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¿Formas de dañar las membranas de las microalgas y las levaduras?

¿Formas de dañar las membranas de las microalgas y las levaduras?


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Estoy investigando una forma de controlar el daño de las membranas de las células. Para hacer eso, primero tengo que tener puntos de referencia, es decir, células con membranas dañadas.

Estoy trabajando con Dunalliela, Hematococcus (ambas microalgas) y levadura común. Hasta ahora he estado usando principalmente etanol para dañar las membranas.

¿Qué otras formas existen para causar el mayor daño posible a las membranas de microalgas (o levaduras)? La idea no es la destrucción total de las células, sino el daño de la membrana (se espera la muerte).


Para llegar a la membrana de estas especies, primero debe atravesar una pared celular formidable. Por lo tanto, los métodos enumerados a continuación están más destinados a hacer que las células sean permeables, pero las membranas deben sufrir algún daño en el proceso.

  • En nuestro laboratorio usamos regularmente la transformación de perlas de vidrio para la transformación de microalgas. La microabrasión permite que entre el ADN, así que imagino que las membranas deben estar dañadas de alguna manera.
  • También he usado medios hipotónicos (dependiendo de la cepa) para hinchar las células cerca de su punto de explosión. Me imagino que se vuelven bastante permeables en este punto, ya que dejan entrar varios tintes que de otro modo quedarían excluidos.

Métodos para monitorear la contaminación ambiental

La contaminación ambiental representa una gran amenaza para la existencia sana de la humanidad. Los gobiernos de todo el mundo prestan mucha atención a monitorear y minimizar continuamente la contaminación.

El público y las organizaciones no gubernamentales (ONG) también participan activamente en esta empresa. En términos generales, hay cuatro niveles de agencias de monitoreo de la contaminación o agencias de protección ambiental (EPA).

Esto es a nivel de distrito o bloque. Las organizaciones no gubernamentales y las agencias de desarrollo rural están involucradas en el monitoreo de la contaminación.

Existente a nivel estatal, el monitoreo es realizado por las respectivas juntas estatales de control de contaminación.

Esto es a nivel nacional / país. Cada país tiene su propia agencia de protección ambiental para monitorear la contaminación.

Los organismos internacionales / intergubernamentales están estrechamente asociados con el seguimiento de la contaminación, que es un fenómeno mundial. La Organización Mundial de la Salud y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente participan activamente.

Métodos biotecnológicos para medir la contaminación:

En los últimos años, la detección y el seguimiento de la contaminación ambiental se están realizando mediante enfoques que involucran biosistemas. Para ello, se utilizan varios grupos de plantas, animales y microorganismos. Las agencias de protección ambiental (EPA) consideran el bio-monitoreo de la contaminación como un dispositivo útil para monitorear la contaminación ambiental desde el punto de diagnóstico, medidas preventivas y correctivas.

Criterios para el biocontrol de la contaminación:

Los parámetros o los criterios elegidos para el biocontrol de la contaminación son muy cruciales. Deben ser fiables, reproducibles y rentables. Se adoptan principalmente tres tipos de criterios para el biocontrol de la clasificación visual de la contaminación, la clasificación de genotoxicidad y la clasificación metabólica.

En la calificación visual, se consideran la tasa de crecimiento y la productividad. Cuando se utilizan microorganismos en el ensayo de prueba, el crecimiento se puede medir mediante análisis turbidométrico. En el caso de plantas superiores, se tiene en cuenta la tasa de crecimiento de las diferentes partes, el daño visual a las hojas, la viabilidad de las semillas y la frecuencia de germinación.

En cuanto a los animales (los peces se utilizan comúnmente), el concepto de LD50 se utiliza, es decir, la dosis a la que se ve afectado el 50% del organismo de ensayo. A veces, la presencia o ausencia de una especie particular de un organismo sirve como indicador de la contaminación ambiental.

Clasificación de genotoxicidad:

Las pruebas de genotoxicidad miden la extensión del daño causado a un organismo por la contaminación ambiental a nivel celular y subcelular. Las lesiones genotóxicas pueden detectarse en los orgánulos celulares (membranas de uso común), genomas, sistemas inmunológicos, biomoléculas, etc.

Las pruebas citotóxicas como la medición del daño cromosómico (incluida la rotura), el intercambio de cromátidas hermanas (SCE) y el recuento de micronúcleos también son útiles para la detección de contaminación. La viabilidad celular se puede medir detectando la viabilidad lisosómica in vitro. En los últimos años, se están utilizando sondas de ADN para la identificación de organismos que causan enfermedades en el agua.

Clasificación metabólica:

Los cambios bioquímicos con la contaminación ambiental se pueden medir (cualitativa y cuantitativamente) en organismos seleccionados. De hecho, ciertos parámetros metabólicos pueden usarse como biomarcadores para evaluar el estrés por contaminación. Los biomarcadores utilizados en la clasificación metabólica incluyen clorofila, proteínas, ácidos nucleicos (ADN y ARN) y cambios en las actividades enzimáticas.

Los métodos biotecnológicos adoptados para la medición de la contaminación se describen brevemente en el siguiente orden:

3. Ensayos de biología molecular

Bioensayos en Monitoreo Ambiental:

En los primeros años se utilizaron los métodos físicos y químicos convencionales para la detección de la contaminación ambiental. Se prefieren los bioensayos en estos días, ya que las respuestas biológicas que reflejan los daños a los organismos vivos son muy cruciales para la evaluación real de la contaminación.

Se espera que los organismos empleados en los bioensayos para la detección de contaminación satisfagan los siguientes criterios:

I. Debe absorber fácilmente el contaminante (absorción o adsorción).

ii. El organismo debe ser sensible al contaminante.

iii. Debe poseer características medibles para detectar la contaminación.

iv. El organismo debe tener una presencia amplia y estar disponible durante todo el año.

v. El bioensayo debe ser simple, reproducible y rentable.

Se describen brevemente las plantas y animales más utilizados en los bioensayos.

Sistemas de prueba de plantas en bioensayos:

Ciertas algas, bacterias, líquenes, musgos y macrófitos vasculares se utilizan comúnmente en bioensayos.

Entre los sistemas de plantas, los bioensayos de algas son los más utilizados. Las algas se consideran indicadores fiables de contaminación por su alta sensibilidad y fácil disponibilidad, además de sencillas técnicas de cultivo. Los criterios adoptados para los bioensayos de algas son la tasa de crecimiento, la acumulación de biomasa y la eficiencia fotosintética.

Las algas utilizadas en los ensayos de prueba incluyen Chlorella, Microcystis, Spirulina, Navicula, Scenedesmus, Anabaena, Ulva, Codium, Fucus y Laminaria. En el agua, la contaminación orgánica se puede detectar utilizando las algas verde azuladas, Microcystis, mientras que la contaminación por metales se puede medir con Navicula.

Estos se utilizan comúnmente para la detección de contaminación fecal en agua potable, siendo la prueba de coliformes la prueba más utilizada. La prueba de Ames que detecta contaminantes mutagénicos es realizada por la bacteria Salmonella. La bioluminiscencia bacteriana es una técnica reciente utilizada para la medición de contaminantes gaseosos y otros compuestos, p. Ej. dióxido de azufre, formaldehído, acetato de etilo. La fotobacteria phosphoreum es el organismo de elección para la bioluminiscencia bacteriana.

Los líquenes se utilizan ampliamente para la detección de la contaminación atmosférica por gases, especialmente en las ciudades. Los líquenes son muy sensibles para la medición de dióxido de azufre.

La contaminación ambiental por metales se puede detectar mediante el uso de ciertos musgos acuáticos y forestales, p. Stereophyllum, Sphagnum, Brynus.

Macrófitos vasculares en bioensayos:

El jacinto de agua (Eichormia crassipes) y la hierba de pato (Lemna minor) se utilizan para detectar la contaminación acuática por metales. De hecho, ciertos parámetros bioquímicos de las macrófitas se utilizan como biomarcadores de contaminación, por ejemplo, la actividad de la peroxidasa aumenta debido a la contaminación por metales, la inhibición de la actividad de la nitrato reductasa por el mercurio. Los otros parámetros de bioensayo comúnmente utilizados son la estimación de proteínas solubles, ácidos nucleicos, clorofila y análisis de actividades enzimáticas (por ejemplo, catalasa, peroxidasa).

Péptidos inducidos por contaminación en bioensayos:

Muy recientemente, algunos investigadores han identificado la presencia de pequeños péptidos dentro de las células vegetales que son inducidos por la contaminación. Estos péptidos, denominados fitoquelatinas, se forman como resultado de la contaminación por metales. Son razonablemente fiables para la detección de contaminación por metales.

Sistemas de experimentación animal en bioensayos:

Entre los animales, ciertos peces, protozoos y helmintos se emplean en bioensayos.

Los efectos tóxicos de los contaminantes ambientales en los peces se han utilizado durante bastante tiempo como medida de bioensayos. De hecho, el concepto de LD50 (es decir, la dosis del contaminante a la que se ve afectado el 50% de los organismos de ensayo) procede de los estudios en peces.

Los criterios o parámetros utilizados para la evaluación de los bioensayos en peces incluyen cambios en la morfología y los órganos, patrones de comportamiento y modificaciones en el metabolismo. Las alteraciones en la enzima acetilcolina esterasa sirven como un marcador confiable de contaminación por pesticidas. Los peces más utilizados en los bioensayos son Catla, Teleost, Labeo y Channa.

Protozoos en bioensayos:

Los protozoos ciliados sirven como buenos sistemas de bioensayo para la detección de contaminación ambiental. Los efectos tóxicos de los contaminantes se pueden medir mediante los cambios en los patrones de comportamiento de los protozoos, registrados en un etograma.

Helmintos en bioensayos:

Los rotíferos son un grupo de helmintos que crecen en la vegetación acuática. Se utilizan para la detección de materia orgánica en el agua (dada por DBO). Los rotíferos, con disponibilidad durante todo el año, fácil cultivo, tasa de crecimiento lenta y fácil reconocimiento, se utilizan para el biocontrol del agua.

Péptidos inducidos por contaminación en bioensayos:

Como ya se describió en el caso de los bioensayos de plantas (arriba), los péptidos pequeños inducidos por la contaminación también se encuentran en las células animales. Se denominan colectivamente metalotioneínas (comparables a las fitoquelatinas en las plantas). Las metalotioneínas son útiles para la detección de contaminación por metales.

Monitoreo biológico de la contaminación con múltiples especies:

Muy a menudo, los bioensayos que utilizan un solo organismo no son adecuados para detectar la contaminación. En tal caso, se utilizan múltiples especies de organismos.

Biología celular en el monitoreo ambiental:

La biología celular se ocupa del estudio de los aspectos estructurales y funcionales de las células y los orgánulos celulares. Se explota con éxito para la detección de contaminación ambiental, particularmente con referencia a mutágenos y carcinógenos.

Los métodos biológicos celulares tienen como objetivo principal rastrear los efectos nocivos de los contaminantes en diferentes componentes celulares: membranas, cloroplastos, mitocondrias, cromosomas. Además, también se utilizan las macromoléculas, a saber, los ácidos nucleicos (particularmente el ADN) y las proteínas. Además, los métodos biológicos celulares ayudan a comprender los mecanismos de toxicidad de los contaminantes.

Se describen algunos métodos biológicos celulares importantes utilizados en el control de la contaminación ambiental.

Daño de membrana en bioensayo:

La membrana plasmática, una envoltura que rodea a la célula, protege a la célula del entorno hostil. Es el primer componente celular expuesto directamente a contaminantes. Se conocen muchas sustancias tóxicas que dañan la estructura celular y sus funciones. A los efectos del bioensayo, los daños físicos causados ​​por los contaminantes o su deposición en las membranas pueden detectarse mediante microscopía de luz, contraste de fase y electrónica.

Es posible que este enfoque no siempre sea factible. Las alteraciones en las propiedades semipermeables de las membranas debidas a contaminantes pueden detectarse por pérdida de enzimas (p. Ej., Lactato deshidrogenasa), salida de electrolitos o absorción de azul tripán. Los lisosomas también son útiles como biomarcadores para medir la viabilidad celular. Esto se puede hacer mediante una prueba de retención de rojo neutro. Los lisosomas dañados no pueden retener este tinte.

En los últimos años, las técnicas de cultivo de tejidos animales y vegetales también se utilizan para el control de la contaminación. Esto es posible midiendo los daños celulares observados en los ciclos celulares. Un buen ejemplo es el uso de cultivos de linfocitos humanos para monitorear a las personas expuestas a contaminantes tóxicos.

Bioensayos citogenéticos:

Los daños genéticos de las células, reflejados por los cambios en los cromosomas, pueden utilizarse eficazmente en el biocontrol de la contaminación. Para este propósito, se prefieren animales (por ejemplo, insecto Drosophila) y plantas (por ejemplo, Arabidiopsis) con ciclos de vida más cortos. Otras plantas como el guisante, el maíz y la soja también se utilizan en bioensayos citogenéticos.

Los contaminantes pueden causar varios tipos de daños cromosómicos: fragmentación, formación de puentes y alteración de la división celular. Las alteraciones cromosómicas se pueden utilizar eficazmente para la detección de contaminación. Se ha establecido claramente que la gravedad del daño cromosómico depende de la naturaleza química del contaminante.

El daño severo a los cromosomas por contaminantes puede resultar en una fragmentación a gran escala de los cromosomas, seguida de la formación de micronúcleos. El grado de desarrollo de los micronúcleos está directamente relacionado con la gravedad del daño. La prueba de micronúcleos (MNT) se utiliza para la detección de compuestos mutagénicos.

Intercambio hermana-cromátida:

Los daños causados ​​por contaminantes dan como resultado un misexcambio de segmentos cromosómicos (cromátidas) durante la división celular. El intercambio de cromatografía hermana (SCE) se puede detectar utilizando una técnica de colorante fluorescente.

Prueba de Ames en bioensayos:

La prueba de Ames se puede utilizar para la detección de mutágenos químicos y su carcinogenicidad. Se trata de un bioensayo muy utilizado para la detección de diversos contaminantes, fármacos, cosméticos, aditivos alimentarios y metales. La prueba de Ames emplea el uso de una cepa mutante especial de bacteria llamada Salmonella typhimurium (His & # 8211). Este organismo no puede sintetizar histidina, por lo que se debe suministrar la misma en el medio para su crecimiento.

La adición de carcinógenos químicos provoca mutaciones (mutación inversa) que restauran la capacidad de esta bacteria para sintetizar histidina (His +). Al detectar la cepa de Salmonella (His +) en la colonia de placas de agar, se pueden identificar los mutágenos químicos. El ensayo de Ames puede detectar aproximadamente el 90% de los carcinógenos químicos.

Recientemente, las células de levadura (Saccharomyces cerevisae) también se utilizan para la detección de carcinógenos químicos.

Biología molecular en el monitoreo ambiental:

El uso de sondas moleculares e inmunoensayos en el seguimiento de la contaminación ambiental está ganando importancia en los últimos años. Los bioensayos biológicos moleculares son particularmente útiles para la detección de bacterias, virus y otros organismos patógenos que causan enfermedades.

Las sondas de ADN y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se pueden utilizar eficazmente para el control de la calidad del agua, en particular el agua potable. Sin embargo, estas técnicas son caras y no practicables en todos los lugares.

Las técnicas inmunológicas son útiles para la detección de contaminantes (pesticidas, herbicidas) y la identificación de patógenos que exhiben propiedades inmunológicas. Los inmunoensayos se utilizan para la medición de varios plaguicidas, p. Ej. aldrina, triazinas DDT, glifosato. Los productos metabólicos de ciertas bacterias también pueden detectarse mediante inmunoensayos. Por ejemplo, se han desarrollado sistemas de ensayo para la detección de toxinas del cólera y Salmonella.

En los últimos años está ganando importancia el uso de anticuerpos monoclonales (MAb) en la detección y biocontrol de la contaminación ambiental. De hecho, existen técnicas de ensayo para la detección de contaminación por pesticidas y herbicidas en el agua.

Bioensayos bioluminiscentes utilizando genes informadores Lux:

Ciertos genes, denominados genes indicadores de Lux, en los plásmidos producen señales evaluables. Siempre que estos genes se expresen en bacterias luminiscentes como Photobacterium y Vibrio. Algunas cepas bacterianas se han desarrollado mediante la clonación de genes (empleando genes informadores Lux) para la detección de contaminantes y su degradación. Por ejemplo, se pueden usar Pseudomonas genéticamente alteradas para detectar naftaleno, xileno, tolueno y salicilato.

Biosensores en el monitoreo ambiental:

Un biosensor es un dispositivo analítico que contiene un material biológico inmovilizado (enzima, orgánulo, célula) que puede interactuar específicamente con un analito (un compuesto cuya concentración se va a determinar) y producir señales físicas, químicas o eléctricas que se pueden medir. Los biosensores son muy específicos y precisos en su función. Los detalles sobre los biosensores: principios de funcionamiento, tipos y diversas aplicaciones se describen en otra parte. Se describen brevemente algunos de los biosensores importantes utilizados en el control de la contaminación ambiental.

Demanda biológica de oxígeno (DBO5) es una prueba ampliamente utilizada para la detección de contaminación orgánica. Esta prueba requiere cinco días de incubación. Un biosensor de DBO que utiliza la levadura Trichosporon cutaneum con sonda de oxígeno tarda solo 15 minutos en detectar la contaminación orgánica.

Biosensores microbianos para la detección de gases como el dióxido de azufre (SO2), se han desarrollado metano y dióxido de carbono. El biosensor basado en tiobacilos puede detectar el contaminante SO2, mientras que el metano (CH4) puede detectarse mediante Methalomonas inmovilizadas. Para el control del dióxido de carbono, se utiliza una cepa particular de Pseudomonas.

Biosensores de inmunoensayo:

Los inmunoelectrodos como biosensores son útiles para la detección de bajas concentraciones de contaminantes. Los anticuerpos específicos de plaguicidas pueden detectar la presencia de bajas concentraciones de triazinas, malatión y carbamatos mediante el empleo de inmunoensayos.

Otros biosensores:

Se pueden utilizar biosensores que emplean acetilcolina esterasa (obtenida de RBC bovino) para la detección de compuestos organofosforados en agua. De hecho, los monitores portátiles de plaguicidas están disponibles comercialmente en algunos países desarrollados. Se han desarrollado biosensores para la detección de bifenilos policlorados (PCB) e hidrocarburos clorados y algunos otros compuestos orgánicos.

La enzima fenol oxidasa (obtenida de patatas y setas) que contiene biosensor se utiliza para la detección de fenol. Se ha desarrollado un electrodo de grafito con Cynobacterium y Synechococcus para medir el grado de inhibición del transporte de electrones durante la fotosíntesis debido a ciertos contaminantes, p. Ej. herbicidas.

En la Tabla 54.1 se presenta una lista seleccionada de contaminantes ambientales medidos mediante el empleo de biosensores.


INTRODUCCIÓN

Las membranas biológicas son componentes esenciales de los sistemas vivos. Forman un límite entre la célula y su entorno, median la transducción de señalización intracelular y las comunicaciones de célula a célula y establecen un límite permeable selectivo que solo permite que ciertas moléculas entren o salgan de la célula. En los organismos eucariotas, las membranas dividen la célula en compartimentos subcelulares discretos que segregan reacciones metabólicas vitales pero, en muchos casos, incompatibles.La estructura fundamental de las membranas celulares es la bicapa que comprende dos láminas de moléculas de lípidos, en las que se incrustan parcial o totalmente proteínas con funciones importantes, como enzimas en sistemas de transducción de energía, receptores y transportadores. De acuerdo con el modelo de mosaico de fluidos (Singer y Nicolson, 1972), una propiedad crítica de las membranas biológicas es que están presentes en un estado fluido en el que los lípidos y las proteínas se unen libremente entre sí a través de interacciones químicas y las moléculas individuales generalmente pueden hacerlo. rotar y mover lateralmente. Dicha fluidez es importante para las funciones asociadas a la membrana, como el transporte, la síntesis de biomoléculas, la transducción de energía y la señalización celular, y está influenciada tanto por la temperatura como por la composición de lípidos (Ernst et al., 2016 Los y Murata, 2004 van Meer et al., 2008 ).

Además de su papel estructural, los lípidos de membrana regulan la localización, estructura y función de las proteínas de membrana mediante interacciones lípido-lípido y lípido-proteína y mediante efectos físicos (Harayama y Riezman, 2018 van Meer et al., 2008 Nyholm, 2015 Quinn, 2012). Algunos lípidos pueden definir microdominios de membrana que sirven como plataformas de clasificación y centros para la maquinaria de transducción de señales celulares para una amplia gama de procesos metabólicos (Levental et al., 2020 Sezgin et al., 2017). Los lípidos también juegan un papel crucial en los eventos de fusión de membranas críticos para la división celular, la proliferación de orgánulos y el tráfico de membranas (Harayama y Riezman, 2018 van Meer et al., 2008). Además, se sabe que algunos lípidos funcionan directamente en las vías de señales celulares como mensajeros o reguladores (Sunshine e Iruela-Arispe, 2017).

Los lípidos de membrana se pueden agrupar en cuatro clases principales: fosfolípidos, glicolípidos, esteroles y esfingolípidos (Figura 1) (Harayama y Riezman, 2018). Los fosfolípidos y glicolípidos son lípidos a base de glicerol que constan de dos ácidos grasos hidrófobos unidos al sn-1 y sn-2 posiciones y un grupo fosfato o un resto de azúcar a la sn-3 posición de una columna vertebral de glicerol. El grupo fosfato de los fosfolípidos puede ser modificado por un alcohol polar como colina, etanolamina, glicerol, inositol y serina, lo que da a estas clases de lípidos sus nombres fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilinositol (PI). ) y fosfatidilserina (PS), respectivamente. Los ácidos grasos de los fosfolípidos y glicolípidos varían en longitud de cadena, grado de saturación y posición de doble enlace. Los fosfolípidos son los lípidos de membrana más abundantes tanto en levaduras como en mamíferos. En los tejidos fotosintéticos de las plantas, sin embargo, los glicolípidos que incluyen galactolípidos monogalactosildiacilglicerol (MGDG) y digalactosildiacilglicerol (DGDG) y el sulfolípido sulfoquinovosildiacilglicerol (SQDG) son mucho más abundantes que los fosfolípidos. Los esteroles son un subgrupo de esteroides con una estructura característica que consta de cuatro anillos de átomos de carbono, mientras que los esfingolípidos se definen por la presencia de una base esfingoide unida covalentemente a un ácido graso mediante un enlace amida. Además de la diversidad estructural, las diferentes clases de lípidos de membrana no se distribuyen por igual entre tejidos, orgánulos o incluso entre dos valvas de la misma membrana, sino que tienen ubicaciones específicas, y la acción colectiva de sus voluminosos lípidos define la identidad y función. de diferentes orgánulos (Harayama y Riezman, 2018 van Meer et al., 2008). Por ejemplo, en las plantas, los galactolípidos se encuentran exclusivamente en cloroplastos, mientras que los esteroles y esfingolípidos están enriquecidos en microdominios lipídicos de la membrana plasmática. Los galactolípidos juegan un papel clave en la biogénesis de las membranas fotosintéticas y son importantes para la función óptima de los complejos pigmento-proteína fotosintéticos incrustados en plantas superiores (Kobayashi, 2016).

Representación esquemática de las estructuras químicas de los lípidos de membrana y las formas moleculares de los lípidos.

(a – n) Estructuras de lípidos de membrana. Los lípidos de membrana se subdividen en cuatro categorías principales: fosfolípidos (b – g), glicolípidos (h – j), esfingolípidos (a) y esteroles (l). El triacilglicerol (TAG) es un glicerolípido de almacenamiento (m). Las clases de fosfolípidos se definen por los grupos de cabeza hidrófilos (R) unidos a la sn-3 posición de la columna vertebral de glicerol. Los esfingolípidos constituyen una gran categoría de lípidos con diversas cadenas de acilo y grupos de cabeza (X). (o) Representación esquemática de formas moleculares de lípidos.

Los lípidos son los principales determinantes de las propiedades fisicoquímicas de las membranas celulares, que a su vez son cruciales para las funciones de la membrana (Ernst et al., 2016 Harayama y Riezman, 2018). Tanto la naturaleza del grupo de la cabeza de los glicerolípidos como la longitud y el grado de saturación de sus cadenas de acilo influyen en las propiedades físicas de la membrana, como la fluidez, la permeabilidad, el grosor de la bicapa, la carga y la curvatura intrínseca. En este contexto, los glicerolípidos con un grupo de cabeza relativamente grande, como PC y DGDG, se aproximan a una forma molecular cilíndrica y tienden a formar fases lipídicas bicapa sin deformación por curvatura. Por el contrario, las formas de PE y MGDG son más cónicas, debido a la presencia de grupos de cabezas relativamente pequeños. Imponen una tensión de curvatura negativa en las membranas y son propensos a formar estructuras lipídicas no bicapa en las membranas. Los lípidos aniónicos PG, SQDG, PI y PS son determinantes clave de la carga de la superficie de la membrana y, por lo tanto, juegan un papel crucial en la mediación de las interacciones lípido-proteína (Harayama y Riezman, 2018 Jouhet, 2013) (Figura 1). Los esteroles interactúan más favorablemente con las cadenas de acilo saturadas que con las insaturadas de fosfolípidos (Nyholm et al., 2019 Nystrom et al., 2010). Estas interacciones regulan la fluidez de la membrana, la estabilidad de la bicapa lipídica y la formación del microdominio de la membrana. Además de la composición de la clase de lípidos, las propiedades físicas y la función de la membrana también dependen de la composición de ácidos grasos de las moléculas de lípidos. En general, los lípidos con ácidos grasos saturados disminuyen la fluidez de la membrana debido al empaquetamiento apretado de las colas de acilo saturadas rectas y las interacciones más fuertes de las cadenas de acilo saturadas con esteroles. El empaque de lípidos insaturados, por otro lado, aumenta la fluidez de la membrana porque cis Los dobles enlaces crean una curva rígida que evita el empaquetamiento apretado de sus ácidos grasos (Harayama y Riezman, 2018 Munro, 2003). Además del grado de desaturación de los ácidos grasos, la longitud de la cadena de acilo y su distribución posicional en la columna vertebral de glicerol afectan la organización y la dinámica de las membranas.

Las composiciones de lípidos de la membrana se determinan mediante una variedad de procesos metabólicos, que incluyen la biosíntesis, el transporte, la renovación, la remodelación y la degradación de los lípidos. Los glicerolípidos son componentes estructurales importantes de las membranas celulares. Los pasos y vías enzimáticos implicados en la biosíntesis de glicerolípidos están bien definidos y los mecanismos de transporte de lípidos están bien estudiados. Sin embargo, se sabe mucho menos sobre los procesos moleculares que subyacen a las modificaciones de los lípidos después de su síntesis. Esta revisión resumirá nuestro conocimiento actual sobre modificaciones post-sintéticas de ácidos grasos y grupos de cabeza, con un enfoque en las enzimas candidatas involucradas en la remodelación de cadenas de acilo y grupos de cabeza de glicerolípidos. Además, discutiremos el papel funcional del metabolismo de TAG en la remodelación de lípidos. Finalmente, se resumirá nueva información sobre las funciones de remodelación de lípidos de membrana.


Clasificación de toxinas | Microbiología

Según la actividad y la timidez, las toxinas se dividen en tres tipos: tipo I (que actúan sobre la membrana celular), tipo II (que atacan la membrana celular) y tipo III (que penetran en la membrana y que actúan dentro de la célula).

1. Toxinas transductoras de membrana:

Este tipo de toxinas son toxinas de tipo I que dañan las células huésped por medios sutiles mediante la activación inapropiada de los receptores celulares. Envían un mensaje incorrecto a la celda que confunde las rutas normales de comunicación.

Los ejemplos son: la toxina estable (ST) de E. coli y la toxina emética de B. cereus. El ST se une a los receptores de membrana para estimular la guanil ciclasa y dar lugar al mensaje intracelular (cGMP). El cGMP activa la proteína quinasa G y modula varias vías de señalización.

Las toxinas superantigénicas bacterianas estimulan directamente la respuesta inmune actuando como mitógenos. Se unen al receptor de linfocitos T y al antígeno del MHC de clase II directamente y activan uno o varios grupos de aproximadamente el 5-20% de los linfocitos T.

Ejemplos de superantígenos son enterotoxinas (que causan intoxicación alimentaria) y exotoxinas (que causan calcetín tóxico) de S. aureus y toxinas eritrogénicas de S. pyogenes.

2. Toxinas que dañan la membrana:

Este grupo de toxinas se llama toxinas de tipo II que actúan directamente sobre la membrana celular, forman agujeros que resultan en la muerte celular.

Se han identificado y categorizado más de 100 toxinas en varios grupos como se indica a continuación:

I. Toxinas formadoras de poros:

Estas toxinas entran en la membrana celular como oligómeros y forman poros. El tamaño de los poros difiere según las diferentes toxinas. Algunas toxinas formadoras de poros tienen actividad celular, es decir, invocan la producción de citocinas. Además, muchas toxinas intracelulares inducen poros debido a la translocación de sus dominios catalíticos a través de la membrana hacia el citosol.

Las toxinas que ingieren colesterol activadas por tio son producidas por cuatro géneros de bacterias Gram-positivas, por ejemplo, especies de Streptococcus (por ejemplo, estreptolisina O, neumolisina).

Listeria (listerolisina O, ivanolisina), Clostridium (tetanolisina, perfringolisina O, septicolisina O, histolitolisina O, chauveolisina) y Bacillus (cereolisina O, alveolisina, turingolisina O). Estas toxinas atacan a las células que contienen colesterol en su membrana y forman poros de aproximadamente 30-40 nm que tienen 30 monómeros.

Las bacterias gramnegativas producen toxinas RTX, por ejemplo, E. coli, hemolisina, leucotoxinas de Pasteurella haemolytica, Proteus, adenilato ciclasa de Bordetella. Estas toxinas forman poros de aproximadamente 1-2 nm que constan de 7 monómeros y dañan la función normal de las células huésped. La toxina α de S. aureus forma poros en la célula huésped, lo que provoca la muerte celular por apoptosis.

ii. Toxinas que dañan la membrana enzimáticamente:

Hay muchas toxinas que dañan enzimáticamente la membrana celular del huésped. Por ejemplo, fosfolipasas producidas por L. monocytogenes, S. aureus, P. aeruginosa, B. cereus y Aeromonas. La fosfolipasa C (PLC) o toxina α de C. perfringens tiene actividad necrótica y citolítica. PLC de P. aeruginosa daña el surfactante pulmonar en humanos. Las proteasas producidas por Porphyromonas gingivalis están implicadas en la enfermedad de las encías.

3. Toxinas intracelulares:

Se trata de toxinas de tipo III que actúan de la forma más sutil. Actúan en diferentes etapas (Fig. 27.22). Tienen que obtener acceso intracelular, sobrevivir al ataque de proteasas y protones y engañar a la célula para que llegue a su objetivo y destruir enzimáticamente. Son el grupo de toxinas más letal, por ejemplo, las neurotoxinas botulínicas y tetánicas son letales para los humanos en una dosis de aproximadamente 0,1 ng y afectan los nervios.

Las neurotoxinas de C. botulinum y C. tetani actúan como proteasa. Bloquean la función de los nervios periféricos y causan una parálisis flácida, estimulan la adenilato ciclasa (cAMP), cuya alta concentración causa una acumulación masiva de líquido en la luz del intestino que produce un efecto acuoso sobre la función inmunológica. La toxina del tétanos ataca las células nerviosas del SNC y sus efectos son más dramáticos y provocan espasmos musculares y parálisis rígida.

El factor letal del ántrax (LF) es una proteasa de zinc que escinde el extremo N de la quinasa MAP (proteína activada por mitógenos) para inactivarla.


La sal causa muerte celular programada inducida por desequilibrio iónico en levaduras y plantas

La muerte celular programada (PCD) es un proceso celular fundamental conservado en metazoos, plantas y levaduras. Se presenta evidencia de que la sal induce PCD en levaduras y plantas debido a una etiología iónica, más que osmótica. En la levadura, el NaCl inhibió el crecimiento y provocó una reducción de la viabilidad dependiente del tiempo que fue precedida por la fragmentación del ADN. El NaCl también indujo las características citológicas de la PCD de tipo lisígena, incluida la fragmentación nuclear, la vacuolación y la lisis. La proteína anti-apoptótica humana Bcl-2 aumentó la tolerancia a la sal de la cepa de levadura de tipo salvaje y la levadura mutante deficiente en calcineurina (cnb1Δ) que es defectuoso para la homeostasis iónica, pero no tuvo ningún efecto sobre la sensibilidad al NaCl o al sorbitol de la hipersensibilidad osmótica hog1Δ mutante: resultados que vinculan aún más a la PCD en la respuesta al desequilibrio iónico bajo estrés salino. Supresión de Bcl-2 de cnb1Δ la sensibilidad a la sal fue ENA1 (Gen ATPasa tipo P) dependiente, debido en parte a la activación transcripcional. PCD inducida por sal (tinción TUNEL y escalonamiento del ADN) en las raíces primarias de ambos Arabidopsis thaliana tipo salvaje (Col-1 gl1) y sos1 Las plántulas mutantes (demasiado sensibles a la sal) se correlacionaron positivamente con la letalidad del tratamiento. Las plantas de tipo silvestre sobrevivieron a niveles de estrés salino que fueron letales para sos1 plantas porque las raíces secundarias se produjeron a partir de la zona de transición brote / raíz. La eliminación de la raíz primaria mediada por PCD en respuesta al choque salino parece ser un mecanismo adaptativo que facilita la producción de raíces más capaces de hacer frente a un ambiente salino. Ambos mutantes de levadura sensibles a la sal (cnb1Δ) y Arabidopsis (sos1) exhiben síntomas de PCD sustancialmente más profundos, lo que indica que la PCD inducida por sal está mediada por desequilibrio iónico.


CONCLUSIONES

Claramente, una comprensión de la tolerancia a la desecación requerirá una mejor comprensión de las funciones moleculares de los azúcares y las hidrofilinas en la desecación. Se obtendrán conocimientos importantes al identificar los objetivos críticos de estos efectores de estrés. De hecho, se puede postular que muchas proteínas de la célula podrían agregarse sin afectar la viabilidad celular. Asimismo, la mayoría de los agregados se pueden eliminar y reemplazar con nuevas proteínas mediante la expresión génica de novo. Obviamente, esta estrategia de reemplazo requiere que la maquinaria de reemplazo, como la ARN polimerasa II, las proteínas chaperoninas o los ribosomas, permanezcan funcionales. Estas proteínas pueden ser los objetivos críticos de trehalosa y / o Hsp12. De manera similar, es posible que solo sea necesario proteger un subconjunto de membranas. Por ejemplo, la pérdida de la integridad de la membrana mitocondrial es irreversible y letal, mientras que los agujeros transitorios en la membrana plasmática pueden tolerarse parcialmente si se arreglan (van Meer et al., 2008). Identificar el subconjunto de proteínas y membranas que deben protegerse será un desafío difícil pero importante en el futuro.

También es muy probable que el estudio de la trehalosa y las hidrofilinas proporcione información sobre la biología del estrés más allá de la desecación. Primero, en la levadura y en otros organismos la trehalosa y las hidrofilinas se expresan en condiciones acuosas, particularmente bajo diferentes tensiones (Singer y Lindquist, 1998 Garay-Arroyo et al., 2000 François y Parrou, 2001 Battaglia et al., 2008 De Virgilio, 2012). Además, las células en división que carecen de trehalosa e hidrofilina tienen un fenotipo inusual, la incapacidad de propagar un prión asociado a la membrana (Kim et al., 2018). Estos resultados plantean la posibilidad de que las actividades efectoras de estrés de la membrana, o aún por descubrir, de la trehalosa y las hidrofilinas puedan estar en juego incluso en condiciones acuosas. En segundo lugar, un estudio reciente de Kurzchalia y sus colegas mostró que una vía metabólica específica, la enigmática derivación de glioxilato anterior, era fundamental para la tolerancia a la desecación (Erkut et al., 2016). Este trabajo inspira la búsqueda de otras vías metabólicas que pueden ser críticas para otras respuestas al estrés. Finalmente, el hecho de que solo un subconjunto de hidrofilinas impactan en la desecación plantea una pregunta importante. ¿Cuál es la función de las otras hidrofilinas? Los estudios de localización de las otras hidrofilinas sugieren que pueden estar dirigidas a ubicaciones subcelulares específicas donde están realizando funciones aún por descubrir (Candat et al., 2014). El estudio de la tolerancia a la desecación, al igual que los estudios previos de extremos biológicos, está abriendo nuevas puertas en biología.


Cómo los ácidos grasos saturados dañan las células

En nuestra sociedad cada vez más consciente de la salud, parece surgir una nueva dieta de moda cada pocos años. Atkins, Zone, Ketogenic, Vegetarian, Vegan, South Beach, Raw: con tantas opciones y evidencia científica para respaldar cada una, es difícil saber qué es saludable y qué no. Sin embargo, ha quedado un mensaje en todo momento: las grasas saturadas son malas.

Un nuevo estudio de la Universidad de Columbia revela por qué.

Si bien los médicos, nutricionistas e investigadores saben desde hace mucho tiempo que las grasas saturadas contribuyen a algunas de las principales causas de muerte en los Estados Unidos, no han podido determinar cómo o por qué el exceso de grasas saturadas, como las que se liberan de la manteca de cerdo , son tóxicos para las células y causan una amplia variedad de enfermedades relacionadas con los lípidos, mientras que las grasas insaturadas, como las del pescado y el aceite de oliva, pueden ser protectoras.

Para encontrar respuestas, los investigadores de Columbia desarrollaron una nueva técnica de microscopía que permite el seguimiento directo de los ácidos grasos después de que han sido absorbidos por las células vivas. La técnica consiste en reemplazar los átomos de hidrógeno en los ácidos grasos con su isótopo, el deuterio, sin cambiar sus propiedades fisicoquímicas y su comportamiento como lo hacen las estrategias tradicionales. Al hacer el cambio, todas las moléculas hechas de ácidos grasos se pueden observar dentro de las células vivas mediante una técnica de imagen avanzada llamada microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS).

Lo que los investigadores encontraron al usar esta técnica podría tener un impacto significativo tanto en la comprensión como en el tratamiento de la obesidad, la diabetes y las enfermedades cardiovasculares.

Publicado en línea el 1 de diciembre de Actas de la Academia Nacional de Ciencias (PNAS), el equipo informa que el proceso celular de construcción de la membrana celular a partir de ácidos grasos saturados da como resultado parches de membrana endurecida en los que las moléculas se "congelan". En condiciones saludables, esta membrana debe ser flexible y las moléculas fluidas.

Los investigadores explicaron que las cadenas largas, rígidas y rectas de ácidos grasos saturados endurecen las moléculas de lípidos y hacen que se separen del resto de la membrana celular. Bajo su microscopio, el equipo observó que esas moléculas de lípidos se acumulan en "islas" o cúmulos apretados que no se mueven mucho, un estado que ellos llaman "sólido". A medida que ingresan más ácidos grasos saturados a la célula, esas islas aumentan de tamaño, creando una creciente inelasticidad de la membrana y dañando gradualmente toda la célula.

"Durante mucho tiempo, creímos que toda la membrana celular es similar a un líquido, lo que permite que las proteínas incrustadas cambien su forma y realicen reacciones", dijo el investigador principal Wei Min, profesor de química. "Antes, apenas se observaba una membrana de tipo sólido en células de mamíferos vivos. Lo que vimos fue bastante diferente y sorprendente".

Las moléculas de lípidos hechas de ácidos grasos insaturados, por otro lado, tienen una torcedura en sus cadenas, dijo Min, lo que hace imposible que estas moléculas de lípidos se alineen estrechamente entre sí como lo hacen las saturadas. Continúan moviéndose libremente en lugar de formar grupos estacionarios. En su movimiento, estas moléculas pueden empujar y deslizarse entre las cadenas de ácidos grasos saturados apretados.

"Descubrimos que la adición de ácidos grasos insaturados podría 'derretir' las islas de la membrana congeladas por los ácidos grasos saturados", dijo el primer autor Yihui Shen, un estudiante de posgrado en el laboratorio de Min. Este nuevo mecanismo, dijo, puede explicar en parte el efecto beneficioso de los ácidos grasos insaturados y cómo las grasas insaturadas como las del aceite de pescado pueden ser protectoras en algunos trastornos de los lípidos.

El estudio representa la primera vez que los investigadores pudieron visualizar la distribución y la dinámica de los ácidos grasos con tanto detalle dentro de las células vivas, agregó Shen, y reveló un estado físico tóxico previamente desconocido de la acumulación de lípidos saturados dentro de las membranas celulares.

"El comportamiento de los ácidos grasos saturados una vez que han entrado en las células contribuye a enfermedades importantes y, a menudo, mortales", dijo Min. "Visualizar cómo los ácidos grasos contribuyen a la enfermedad metabólica de los lípidos nos da la información física directa que necesitamos para comenzar a buscar formas efectivas de tratarlos. Quizás, por ejemplo, podamos encontrar una manera de bloquear la acumulación de lípidos tóxicos. Estamos emocionados . Este hallazgo tiene el potencial de afectar realmente la salud pública, especialmente para las enfermedades relacionadas con los lípidos ".


3 principales enfermedades causadas por hongos en los seres humanos

Algunos agáricos (hongos) son venenosos para los seres vivos. El tipo más grave de intoxicación por hongos es causado por especies pertenecientes al género Amanita. Un error puede provocar molestias gastrointestinales muy desagradables o incluso la muerte. Amanita phalloides (el casquete de la muerte) es muy venenosa y responsable de la mayoría de las muertes por envenenamiento por hongos.

Una mezcla de tres toxinas, α-amanitina, β-amamtina y faloidina, es la causa del envenenamiento. Amanita muscaria (agárico de mosca) y A. pantherina (gorro de pantera) también son venenosas.

Además de Amantia, algunos otros hongos venenosos son Russula, Lactarius, Boletus, Entoloma, etc. Los síntomas del envenenamiento por hongos son: náuseas, vómitos, dolor abdominal y alteraciones visuales. El afectado finalmente cae en coma y puede sucumbir.

Enfermedad # 2. Micotoxicosis:

Las toxinas producidas por hongos se denominan micotoxinas. Una de las micotoxinas más importantes es la aflatoxina producida por algunas especies de Aspergillus (especialmente A. flavus). Las anatoxinas pueden ser letales para las aves de corral.

Pueden causar daño de palanca y se sospecha que inducen cáncer en humanos. Claviceps purpurea produce alcaloides del cornezuelo de centeno que, si se mezclan con harina de centeno, pueden provocar una intoxicación grave. Los dedos de las manos, los brazos y las piernas, a veces los ojos y la nariz se vuelven gangrenosos, se marchitan y se caen sin sangrar.

Algunos hongos como Stachybotrys atra, Pithomyces chartarum y algunos Fusarium spp. producen micotoxinas que afectan a animales grandes como nórdicos, ovejas y ganado. Desarrollan eccema facial y daño hepático mientras se alimentan de pasto contaminado.

Enfermedad # 3. Micosis:

Se considera que alrededor de una quinta parte de la población mundial (unos 800 millones) padece o ha padecido micosis. Las micosis se pueden considerar de dos tipos: micosis superficiales y micosis profundas.

(i) Micosis superficiales:

Las micosis superficiales son desagradables pero no letales. La piel, el cabello y las uñas están infectados. Los hongos que causan micosis superficiales se denominan dermatofitos y las enfermedades que provocan se denominan dermatofitosis.

Varias especies de los géneros Microsporon, Epidermophyton y Trichophyton son importantes dermatofitos. Malassezia furfur es el agente de la pitiriasis versicolor (caspa): Microsporum andouini es el agente de la mayoría de los casos de tiña del cuero cabelludo en los niños.

(ii) Micosis profundamente arraigadas:

Las micosis profundamente arraigadas son peligrosas y pueden llegar a ser fatales si no se tratan. Desafortunadamente, el diagnóstico de micosis a menudo es difícil porque no hay & # 8216 síntomas de micosis & # 8217 específicos. El aislamiento y la identificación del patógeno es el único método para identificar la enfermedad.

Se conocen aproximadamente 15 micosis de escala profunda, por ejemplo, coccidioidomicosis, blastomicosis, candidiasis, ficomiosis subcutánea, esporotricosis, cromomicosis, mucormicosis, geotricosis y micetoma.

Los detalles de algunos importantes se dan a continuación:

Causada por Aspergillus fumigatus que ataca a los coches, los pulmones, etc. La aspergilosis pulmonar se diagnostica como T.B.

Popular como 'enfermedad de Gilchrist & # 8217s & # 8217. En etapas tempranas provoca tos, dolores en el pecho y debilidad tras la formación de nódulos subcutáneos, abscesos o lesiones en cara y brazo. Blastomyces dermitidis es el organismo causal.

Es causada por Candida albicans, las membranas mucosas de la piel, los pulmones, etc. son atacadas. Ammons y col. (1977) han enumerado candidiasis cutánea, candidiasis oral, candidiasis pulmonar, candidiasis volvovaginal y broncocandidiasis como algunas de las infecciones.

Infección más o menos localizada y crónica de la piel y tejidos subcutáneos por Cladosporium carrionii, Phialophora verrucosa, P. pedrosoi, etc.

Caracterizado por las lesiones limitadas al tracto respiratorio superior y pulmones. En humanos es causada por Coccidioides immitis.

El sistema nervioso central se ve afectado por esta enfermedad causada por Cryptococcus neoformans, afecta la visión y provoca insuficiencia respiratoria.

Esta enfermedad es causada por Emmonsiella capsulata. Está muy extendido y es grave en los seres humanos y, en ocasiones, incluso es mortal.

Es una infección oral pulmonar, bronquial o intestinal en humanos causada por Geotrichum candidum.

Sin embargo, los animales de sangre caliente también están infectados por hongos que causan micosis. Ejemplos: ganado (Trichophyton verrucosum) y aves (Aspergillus fumigatus, Candida albicans).


Resultados

N. oceanicaLa vía biosintética de esteroles comparte características en la estructura y los perfiles de esteroles con los de animales y plantas.

Entre los diferentes organismos, la vía biosintética del núcleo del esterol consiste en un conjunto común de enzimas que exhiben una fuerte conservación en las secuencias de aminoácidos, sin embargo, la arquitectura de la vía y la especificidad del sustrato pueden variar significativamente [1]. En silico La reconstrucción y comparación de las vías biosintéticas de los esteroles entre 12 especies de algas seleccionadas reveló características estructurales intrigantes de la N. oceanica vía, que incluyen características de plantas y animales superiores (Figura 1 y archivo adicional 1).

Conservación de genes biosintéticos de esteroles en algas eucariotas. La clave de color (arriba) indica la similitud del gen con la coincidencia más cercana y varía desde una similitud baja (negro) hasta una similitud alta (rojo). Las áreas negras indican que no hay impacto de Blastp por debajo del umbral de valor e aplicado (1e-5). Las áreas rojas indican ortólogos con valores Blastp e inferiores a 1e-100. El color en el mapa de calor se escala en columnas según los valores de bits de los resultados de tblastn (archivo adicional 1). Abreviaturas: alga roja Cyanidioschyzon merolae (Cm), diatomea Phaeodactylum tricornutum (Pt), diatomea Thalassiosira pseudonana (Tp), diatomea Fragilariopsis cylindrus (Fc), eustigmatofito N. oceanica (No), alga marrón Ectocarpus siliculosus (Es), alga verde Ostreococcus tauri (Ot), alga verde Micromonas sp. RCC299 (Mi), alga verde Chlorella variabilis NC64A (Cv), alga verde Coccomyxa subellipsoidea C-169 (Cs), alga verde Chlamydomonas reinhardtii (Cr) y alga verde Volvox carteri (Vc). Ver archivo adicional 2: Figura S1 para el árbol filogenético de las especies muestreadas.

La vía sintética del esterol de N. oceanica incluye características más parecidas a las de una planta. Las plantas superiores tienen dos enzimas esterol metiltransferasa (SMT) que utilizan diferentes sustratos para producir fitoesteroles metilados (SMT1) o etilados (SMT2). En el N. oceanica genoma, se identificaron dos genes candidatos que codifican SMT, que se asemejan a los de las plantas superiores en la secuencia primaria. En contraste, la diatomea Phaeodactylum tricornutum y varias algas verdes que incluyen Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella variabilis NC64A, Coccomyxa subellipsoidea C-169 y Volvox carteri tienen un único gen candidato que codifica SMT (Figura 1, consulte el archivo adicional 2: Figura S1 para el árbol filogenético de las especies muestreadas) que potencialmente cataliza reacciones de metilación sucesivas para dar productos metilados y etilados.

Las características que se comparten con los animales también estaban presentes en la vía sintética del esterol de N. oceanica. En las microalgas muestreadas, la enzima clave que cataliza la reducción de la cadena lateral del esterol es diferente de la de Arabidopsis y plantas superiores en general. En las plantas superiores, la enzima, a saber, el esterol 24 (28) isomerasa-reductasa, está codificada por el DWF1 gen en Arabidopsis y realiza funciones duales. Cataliza la isomerización del doble enlace C-24 (28) para formar un doble enlace 24 (25), seguido de la reducción del doble enlace 24 (25). En animales y levaduras, las enzimas equivalentes son la 24-deshidrocolesterol reductasa (DHCR24) y la esterol C-24 (28) reductasa (ERG4), que solo catalizan la reacción de reducción. No se han encontrado ortólogos DWF1 o DHCR24 en algas excepto en N. oceanica y la diatomea Fragilariopsis cylindrus. El análisis de la secuencia de aminoácidos indica que N. oceanica el esterol 24 (25) reductasa se agrupa con el de los coanoflagelados (los parientes unicelulares vivos más cercanos de los animales [28]) y tiene una mayor similitud con el animal DHCR24 que con la planta superior DWF1 (archivo adicional 2: Figura S2). Por tanto, la evidencia basada en DWF1 / DHCR24 sugiere características de una vía biosintética de esteroles de tipo animal.

Para probar estas características predichas de la vía biosintética de los esteroles, caracterizamos el perfil químico de los esteroles en N. oceanica IMET1, que reveló una composición animal de esteroles. En N. oceanica, se identificaron cinco esteroles (las estructuras de esteroles se indican como números en negrita en el archivo adicional 2: Figura S3 y en el texto siguiente). Colesterol (2) es el esterol más abundante, que comprende del 70% al 75% del total (Cuadro 1). Los esteroles restantes son fucosterol (11), isofucosterol (13), 24-metilcolesta-5, 25 (27) -dienol (10) y 24-metilencolesterol (7) (Archivo adicional 2: Figura S3). En N. oceanica, no se encuentran esteroles con un doble enlace C-22, lo que respalda la ausencia de CYP710A (una C-22 desaturasa Figura 1). Aunque estaba presente una proteína (g4528) con similitud a CYP710A, su secuencia primaria está más cerca de la de CYP51 que de CYP710A (archivo adicional 1). La falta de CYP710A es una característica típica de los animales, ya que los genomas de plantas superiores generalmente codifican CYP710A altamente conservado. Además, se conserva el doble enlace de la cadena lateral formado por los SMT, lo que respalda la presencia de una DHCR24 de tipo animal (archivo adicional 2: Figura S2). Esto se ve reforzado por la acumulación de una gran cantidad de colesterol en N. oceanica (Tabla 1), que es el único esterol en animales. Por otro lado, solo una pequeña cantidad de los fitoesteroles, que son las formas dominantes de esteroles en las plantas superiores, se encontró en N. oceanica (Tabla 1). Por lo tanto, N. oceanica Los perfiles de esteroles exhiben características tanto de animales como de plantas superiores.

Además, adoptamos un enfoque de biología química para investigar la arquitectura de la vía biosintética de esteroles, en la que N. oceanica fue tratado con una serie de inhibidores biosintéticos de isoprenoides y esterol (IBS). (Consulte la Figura 2 para las enzimas diana y el archivo adicional 2: Figura S4 para las proporciones de inhibición). Los fenotipos de los mutantes biosintéticos de esteroles se pueden imitar mediante la aplicación de inhibidores químicos específicos, que son herramientas poderosas para dilucidar la biosíntesis y las funciones de los esteroles. [29-33], particularmente cuando un sistema de eliminación de genes dirigido aún no está disponible para N. oceanica IMET1. Los inhibidores químicos que empleamos aquí han sido bien estudiados y se han establecido las especificidades de sus correspondientes enzimas [34-38].

Vía deducida de la biosíntesis de esteroles en N. oceanica , comparación entre plantas, seres humanos y levaduras, y sitios de acción de los inhibidores. La nomenclatura enzimática es la que se utiliza habitualmente en Arabidopsis, porque aunque muchas enzimas humanas y de levadura tienen diferentes nombres y abreviaturas, catalizan reacciones equivalentes a las del Arabidopsis enzimas. Una excepción es Arabidopsis DWF1 (una isomerasa-reductasa dual), que está ausente en Nanocloropsis en cambio, esta alga tiene una DHCR24 de tipo humano (el equivalente de levadura es ERG4). Los nombres completos y las funciones de las enzimas se proporcionan en el archivo adicional 3: Tabla S1. La lanosterol sintasa (LAS) se encuentra en Arabidopsis pero tiene un papel menor. Abreviaturas de las enzimas: DXS, 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato sintasa HMGR, hidroxi-metil-glutaril-CoA reductasa HMGS, hidroxi-metil-glutaril-CoA sintasa SQE, escualeno epoxidasa CAS, cicloartenol sintasa LAS, laTosterol sintasa SM esterol metiltransferasa SMO, esterol 4-metil oxidasa CPI, cicloeucalenol cicloisomerasa CYP51, esterol 14-alfa desmetilasa FK, esterol C-14 reductasa HYD, esterol C-8 isomerasa DWF7, delta7 esterol C-5 desaturasa DWF5, esterol C-7 reductasa DWF5 , esterol C-24 (28) isomerasa-reductasa CYP710A, esterol C-22 desaturasa DHCR24, dihidrocolesterol reductasa ERG4, esterol delta 24 (28) reductasa. Abreviaturas de metabolitos: MEP, metileritritol fosfato IPP, isopentenil pirofosfato MVA, ácido mevalónico. Abreviaturas de inhibidores: CLO, clomazone TBF, terbinafina 25-AZA, 25-azalanosterol TDM, tridemorph TEB, tebuconazol.

El inhibidor clomazona (CLO) actúa sobre 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato sintasa (DXS), una enzima reguladora clave para la biosíntesis de cloroplasto IPP en plantas superiores [36]. DXS juega un papel equivalente al HMGR animal, que es una enzima reguladora clave para la biosíntesis de IPP citosólica a través de la vía MVA. CLO tuvo un pequeño efecto sobre los perfiles de esteroles (Tabla 1), pero redujo al 70% de la cantidad total de esteroles del control, presumiblemente al limitar los suministros de IPP a la vía de los esteroles (Figura 2). La terbinafina (TBF) se dirige específicamente a la escualeno epoxidasa (SQE) [34], que es la segunda enzima comprometida de la vía biosintética de los esteroles (Figura 2). Es un punto crítico para la inhibición de la biosíntesis de esteroles, ya que reduce el contenido de esteroles pero no tiene un efecto directo sobre la biosíntesis de otros isoprenoides [34]. Las células tratadas con TBF acumularon una cantidad significativa de escualeno (1), lo que respalda la presencia y función de SQE (Tabla 1) y la cantidad total de esterol se redujo en aproximadamente un 20%. Células inhibidas por tridemorph (TDM), el cicloeucalenol cicloisomerasterol isomerasa (CPI) y el inhibidor de la isomerasa C-8 de esterol [38], acumularon 9,19-ciclopropil esterol (polinastanol, 5) y esteroles delta-8 [obtusifoliol, (12), colest-8-enol (3) y estigmasta-8,24 (28) -dienoles (14, 16)] (Tabla 1). Por lo tanto, se requiere CPI para la biosíntesis de esteroles, lo que implica que N. oceanica utiliza cicloartenol como precursor en la biosíntesis de otros esteroles, en consonancia con la presencia de un gen de la cicloartenol sintasa (CAS) (Figura 1). Se ha demostrado que el cicloartenol es el esterol característico de casi todos los organismos fotosintéticos [39]. El tratamiento con tebuconazol (TEB), un inhibidor del citocromo P450 CYP51 [37], resultó en la acumulación de 4,4,14-trimetil (8, 15, 17) y 4,14-dimetil esteroles (6). Las cantidades relativamente grandes de cicloartanol (17) y cicloartenol (15) (Tabla 1) indican además que el cicloartenol es el principal precursor de la N. oceanica vía biosintética de esteroles (Figura 2). Además, el predominio de esteroles sin metilación de cadena lateral implica que el paso de desmetilación de 14α ocurre antes de la metilación de C-24 y la desmetilación de C-4 (Figura 2). Esta arquitectura de la vía biosintética difiere de la de las plantas terrestres y es más similar a la vía biosintética del colesterol en los animales y la vía biosintética del ergosterol en los hongos [40]. El 25-azalanosterol (25-AZA) es un inhibidor específico de SMT, que determina las composiciones de esteroles [35]. La aplicación de 25-AZA resultó en desmosterol (4) acumulación (Tabla 1), revelando una similitud con la levadura SMT que exhibe una preferencia por los 4,4-desmetilesteroles, a diferencia de otras SMT de algas o plantas [7].

En resumen, los hallazgos colectivos nos permitieron proponer una vía biosintética de esteroles en N. oceanica que exhibe características comunes y distintas de las de los hongos, animales y plantas verdes (incluidas las algas verdes y las plantas terrestres) (Figura 2).

El papel de los esteroles en el crecimiento de N. oceanica

Para sondear los roles funcionales de los esteroles en N. oceanica, a continuación investigamos la dinámica de los perfiles de esteroles y la expresión de sus genes biosintéticos durante la proliferación o el cese de la división celular (Figura 3A). Los niveles de esteroles exhibieron aumentos modestos durante las primeras etapas de crecimiento de N. oceanica cultivos, y luego aumentó rápidamente en etapas posteriores del ciclo de cultivo entre 4 x 10 7 y 10 8 células ml -1 (Figura 3B). El aumento de colesterol representa una proporción significativa del aumento de esteroles totales (Figura 3B). Mientras tanto, los genes biosintéticos de esteroles mostraron una adaptación coordinada en el ciclo de cultivo tardío (Figura 3C). Todos los genes estudiados excepto DXS y SMT1 fueron transcripcionalmente elevados, con niveles máximos en la fase logarítmica tardía. Por tanto, la biosíntesis y acumulación de esteroles parece ser una característica del crecimiento celular tardío a medida que el cultivo se aproxima a la fase estacionaria.

Análisis químico y transcripciones de la biosíntesis de esterol durante N. oceanica crecimiento. (A) Curva de crecimiento de N. oceanica. (B) Cambios en la composición total de esteroles y esteroles en diferentes etapas de crecimiento. (C) Niveles de transcripción de genes biosintéticos de esterol en diferentes etapas de crecimiento. Los valores son la media de tres réplicas. Los asteriscos (*) indican PAG valores & lt 0.05.

Se informa que la depleción de nitrógeno inhibe la división celular en N. oceanica[41].Para investigar sus efectos sobre la biosíntesis de esteroles, transferimos células a medios repletos de N y empobrecidos en N durante seis días. El nivel de esteroles en las células N-empobrecidas fue de aproximadamente el 33% que el de las células N-repletas (archivo adicional 2: Figura S5a). Esta diferencia se explica en gran medida por las diferencias en la cantidad de colesterol, pero sorprendentemente el isofucosterol era desproporcionadamente bajo, especialmente en comparación con el fucosterol. Esto podría explicarse por las respuestas diferenciales de los SMT al agotamiento del nitrógeno. Los estudios de la expresión génica durante las primeras 24 h de agotamiento del nitrógeno mostraron que los genes de la vía MEP estaban regulados a la baja de manera apreciable (archivo adicional 2: Figura S5b), lo que puede explicar la posterior disminución de los niveles de esteroles. Si bien algunos genes de la biosíntesis de esteroles fueron inicialmente regulados al alza (por ejemplo, FK y SMT1), otros (por ejemplo, SMT2 y DWF5) fueron rápidamente regulados a la baja (Archivo adicional 2: Figura S5b). Estos resultados sugieren una respuesta compleja al agotamiento del nitrógeno, pero apuntan a un papel central de los fitoesteroles, lo que refleja la importancia de los SMT y, potencialmente, del donante de metilo S-adenosil metionina.

Efectos de la luz sobre la biosíntesis de esteroles en N. oceanica

Para probar la relación entre la biosíntesis de esteroles y la luz, examinamos a continuación las respuestas de los perfiles de esteroles y sus genes biosintéticos a los cambios en la intensidad de la luz. Culturas de N. oceanica se cultivan típicamente en o por debajo del punto de saturación de luz de aproximadamente 100 μmol de fotones m -2 s -1, mientras que 300 μmol de fotones m -2 s -1 plantea un alto estrés lumínico. Se sabe que la luz alta causa daños bioquímicos al sistema fotosintético en plantas superiores, lo que reduce la eficiencia de la utilización de la luz.

Primero, los cultivos con la misma densidad celular se transfirieron a intensidades de luz constantes de fotones de 100 y 300 μmol m -2 s -1 durante 96 h. Se aislaron ARN y esteroles al final de los tratamientos de luz. El contenido de esteroles fue menor en las células con fotones de 300 μmol m -2 s -1 en comparación con aquellas con fotones de 100 μmol m -2 s -1 (Figura 4A). Este es el resultado de un nivel de colesterol significativamente reducido, mientras que los fitoesteroles (fucosterol e isofucosterol) aumentaron significativamente por debajo de 300 μmol de fotones m -2 s -1 (Figura 4A). Esto indica una relación entre el estrés leve y el metabolismo de los esteroles. Todos los genes biosintéticos de esteroles examinados se expresaron a un nivel significativamente más bajo en fotones de 300 μmol m -2 s -1 (Figura 4B). Por lo tanto, en respuesta a un alto estrés lumínico, la biosíntesis de esteroles en su conjunto se reprime, mientras que algunos fitoesteroles específicos aumentan en concentración. Esta observación es consistente con las observaciones de que la biosíntesis de esteroles se modifica en la alta respuesta a la luz del alga verde. Dunaliella bardawil[42] y plantas superiores [43].

Niveles de transcripción de genes metabólicos de esterol de N. oceanica en respuesta a cambios en la intensidad de la luz. (A) Contenido de esteroles bajo diferentes intensidades de luz. (B) Expresión de genes metabólicos de esteroles de N. oceanica bajo diferentes intensidades de luz. Los niveles de transcripción por debajo de 300 μmol de fotones m -2 s -1 se normalizan a 1,0. Las células en la fase de registro medio se transfirieron a intensidades de luz constantes de 100 y 300 μmol de fotones m -2 s -1. Las células se tomaron para análisis de transcripción y esterol después de 96 h. (C) Máxima eficiencia fotosintética del fotosistema II (PSII) de N. oceanica en respuesta a la transferencia de la oscuridad a la luz. Las células en la fase de registro medio se transfirieron a la oscuridad durante 12 h y luego se transfirieron a fotones de 300 o 100 μmol m -2 s -1 de luz. (D) Abundancia relativa de ARNm de genes metabólicos de esterol en N. oceanica en respuesta a la transferencia de la oscuridad a la luz. (MI) Abundancia relativa de ARNm de genes metabólicos de esterol en N. oceanica en respuesta a un cambio de intensidad de luz de 300 a 100 μmol de fotones m -2 s -1. Las células en la fase de registro medio se transfirieron a fotones de 300 μmol m -2 s -1 durante 12 h, luego a fotones de 100 μmol m -2 s -1. Las muestras se recolectaron después de 12 y 24 h. (F) Abundancia relativa de ARNm de genes metabólicos de esterol en N. oceanica en respuesta a un cambio de intensidad de luz de 100 a 50 μmol de fotones m -2 s -1. Las células en la fase de registro medio se transfirieron a fotones de 100 μmol m -2 s -1 durante 12 h, luego a fotones de 50 μmol m -2 s -1. Las muestras se recolectaron después de 12 y 24 h. Los valores son la media de tres réplicas. Los asteriscos (*) indican PAG valores & lt 0.05.

Para estudiar los efectos a corto plazo de la luz alta, las células se cultivaron primero con 50 μmol de fotones m -2 s -1 hasta la fase logarítmica media, luego se adaptaron a la oscuridad durante 12 h para simular la noche y finalmente se transfirieron a 100 o 300 fotones μmol m -2 s -1 durante 12 h. Pasado este tiempo, se midió la eficiencia fotosintética. Se recolectaron muestras para el análisis de la expresión génica al comienzo y al final del tratamiento con luz de 12 h. La eficiencia fotosintética fue significativamente mayor a fotones de 100 μmol m -2 s -1 que a fotones de 300 μmol m -2 s -1 (Figura 4C). Los niveles de transcripción de todos los genes estudiados también fueron más altos a 100 μmol de fotones m -2 s -1 que a 300 μmol de fotones m -2 s -1 (Figura 4D). Esto indica además que el tratamiento con luz intensa reprime rápidamente los genes de biosíntesis de esteroles y altera la fotosíntesis.

Para determinar si tal represión de la expresión génica es reversible, las células se trataron durante 12 ha 300 μmol de fotones m -2 s -1 y luego se transfirieron a 100 μmol de fotones m -2 s -1 durante 24 h. El ARN se aisló al final del tratamiento de luz intensa y después de 12 y 24 h de adaptación a fotones de 100 μmol m -2 s -1, para el análisis de la expresión génica. Los resultados mostraron que la expresión de genes de biosíntesis de esteroles aumentó significativamente después de 24 ha 100 μmol de fotones m -2 s -1 (Figura 4E). Por lo tanto, la expresión del gen de biosíntesis de esteroles responde en gran medida a dichos tratamientos con luz, lo que implica un papel clave para los esteroles en la adaptación a la luz intensa. A modo de comparación, la transferencia de células de fotones de 100 a 50 μmol m -2 s -1 dio como resultado solo cambios menores en la expresión de genes de biosíntesis de esterol después de 12 y 24 h (Figura 4F), lo que implica que la biosíntesis de esterol no juega un papel importante en adaptación a niveles de luz por debajo del punto de saturación.

Inhibición de la biosíntesis de esteroles en N. oceanicaconduce a una eficiencia fotosintética deprimida

Las observaciones anteriores proporcionan evidencia de un papel regulador de la luz en la biosíntesis de esteroles de microalgas y la participación de la biosíntesis de esteroles en el fotodaño tanto a nivel metabólico como de expresión génica. Sin embargo, aún se desconoce si los cambios en la biosíntesis de esteroles modulan la fotosíntesis. Por lo tanto, investigamos aún más los cambios celulares que se produjeron en respuesta a la perturbación farmacológica de la biosíntesis de esteroles. Las células se cultivaron durante 96 h bajo 50 μmol de fotones m -2 s -1 en presencia de 20 mg l -1 de CLO, que inhibe la actividad de DXS. Esto condujo a una disminución de la eficiencia fotosintética (Figura 5A). RBCL es la subunidad grande de RuBisCO, que incorpora CO inorgánico2 en formas orgánicas durante la fotosíntesis [44]. RBCL se deprimió transcripcionalmente después de la administración de CLO (Figura 5B). La inhibición de DXS condujo a una acumulación reducida de esteroles en particular, y de carotenoides y clorofilas en mucho menor grado (Figura 5C). Las células tratadas con CLO revelaron un citoplasma menos denso y orgánulos menos distintos. Los plástidos mostraron un número reducido de estructuras de membrana de tilacoides y una deficiencia de apilamiento de tilacoides normal en comparación con las células de tipo salvaje (Figura 5D, E). Esto probablemente explica la disminución de la eficiencia fotosintética de estas células. Aunque mostramos que los esteroles se redujeron significativamente con el tratamiento con CLO, la determinación de la contribución de los esteroles a la función fotosintética requirió el uso de un inhibidor más específico. La inhibición de la vía biosintética del esterol post-escualeno por TBF condujo a una caída del 24% en la eficiencia fotosintética en relación con el control en 96 h (Figura 5A). Mientras tanto, RBCL se redujo transcripcionalmente (Figura 5B). Las células tratadas con TBF también contenían menos esteroles y más carotenoides y tenían un contenido de clorofila ligeramente reducido (Figura 5C). Las células mostraban una estructura de membrana aberrante con cloroplastos gravemente afectados (Figura 5F). Además, las células tratadas con TBF se deformaron en comparación con las células no tratadas (Figura 5G, H), lo que implica un defecto en la estructura y función de la membrana. Por lo tanto, los esteroles aparentemente son necesarios para la estructura de la membrana, incluidos los del cloroplasto, y esto se manifiesta en una función fotosintética reducida cuando se inhibe la biosíntesis de esteroles.

La consecuencia de la inhibición de la biosíntesis de esteroles sobre la actividad fotosintética y el aparato de N. oceanica. (A) Efecto de CLO (20 mg l -1) y TBF (2,5 mg l -1) sobre la máxima eficiencia fotosintética de PSII. (B) Niveles de transcripción de RBCL gen de N. oceanica inducida por CLO (20 mg l -1) o TBF (2,5 mg l -1). (C) Niveles de esteroles, clorofilas y carotenoides en presencia de CLO y TBF. Los valores se normalizaron (100% para control simulado). (D-F) Análisis de microscopía electrónica de transmisión de células de algas cultivadas con control DMSO (D), CLO (MI), y TBF (F). (G-H) Análisis de microscopía electrónica de barrido de células de algas tratadas con control DMSO (GRAMO) o TBF (H). Las células de algas se cultivaron en medio que contenía CLO, TBF o una cantidad equivalente de DMSO (control) durante 96 h bajo 50 μmol de fotones m -2 s -1 de luz. Las barras de escala representan 0,5 μm. Los asteriscos (*) indican PAG valores & lt 0.05.

El análisis genético químico revela la regulación por retroalimentación de la biosíntesis de esterol en N. oceanica

En el N. oceanica Se identificó el genoma de IMET1, genes para una vía MEP completa para la producción de IPP como bloque de construcción de isoprenoides (Figura 1). Para la vía MVA, se identificó un gen que codifica la hidroxi-metil-glutaril-CoA sintasa (HMGS, g249), la primera enzima comprometida en la vía MVA, sin embargo, los genes que codifican las enzimas de los pasos restantes (incluida la enzima reguladora clave hidroxi metil-glutaril-CoA reductasa HMGR) estaban aparentemente ausentes (Figura 1). Dado que la vía MEP es la única fuente de isoprenoides, incluidos los esteroles, en N. oceanica, el control de la biosíntesis de esteroles en el contexto de la biosíntesis de IPP es de importancia fisiológica. En los animales, la biosíntesis del colesterol está muy regulada. La sobreacumulación de colesterol conduce a una disminución de la biosíntesis de colesterol y FA, ​​mientras que el colesterol bajo estimula su síntesis. HMGR, la enzima comprometida en la biosíntesis de isoprenoides y esterol, sirve como el sitio principal de regulación de retroalimentación para asegurar el mantenimiento de la homeostasis lipídica [45]. Aunque la HMGR animal y fúngica es el objetivo clave de dicha regulación, y todos estos organismos emplean una proteína de unión a HMGR llamada "Insig", las señales y los mecanismos moleculares varían entre estas especies [46]. Las plantas superiores utilizan las vías MEP y MVA para la biosíntesis de isoprenoides. Dentro de las células vegetales, el IPP se puede intercambiar entre el citosol y los plástidos. El agotamiento de los esteroles endógenos por TBF desencadena un aumento significativo en la actividad de la enzima HMGR [34], lo que implica un mecanismo de retroalimentación en las plantas similar al de los mamíferos u hongos. Sin embargo, la posible regulación de DXS en una retroalimentación tan positiva, la regulación todavía es poco conocida. En plantas superiores, la contribución de IPP de la vía MVA podría atenuar cualquier regulación de retroalimentación causada por el agotamiento de esteroles debido a la diafonía entre las vías MEP y MVA. Como resultado, N. oceanica, que solo posee la vía MEP, puede ser un modelo de investigación ideal para el papel regulador de los esteroles con respecto a DXS. Por lo tanto, investigamos los cambios transcripcionales de DXS en N. oceanica células en respuesta al agotamiento de esteroles causado por los tratamientos con CLO y TBF, así como la respuesta celular a la adición de colesterol al medio de crecimiento.

DXS la abundancia del transcrito aumentó notablemente dentro de las 48 h siguientes a la administración de CLO y luego disminuyó, que es una respuesta típica de inhibición-adaptación (Figura 6A). El nivel de esterol total se redujo a aproximadamente un 76% en relación con el control después de 96 h de tratamiento con CLO, lo que puede explicarse por el suministro reducido de IPP debido a la inhibición de la actividad de DXS (Figura 5C). Además, los niveles de carotenoides y clorofilas también disminuyeron (Figura 5C), lo que confirma aún más la baja actividad de la biosíntesis de isoprenoides y el papel comprometido de DXS en la biosíntesis de isoprenoides.

Regulación por retroalimentación de la biosíntesis de esteroles en el punto de DXS gene. (A) Niveles de transcripción de DXS y PSY genes de N. oceanica inducida por CLO (20 mg l -1). (B) Niveles de transcripción de DXS y PSY genes en N. oceanica inducida por TBF (2,5 mg l -1). (C) Niveles de transcripción de DXS y PSY genes relativos al gen de la actina (g3056) en respuesta al tratamiento del colesterol (1,1 mg l -1). Las muestras cultivadas con DMSO se establecen como controles simulados. Los valores están normalizados a 1. Los asteriscos (*) indican PAG valores & lt 0.05.

Después de la aplicación de TBF, el contenido total de esteroles disminuyó aproximadamente un 20% (Figura 5C), mientras que DXS fue inducida transcripcionalmente después de 48 h de tratamiento (Figura 6B). La inducción no puede explicarse por el agotamiento de IPP, ya que se acumuló un alto nivel de escualeno en las células tratadas con TBF (Tabla 1), lo que sugiere un suministro suficiente de IPP para la síntesis de triterpenos. Es más, SQS El ARNm se redujo al 30% después de 12 h de tratamiento (Figura 7A), un resultado que podría ser causado potencialmente por la inhibición del producto por acumulación de escualeno. Por otro lado, los niveles de carotenoides se elevaron en un 40% (Figura 5B) y el gen de la fitoeno sintasa (PSY) que codifica el paso enzimático clave comprometido para la biosíntesis de carotenoides también fue regulado positivamente transcripcionalmente (Figura 6B). Estas observaciones apuntan a la biosíntesis de isoprenoides estimulada que puede ser causada por el agotamiento de los esteroles. Además, la vía MEP completa y los genes colestógenos comprometidos fueron inducidos transcripcionalmente por TBF (Figura 7A). Juntos, los resultados sugieren que la inanición de esteroles inducida por TBF estimula la transcripción de DXS y genes biosintéticos de esteroles.

Cambios en las transcripciones y lípidos de N. oceanica en respuesta a la inanición de esteroles inducida por TBF. (A) Perfiles de transcripción de genes colestógenos y genes biosintéticos de ácidos grasos (FA) en respuesta a TBF (2,5 mg l -1). El rojo y el verde indican genes regulados hacia arriba y hacia abajo, respectivamente. (B) Niveles de transcripción de FAS-gen g927 en N. oceanica inducida por TBF (2,5 mg l -1) y agotamiento de nitrógeno (N -). (C) Cambios en el contenido total de FA inducidos por TBF. (D) Cambios del contenido total de TAG inducidos por TBF. (MI) Cambios de clases de lípidos de glicerol (distintos de TAG) inducidos por TBF. Para todos los experimentos, los cultivos en fase exponencial se trataron con TBF (2,5 mg l -1) o una cantidad equivalente de DMSO (control). El contenido de AG se analizó a los dos, cuatro y seis días, y el contenido de glicerolípidos se analizó a los seis días. Los asteriscos (*) indican PAG valores & lt 0.05.

En el caso de la acumulación de esteroles lograda por colesterol agregado exógenamente, el DXS el nivel de transcripción se redujo notablemente (Figura 6C). Aunque el contenido de carotenoides no cambió, PSY se redujo transcripcionalmente, apoyando la propuesta de que el esterol puede actuar como un regulador de retroalimentación de la ruta de biosíntesis de isoprenoides en general. En resumen, la transcripción de DXS puede ser controlado por los niveles de esteroles, y la biosíntesis de esteroles potencialmente ejerce una regulación por retroalimentación sobre la biosíntesis de isoprenoides, incluida la colesterogénesis.

Homeostasis entre esteroles y lípidos en N. oceanica

La biosíntesis de esterol y FA son dos rutas sintéticas de lípidos importantes en eucariotas, pero no está claro si están co-reguladas en microalgas. En los animales, la sintasa de ácidos grasos tipo I (FAS) y otros genes biosintéticos están regulados por los niveles de esteroles celulares, al igual que los genes que codifican proteínas importantes del metabolismo del colesterol [13]. Para probar el vínculo entre el esterol y la biosíntesis de FA en N. oceanica, se investigaron las abundancias de transcripciones de genes del metabolismo de lípidos después de la depleción de esterol inducida por TBF. TBF provocó un aumento en el tipo I FAS (g927) transcripción después de 12 y 24 h de tratamiento (Figura 7A). Este gen también se elevó transcripcionalmente en células tratadas con agotamiento de nitrógeno, que es un desencadenante crítico para la acumulación de lípidos (Figura 7B). De acuerdo con esto, el nivel de FA aumentó durante un período de varios días después de la administración de TBF (Figura 7C). A continuación, analizamos el contenido de TAG después de seis días de tratamiento con TBF y observamos que la concentración de TAG se redujo en gran medida en comparación con la de los controles no tratados (Figura 7D). Por lo tanto, la inhibición de la biosíntesis de esteroles por TBF da como resultado un aumento de AG, pero estos no se acumulan en TAG. Este resultado está respaldado por cromatografía en capa fina de FA (Figura 7D, recuadro). Simultáneamente, los glicerolípidos de la membrana, en particular los lípidos de la membrana fotosintética, como el monogalactosildiacilglicerol (MGDG), el digalactosildiacilglicerol (DGDG) y el fosfatidilglicerol (PG), disminuyeron significativamente después del tratamiento con TBF (Figura 7E), lo que puede explicar la disminución de la eficiencia fotosintética y cloroplasmática deformada. de células de algas tratadas con TBF. Además, se observó una reducción notable de fosfatidilinositol (PI) y diacilgliceroltrimetilhomoserina (DGTS) (Figura 7E). En conjunto, la evidencia sugirió que el nivel elevado de FA total en las células inhibidas por TBF se derivó del aumento en de novo Biosíntesis de FA distinta de la de los lípidos de almacenamiento o de los lípidos de membrana. Además, los ácidos grasos libres deberían representar una gran proporción del aumento de la cantidad de ácidos grasos totales.

Por lo tanto, proponemos un sistema de retroalimentación en Nanocloropsis para la regulación tanto de la homeostasis del esterol como de la FA, que se caracteriza por (I) la inducción de la biosíntesis de esterol y FA por depleción de esteroles o la inhibición por acumulación de esteroles y (ii) regulación de retroalimentación transcripcional de DXS asegurando el mantenimiento de la homeostasis lipídica.Curiosamente, en animales, HMGR de la vía MVA es la enzima comprometida en la biosíntesis de isoprenoides y esterol, y sirve como el sitio principal de la regulación por retroalimentación [45], lo que sugiere similitud entre el sistema de algas y el modelo animal [17].


Los autores agradecen al Sr. Anand, miembro del proyecto DST, División de Biotecnología, CSIR-NIIST, Trivandrum, por su ayuda en la preparación de este manuscrito. También agradecemos al Sr. T. Balaji Prasad, Scientific Publishing Services Pvt. Ltd., Chennai, por su oportuna ayuda para mejorar el idioma del manuscrito.

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Palabras clave: microalgas, energía de biomasa, métodos de extracción de lípidos, biocombustibles de algas, biodiesel, eficiencia energética.

Cita: Ranjith Kumar R, Hanumantha Rao P y Arumugam M (2015) Métodos de extracción de lípidos de microalgas: una revisión completa. Parte delantera. Energy Res. 2: 61. doi: 10.3389 / fenrg.2014.00061

Recibido: 12 de noviembre de 2014 Aceptado: 10 de diciembre de 2014
Publicado online: 08 de enero de 2015.

Junye Wang, Universidad de Athabasca, Canadá

Reeta Rani Singhania, Universidad Blaise Pascal, Francia
Lijuan Long, Academia de Ciencias de China, China

Copyright: & # x000A9 2015 Ranjith Kumar, Hanumantha Rao y Arumugam. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de atribución Creative Commons (CC BY). Se permite el uso, distribución o reproducción en otros foros, siempre que se acredite al autor (es) original (es) o al licenciante y se cite la publicación original en esta revista, de acuerdo con la práctica académica aceptada. No se permite ningún uso, distribución o reproducción que no cumpla con estos términos.


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