber volley amplitude. At the end of each experiment, 100 μ m d,l -APV was added to the bath, completely abolishing the responses (data not shown). Dashed lines indicate normalized FP and paired-pulse facilitation ratio.

The phenotype seen in heterozygotes was not attributable to changes in AMPA receptor-mediated synaptic transmission, because there were no detectable differences in the input–output curve (Fig. 4C). Presynaptic function measured by the paired-pulse facilitation ratio at interstimulus intervals ranging from 25 to 1600 msec were also normal in the heterozygotes (Fig. 4D). To rule out the possibility that the reduced LTP in the SynGAP heterozygotes is attributable to alterations in NMDA receptor-mediated synaptic responses, we pharmacologically isolated NMDA receptor-mediated components of synaptic transmission by recording in ACSF with 0 m m Mg 2+ and 10 μ m NBQX. The magnitude of the NMDA receptor-mediated response was measured by generating an input–output curve. We plotted NMDA receptor-mediated FP amplitude against the fiber volley amplitude to correct for variability in recruiting presynaptic fibers. As shown in Figure 4mi, there is no significant effect on NMDA receptor-mediated responses in the heterozygotes.


Conclusiones

The functioning of the CPEB family proteins is essential at all stages of ontogeny. CPEBs play an important role in the formation and maintenance of cell polarity, participating in mRNA transport and localization, translational repression or activation of target mRNAs [30, 81,82,83]. In the nervous system, this function is manifested in the participation of the CPEB proteins in neurogenesis and the functioning of neurons. Much attention is devoted now to the role that the prion-like conformation of these proteins plays in the formation of long-term memory.

The CPEB proteins participate in the translational control of a wide range of mRNAs and, therefore, are involved in pathologies of the nervous system. Moreover, disturbances in the functioning of the CPEB proteins cause other pathological processes, including carcinogenesis, tumor invasion, and angiogenesis. In the case of rectal cancer, breast cancer, and gliomas, the expression levels of several CPEB proteins change simultaneously, which is indicative of interactions between them in the oncological process [67, 84,85,86]. The role of the CPEB proteins in certain liver diseases and metabolic disorders (e.g., hepatosteatosis) was also revealed [87].

Thus, investigation of the role of the CPEB proteins is an extremely important fundamental task that opens up prospects for understanding the molecular mechanisms of the formation and functioning of the nervous system and other body systems, as well as for finding ways to treat a wide range of diseases.


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