Información

¿Cómo identificar el gen GPD cuando la secuencia varía entre organismos?

¿Cómo identificar el gen GPD cuando la secuencia varía entre organismos?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Estoy leyendo un artículo sobre la transformación genética de un hongo y el plásmido utilizado en el artículo utiliza dos formas del mismo promotor de GPD (gliceraldehído3-fosfato deshidrogenasa) para impulsar un gen de GFP, uno de Agaricus bisporus y otro de Lentinula edodes (GenBank : GQ457137.1).

Sin embargo, noté que las secuencias de los promotores de GPD antes mencionados no coinciden con la secuencia de referencia en GenBank (NC_007251.2) que a su vez se deriva de otro organismo.

¿Por qué existen diferentes secuencias para el mismo promotor? Además, ¿cómo podría identificar el gen GPD en otro organismo si no puedo compararlo con una secuencia conocida?

El organismo que deseo transformar tiene su genoma completo secuenciado y mi transformación sería mucho más efectiva si pudiera usar un promotor nativo como GPD.


Puede que no te entienda bien, pero deduzco de tus enlaces de arriba que quieres hacer coincidir las regiones promotoras de GPD de dos hongos (parientes lejanos). Agaricus bisporus y Lentinula edodes, al promotor de GPD de Leishmania mayor, que pertenece a un Reino completamente diferente!

Las regiones promotoras tienden a conservarse relativamente deficientemente entre especies en comparación con las regiones codificantes de proteínas, incluso para especies estrechamente relacionadas. Dada la distancia evolutiva entre las especies que está mencionando, la probabilidad de que encuentre alguna homología entre sus regiones promotoras es probablemente cero.

Además, ¿cómo podría identificar el gen GPD en otro organismo si no puedo compararlo con una secuencia conocida?

Lo que haría es tomar la secuencia de la proteína GPD traducida, que para Lentinula edodes sería GenBank BAA83550.1. Luego lo usaría para buscar coincidencias de proteínas usando blastp, específicamente subconjunto para Leishmania mayor; y utilice el resultado para localizar el gen codificante en el genoma. También puede hacer esto en un solo paso con tblastn, que busca coincidencias en una base de datos de nucleótidos traducida (consulte esta consulta de ejemplo de tblastn).

A continuación, puede simplemente tomar los 1000 pb más o menos aguas arriba de la región de codificación para representar su promotor GPD.


9: Conservación de proteínas

  • Contribuido por Clare M. O & rsquoConnor
  • Profesor asociado emérito (biología) en Boston College

Al final de este laboratorio, los estudiantes deberían poder:

  • identificar los aminoácidos por su código de 1 letra.
  • explicar las diferencias entre puntuaciones altas y bajas en la matriz BLOSUM 62.
  • utilice el algoritmo BLASTP para comparar secuencias de proteínas.
  • identificar regiones conservadas en una alineación de secuencia múltiple.

A medida que las especies evolucionan, sus proteínas cambian. La velocidad a la que cambia la secuencia de una proteína individual varía ampliamente, lo que refleja las presiones evolutivas que experimentan los organismos y el papel fisiológico de la proteína. Nuestro objetivo este semestre es determinar si las proteínas involucradas en la biosíntesis de Met y Cys se han conservado funcionalmente entre S. pombe yS. cerevisiae, especies que están separadas por cerca de mil millones de años de evolución. En este laboratorio, buscará en las bases de datos homólogos de S. cerevisiae secuencias en varias especies, incluyendo S. pombe. Homólogos son secuencias de ADN similares que descienden de un gen común. Cuando se encuentran homólogos en diferentes especies, se les conoce como ortólogos.

Los homólogos dentro del mismo genoma se denominan parálogos. Paralogs surgen por duplicación de genes, pero se diversifican con el tiempo y asumen funciones distintas. Aunque se produjo una duplicación completa del genoma durante la evolución de S. cerevisiae (Kellis et al., 2004), solo unos pocos genes en la supervía de la metionina tienen parálogos. Curiosamente, MET17 es parálogo a tres genes implicados en la transferencia de azufre: STR1 (CYS3), STR2 y STR4, lo que refleja múltiples duplicaciones de genes. La presencia de estas cuatro enzimas distintas confiere una flexibilidad inusual a S. cerevisiae en su uso de fuentes de azufre. los SAM1 y SAM2 Los genes también son parálogos, pero sus secuencias se han mantenido casi idénticas, proporcionando redundancia funcional si un gen está inactivo (Capítulo 6).

Nuestros experimentos de este semestre probarán si los genes involucrados en la síntesis de Met y Cys se han conservado funcionalmente durante la divergencia evolutiva de S. cerevisiae y S. pombe . Una variedad de algoritmos ofrecen a los investigadores herramientas para estudiar la evolución de las secuencias de proteínas. En esta representación gráfica de secuencias Sam2p alineadas de nueve organismos modelo divergentes, la altura de la letra refleja la frecuencia de un aminoácido particular en esa posición.

La función de las proteínas está íntimamente relacionada con su estructura. Recordará que la forma plegada final de una proteína está determinada por su secuencia primaria, la secuencia de aminoácidos. La funcionalidad de la proteína cambia menos rápidamente durante la evolución cuando las sustituciones de aminoácidos son conservadoras. Las sustituciones conservadoras ocurren cuando el tamaño y la química de una nueva cadena lateral de aminoácidos es similar a la que está reemplazando. En este laboratorio, comenzaremos con una discusión de las cadenas laterales de aminoácidos. A continuación, utilizará el algoritmo BLASTP para identificar ortólogos en varios organismos modelo. Realizará una alineación de secuencia múltiple que distinguirá las regiones que están más conservadas que otras.

A medida que avanza en los ejercicios, notará que las secuencias de proteínas en las bases de datos están escritas en el código de 1 letra. La familiaridad con el código de 1 letra es una habilidad esencial para los biólogos moleculares de hoy en día.


Fondo

Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) son estructuras repetitivas en Bacteria y Archaea compuestas por secuencias repetidas exactas de 24 a 48 bases de longitud (denominadas aquí repeticiones) separadas por espaciadores únicos de longitud similar (denominados aquí espaciadores) [1, 2]. Las secuencias CRISPR parecen estar entre los elementos que evolucionan más rápidamente en el genoma, hasta el punto de que especies y cepas estrechamente relacionadas, a veces más del 99% idénticas a nivel de ADN, difieren en su composición CRISPR [3, 4].

Hasta 45 familias de genes, llamadas secuencias asociadas a CRISPR (CAS), aparecen junto con estas repeticiones y se supone que son responsables de la propagación y el funcionamiento de CRISPR [2, 5, 6]. Se ha propuesto que los CAS se pueden dividir en siete u ocho subtipos, de acuerdo con la organización de sus operones y la filogenia genética [5, 6]. El análisis filogenético también indica que los CAS han sufrido una extensa transferencia horizontal de genes, ya que se encuentran genes CAS muy similares en organismos relacionados lejanamente [6, 7]. Se han encontrado CRISPR y CAS en elementos genéticos móviles, como plásmidos, piel elementos móviles, e incluso profagos, lo que sugiere un posible mecanismo de distribución del sistema [7-9].

Se ha sugerido que los CRISPR desempeñan funciones en la partición de replicones [1], la reparación del ADN [10], la regulación [5] y el reordenamiento cromosómico [11]. Recientemente se informó que los espaciadores son a menudo muy similares a los fragmentos de ADN extracromosómico, como el ADN de fagos o plásmidos [3, 12]. Se sugirió que el sistema CRISPR / CAS participa en una respuesta antiviral, probablemente mediante un mecanismo similar a una interferencia de ARN. El mecanismo propuesto para esta función CRISPR implica el muestreo y el mantenimiento de un registro de los elementos invasivos del ADN y la inhibición de las funciones génicas necesarias para la invasión [12]. De hecho, recientemente se demostró que los CRISPR proporcionan resistencia adquirida contra virus en procariotas [13].

A pesar de los análisis en profundidad de CAS, la naturaleza de las secuencias repetidas no se ha examinado de cerca. Esto se debe presumiblemente a que las repeticiones, como secuencias cortas de ADN, tienen menos potencial comparativo que los genes que codifican proteínas. Estudios anteriores sólo han señalado que las repeticiones son muy variables y no parecen ser similares entre organismos [2, 7]. Sin embargo, mostramos que las repeticiones de diversos organismos se pueden agrupar en grupos en función de la similitud de secuencia, y que algunos grupos tienen estructuras secundarias pronunciadas con cambios de base compensatorios. Además, mostramos que existe una clara correspondencia entre los subtipos CAS y los clústeres repetidos. Nuestros hallazgos tienen implicaciones importantes para la función y la diversidad de CRISPR.


Consideraciones Especiales

Anotación de múltiples ensamblajes

Cuando se dispone de múltiples ensamblajes de buena calidad para un organismo dado, la anotación de todos se realiza de manera coordinada. Para garantizar que las regiones coincidentes de los ensamblajes se anoten de la misma manera, los ensamblajes se alinean entre sí antes de la anotación.

  • Los resultados de la alineación de ensamblaje-ensamblaje se utilizan para clasificar la transcripción y las alineaciones genómicas curadas: para una secuencia de consulta determinada, las alineaciones a las regiones correspondientes de dos ensamblajes reciben el mismo rango.
  • A los loci correspondientes de múltiples ensamblajes se les asigna el mismo GeneID y tipo de locus.

Las alineaciones de ensamblaje-ensamblaje están disponibles a través del Servicio de reasignación del genoma de NCBI.

Re-anotación

Los organismos se vuelven a anotar periódicamente cuando hay nueva evidencia disponible (por ejemplo, RNA-Seq) o cuando se publica un nuevo ensamblaje. Se presta especial atención al seguimiento de modelos y genes desde una publicación de la anotación a la siguiente. Los modelos anteriores y actuales anotados en ubicaciones genómicas superpuestas se identifican y el tipo de locus y el GeneID de los modelos anteriores se tienen en cuenta al asignar los GeneID a los nuevos modelos. Si el ensamblaje se actualizó entre las dos rondas de anotación, los ensamblajes se alinean entre sí y las alineaciones se utilizan para hacer coincidir los modelos anteriores y actuales en las regiones mapeadas.


Resultados

Flujo de trabajo bioinformático para la caracterización molecular de eventos de arroz transgénico

Muchos investigadores tienen dificultades para manejar grandes cantidades de datos bioinformáticos. Desarrollamos un método fácil de usar para detectar uniones de ADN-T insertadas utilizando datos NGS en lugar de los métodos de detección convencionales. En la Fig. 1 se muestra un diagrama del flujo de trabajo bioinformático. En el primer paso, las lecturas de extremos emparejados sin procesar calificadas se alinearon contra un vector plasmídico de transformación utilizando el software Burrows-Wheeler Aligner con coincidencias exactas máximas (BWA-MEM) [22] . Como la estructura del vector del plásmido de transformación es circular, hicimos una secuencia de referencia del vector linealizada (pPZP200) en la que las secuencias del borde izquierdo y derecho contenían 150 pb del extremo opuesto de la secuencia del plásmido. Para seleccionar aquellas lecturas que abarcan uniones, las lecturas mapeadas se restaron de acuerdo con sus posiciones mapeadas, según la ubicación del T-DNA (de 6392 a 10,291 pb). Estas lecturas recopiladas se utilizaron como consultas para el análisis BLASTN para clasificar las lecturas falsas positivas frente a un genoma de arroz de referencia (O. sativa versión 7.0) [23]. Como el T-DNA insertado está diseñado para contener elementos endógenos, se lee que contenía la secuencia promotora endógena RbcS3 se eliminaron cuidadosamente basándose en la puntuación de similitud de secuencia (con la secuencia de arroz nativa) para reducir la alineación ambigua. Las lecturas restantes se alinearon contra el vector transgénico y se visualizaron usando IGV con lecturas de extremos emparejados. A partir de los resultados, seleccionamos lecturas de unión que coincidían parcialmente con ambos extremos del ADN-T (es decir, lecturas que abarcaban tanto el ADN-T como el genoma del arroz) y extrajimos secuencias FASTA para identificar el ADN-T insertado en la región de unión de la genoma (Fig.1).

Ubicación del T-DNA y número de copia

Aproximadamente 28 GB de datos de secuencia sin procesar, correspondientes a 72 × profundidad de secuenciación, se obtuvieron del cultivo parental de control “Illmi”. Además, se obtuvieron 30 GB, 21 GB y 26 GB de datos sin procesar de SNU-Bt9–5, SNU-Bt9–30 y SNU-Bt9–109, respectivamente, lo que representa aproximadamente 78 ×, 54 × y 68 × cobertura del genoma, respectivamente (Tabla 1).

De los pasos consecutivos aplicados en nuestro análisis de detección de uniones (como se describe en la sección "Análisis del sitio de inserción de ADN-T" de los Métodos), se obtuvieron 11 539 lecturas del arroz transgénico SNU-Bt9-5, incluidas 2790 lecturas mapeadas emparejadas. Además, se mapearon 8371 y 9767 lecturas del arroz transgénico SNU-Bt9–30 y SNU-Bt9–109, respectivamente, incluyendo 1792 y 2336 pares de lecturas adecuadas, respectivamente (Tabla 2). Inesperadamente, se mapearon 8125 lecturas derivadas de "Illmi" de tipo salvaje en las secuencias del vector transgénico, incluyendo sólo 648 pares de lecturas adecuadas. Se asumió que las restantes lecturas de extremos emparejados no apareados se debían a una característica de las secuencias de Illumina que puede deberse a una longitud de secuencia corta. También es de destacar que nuestra construcción de T-DNA utilizada en este estudio fue diseñada para contener el gen promotor endógeno del arroz. rbcS3 (Os12g0291100), que ocupa 1824 pb de T-DNA y se expresa en el cromosoma 12 del arroz [24]. Para eliminar las lecturas falsas positivas engañosas que se originan en el genoma nativo (es decir, no en el ADN-T), cada secuencia mapeada se comparó con la secuencia de referencia de arroz usando BLASTN. Un total de 915, 1019, 729 y 899 lecturas correspondientes a arroz Illmi, SNU-Bt9–5, SNU-Bt9–30 y SNU-Bt9–109, respectivamente, se alinearon con el cromosoma 12 y se clasificaron como falsos positivos.

Se recogieron lecturas que se alinearon parcialmente con ambos extremos de la región fronteriza del transgén (Fig. 2a yb) basándose en su posición de mapeo. Luego, las lecturas seleccionadas se alinearon con la secuencia completa de T-DNA para identificar el sitio flanqueante. Los resultados representaron uniones de inserto en cromosomas de arroz (Fig. 2c). Lee que abarcan regiones de unión entre el genoma del hospedador y el transgén obtenido del arroz SNU-Bt9–5 mapeado perfectamente en el cromosoma 10 del arroz de 22,498,218 a 22,498,279 bp con deleciones de 79 bp. El evento de arroz SNU-Bt9-30 se mapeó correctamente en el cromosoma 11 del arroz de 22 473 585 a 22 473 636 pb con deleciones de 51 pb (Tabla 3 y Fig. 3). Ambos eventos transgénicos detectaron con éxito una sola copia y un solo locus dentro del genoma del arroz, y ambos resultados fueron idénticos a los obtenidos por el método de detección basado en Southern blot [21].

Caracterización molecular de arroz transgénico usando alineaciones de lectura NGS. a Ilustración del plásmido de transformación pPZP200 que contiene T-DNA utilizado para Agrobacterium-transformación mediada para crear SNU-Bt9–5, SNU-Bt9–30 y SNU-Bt9–109. MCS, sitio de clonación múltiple. B Ejemplo detallado de resultados de IGV. Las líneas horizontales en la pista de la secuencia (parte superior del panel) indican la secuencia de referencia (es decir, la secuencia del vector del plásmido de transformación insertada en T-ADN). Las pistas destacadas muestran una orientación pareada (panel superior = lectura 1, panel inferior = lectura 2). Los recuadros de colores indican la región de unión que contiene lecturas que abarcan tanto el borde del ADN-T como la secuencia flanqueante genómica. C Alineaciones de secuencia de lecturas que abarcan uniones (superior = secuencias flanqueantes del borde izquierdo, inferior = secuencias flanqueantes del borde derecho). Los nucleótidos rojos y negros indican el cromosoma del arroz y el ADN-T, respectivamente.

Representación de loci deducidos de una inserción de ADN T en un cromosoma de arroz

Aunque los sitios de integración del arroz SNU-Bt9-109 no se identificaron usando el método descrito aquí (Tabla 3 y Fig. 3), el sitio de integración cerca del borde derecho (RB) se encontró en el cromosoma 3 de 14.707.459 a 14.707.391 pb. No se identificaron las secuencias flanqueantes cerca de la región del borde izquierdo (LB). El análisis BLASTN (utilizando la base de datos NCBI nr) mostró que la unión entre la región LB y el genoma del huésped mostraba una gran similitud con el "vector pDsG8 de captura de genes Ds / T-DNA (valor e: 4e-28)" y el Solanum tuberosum gen inhibidor de proteinasa (valor e: 6e-28). sin embargo, el S. tuberosum gen se consideró como un artefacto debido a su breve consulta y baja especificidad.

Para validar los resultados anteriores, diseñamos cebadores basados ​​en las lecturas de secuencia de unión obtenidas (archivo adicional 1: Tabla S1). Nuestros resultados de PCR verificaron que la detección de inserción de los dos eventos de arroz transgénico se caracterizó con éxito utilizando NGS. Además, la secuencia de unión de SNU-Bt-109 también se detectó mediante PCR flanqueante utilizando secuencias de LB cercanas (archivo adicional 1: Figura S2).

Determinación del reordenamiento del ADN-T

Para determinar la secuencia de T-ADN, calculamos las distribuciones de tamaño de inserción utilizando lecturas de pares mapeados contra el ADN plasmídico transgénico (archivo adicional 1: Figura S3). Calculando el tamaño del inserto, es posible decidir si el ADN insertado se ha reordenado. Los tamaños de inserto promedio fueron 479, 469 y 535 pb para SNU-Bt9–5, SNU-Bt9–30 y SNU-Bt9–109, respectivamente, que coincidían correctamente con los tamaños preparados en la construcción de la biblioteca (archivo adicional 1: Figura S4 ). Supuso que no había reordenamientos internos o duplicaciones dentro del T-DNA. Los resultados corresponden a los de la recuperación de ADN-T completo mediante PCR de ADN genómico y análisis de secuenciación en nuestro artículo anterior [21].

Posible presencia de secuencias de esqueleto en plantas transgénicas

Pueden ocurrir cambios genómicos no deseados durante el desarrollo de nuevas plantas GM. Es posible que las secuencias de la cadena principal del plásmido se integren en el genoma de un huésped durante Agrobacterium-transformación mediada [10]. Por lo tanto, las alineaciones de secuencias se visualizaron con IGV para detectar una posible contaminación de las cadenas principales del plásmido. No se asignaron lecturas a la estructura de la columna vertebral del plásmido (archivo adicional 1: Figura S5 y S6). Este hallazgo demuestra que las secuencias derivadas de la columna vertebral no se introdujeron en estos genomas transgénicos.


Usando el genoma del canario para descifrar la evolución de la regulación de genes sensibles a las hormonas en los pájaros cantores estacionales

Fondo: Si bien el canto de todos los pájaros cantores está controlado por el mismo circuito neuronal, la dependencia hormonal del comportamiento del canto varía mucho entre las especies. Por esta razón, los pájaros cantores son organismos ideales para estudiar los mecanismos últimos y próximos del comportamiento dependiente de hormonas y la plasticidad neuronal.

Resultados: Presentamos el ensamblaje y la anotación de alta calidad de un genoma canario femenino de 1,2 Gbp. Las alineaciones del genoma completo entre el canario y 13 genomas en todos los taxones de aves muestran una sintenia muy conservada, mientras que en la resolución de base única hay diferencias considerables entre las especies. Estas diferencias impactan en motivos de secuencia pequeña como los sitios de unión del factor de transcripción, como los elementos de respuesta a los estrógenos y los elementos de respuesta a los andrógenos. Para relacionar estos elementos de respuesta específicos de la especie con la sensibilidad hormonal del comportamiento del canto del canario, identificamos transcriptomas estacionales sensibles a la testosterona de las principales regiones del cerebro relacionadas con las canciones, HVC y RA, y encontramos las redes de genes estacionales relacionadas con la diferenciación neuronal solo en el HVC. Las redes de genes reguladas al alza sensibles a la testosterona de HVC de machos cantantes se referían a la diferenciación neuronal. Entre los genes regulados por testosterona del HVC canario, el 20% carece de elementos de respuesta a los estrógenos y del 4 al 8% carecen de elementos de respuesta a los andrógenos en los promotores ortólogos del pinzón cebra.

Conclusiones: La secuencia del genoma canario y el análisis de expresión complementaria revelan cambios evolutivos intrarregionales en un circuito neuronal multirregional que controla el comportamiento de canto estacional e identifican la evolución genética relacionada con la sensibilidad hormonal de este comportamiento de canto estacional. Estos genes que son sensibles a la testosterona y al estrógeno específicamente en el canario y que están involucrados en el recableado de las neuronas podrían ser cruciales para la rediferenciación estacional de los patrones de canciones estacionales subyacentes de HVC.


Serología: descripción general

Otros fluidos corporales

El perfil de ADN se ha realizado con éxito en una amplia gama de fluidos y tejidos corporales para los que no existen pruebas comunes. Los ejemplos incluyen la piel (incluida la caspa), la transpiración, la mucosidad nasal, el pus, la leche materna y la cera de los oídos. En su mayor parte, el origen biológico en estos casos se infiere de la apariencia del material o de su ubicación en el artículo analizado, por ejemplo, la transpiración de las bandas de los sombreros, la mucosidad nasal en los tejidos, etc. Hay poca necesidad de pruebas específicas para determinar la identidad celular de estos materiales, sin embargo, cada uno tiene una bioquímica característica que podría aprovecharse para desarrollar una prueba de identificación si fuera necesario.


Resultados y discusión

Elegimos el 5 ′ -UTR de los bien estudiados S. cerevisiae CYC1 promotor [15, 16]. Fusionamos pCYC1min (comenzando en la posición -143) a una proteína fluorescente verde mejorada con levadura (yEGFP) [17] y el CYC1 terminador. Comparado con el completo CYC1 promotor, pCYC1min contiene dos de las tres cajas TATA y ninguna secuencia de activación corriente arriba. pCYC1min es un promotor moderadamente débil y, por esta razón, parece ser un candidato ideal para detectar efectos tanto positivos como negativos de mutaciones puntuales en la secuencia líder sobre la expresión de la proteína informadora cadena abajo. los CYC1 el promotor 5 '-UTR tiene 71 nucleótidos de longitud.

En el siguiente análisis, nos referimos a la parte de CYC1 5 ′ -UTR en la posición −1 a −8 como el secuencia extendida de Kozak y que en −9 a −15 como el región aguas arriba. En la secuencia extendida de Kozak, la adenina está fuertemente conservada en cinco posiciones, mientras que en la región cadena arriba no se conserva fuertemente ningún nucleótido. Sin embargo, la adenina es la más frecuente en casi todos los sitios (ver Antecedentes).

La secuencia extendida de Kozak

El original CYC1 secuencia de las posiciones -15 a -1 es CACACTAAATTAATA (de ahora en adelante referido como k 0). Según Dvir et al. [9], la presencia de una adenina en las posiciones -1, 3 y 4, junto con la ausencia de guanina en la posición 2, debería hacer que esta secuencia líder sea casi óptima para una alta expresión. Sin embargo, la timina en la posición -2 y la citosina en la posición 13 tienen una frecuencia inferior a 20 % y 10 %, respectivamente, entre altamente expresados S. cerevisiae genes [8]. Construimos nuestro primer sintético CYC1 secuencia líderk 1) colocando una adenina en cada posición de -1 a 15.

El nivel de fluorescencia asociado con k 1 era 6.5 % más alto que el medido con k 0. Sin embargo, no surgieron diferencias estadísticamente significativas a partir de los datos recopilados en estas dos secuencias líder (pag-valor = 0,13). Lo mantuvimos k 1 (la secuencia líder optimizada) como plantilla para nuestras próximas construcciones sintéticas y construimos 57 5 ′ -UTR sintéticos más mediante la mutación de nucleótidos únicos o múltiples en k 1.

El primer grupo de secuencias líder sintéticas se hizo mediante una mutación de un solo punto de la posición -1 a la posición 8 (ver Tabla 1). Por lo tanto, modificamos solo la secuencia de Kozak extendida, mientras que la región aguas arriba se mantuvo en una configuración optimizada para una alta expresión génica con adeninas en las posiciones -9 a -15.

La fluorescencia más alta se registró para k 16 (donde una guanina sustituyó a la adenina en la posición -5) y la más baja por k 9 (donde una timina reemplazó a la adenina en la posición -3). Además, el nivel de fluorescencia de k 16 fue estadísticamente significativamente diferente de la de k 0 y k 1. Un aumento en la fluorescencia debido a una guanina en la posición -5 fue un resultado sorprendente porque la guanina es el nucleótido menos frecuente en la levadura. S. cerevisiae secuencias líder. Además, nunca se detectó guanina en esta posición entre los genes altamente expresados ​​[8] ni provocó ningún aumento de la fluorescencia en el trabajo de Dvir et al. [9].

A pesar de la ausencia de una diferencia estadísticamente significativa de k 1, las únicas construcciones además de k 16 que resultó en un aumento de & gt5 % en el nivel de fluorescencia de k 1 fueron k 3, k 10, y k 24. En particular, en k 3, una timina reemplazó a una adenina en la posición -1, y en k 10 la adenina en la posición -3 se transformó en una guanina. Como se informó anteriormente, la adenina en las posiciones -1 y -3 debería garantizar una alta expresión génica. Sin embargo, en un contexto de adenina de este tipo, parece que se requieren nucleótidos menos frecuentes en las posiciones -1 o -3 para mejorar aún más la expresión génica. Por el contrario, una timina en lugar de una adenina en la posición -3 (k 9) fue la única mutación que indujo a & gt5 % reducción en k 1 nivel de fluorescencia. Este resultado es consistente con la observación en [9] de que una timina en la posición -3 es abundante en genes pobremente expresados ​​(Fig. 1 a).

Efecto de mutaciones puntuales en la secuencia extendida de Kozak sobre la expresión de fluorescencia. Los niveles de fluorescencia se representan en relación con k 1 (a) y k 0 (B). El control corresponde a una cepa de levadura sin el gen yEGFP. El nucleótido que reemplazó a una adenina en k 1 y la posición en la que tuvo lugar la mutación se dan debajo del nombre de cada secuencia líder sintética. Asteriscos pag-valor & lt0.05 vs. k 1 (a) o k 0 (B)

Con respecto a k 0, las 25 nuevas secuencias líder sintéticas contenían entre seis y ocho mutaciones. Aparte de k 9, todos los 5 ′ -UTR sintéticos mostraron un nivel de fluorescencia superior al de k 0, cinco de los cuales fueron significativamente más altos. Estos incluían las posiciones -1, 4 y 5. Como ya se señaló en la comparación con k 1, una adenina justo aguas arriba del codón START no parecía tener una ventaja particular para la expresión génica. Aquí, una citosina y una timina (k 2 y k 3, respectivamente) funcionó mucho mejor que una adenina. Sin embargo, con respecto a k 0, hubo siete mutaciones puntuales más aguas arriba. En la posición -4, una timina (k 12) resultó en el incremento de fluorescencia más alto, mientras que en la posición -5, tanto una citosina (k 14) y una guanina (k 16) fluorescencia mejorada a & gt10 % por encima de la de k 0. Ya que k 0 tiene una timina en las posiciones -2, -5 y -6, cada una de las cinco 5 ′ -UTR sintéticas que mostraron diferencias estadísticamente significativas de k 0 se vieron afectados por una mutación puntual en dos o más sitios adyacentes. Tres secuencias líder sintéticas más (k 10,k 17, y k 24) provocó un & gt10 % aumento de la fluorescencia en comparación con k 0, aunque estas diferencias no fueron significativas (pag-valor & gt0.05). k 10 y k 17 también tenía mutaciones de doble punto en sitios adyacentes (Fig. 1 b).

Múltiples mutaciones a guanina

El análisis de nuestras primeras 25 secuencias 5 ′ -UTR sintéticas dio el resultado sorprendente de que una mutación de un solo punto a guanina, que está esencialmente ausente de la secuencia Kozak extendida de alta expresión S. cerevisiae genes - puede mejorar el nivel de fluorescencia de k 1, una secuencia líder optimizada para la expresión génica. Además, cinco de nuestros 5 ′ -UTR sintéticos de forma inequívoca (& gt9 %) aumentó el nivel de fluorescencia asociado con pCYC1min.

Según nuestros datos, una sola mutación en guanina puede mejorar la expresión génica. Sin embargo, dos artículos anteriores [18, 19] informaron que múltiples guaninas colocadas delante de un codón START reducirían considerablemente la síntesis de proteínas. Por lo tanto, evaluamos cómo múltiples mutaciones puntuales en guanina afectaron la eficiencia de traducción de pCYC1min, para determinar si podrían usarse para modular la expresión génica.

Según [8], entre los altamente expresados S. cerevisiae genes, la guanina es el nucleótido menos frecuente entre las posiciones -1 y -15, con la excepción de la posición -7, en la que el nucleótido menos frecuente es la citosina. Construimos un 5 ′ -UTR sintético que refleja esta secuencia (k 26 Tabla 2). Esto apagó la expresión génica, como lo muestra el nivel de fluorescencia correspondiente que no es significativamente diferente (pag-valor = 0,21) de nuestro control negativo (un S. cerevisiae cepa que no contenía el gen yEGFP).

Probamos si múltiples mutaciones en guanina (citosina en la posición -7) afectarían la expresión génica de una manera diferente cuando cubrían la secuencia completa de Kozak extendida (k 27) o la región aguas arriba (k 28). Dado que se hicieron mutaciones con respecto a k 1, todos los sitios no mutados contenían una adenina. Sorprendentemente, encontramos que las dos configuraciones eran equivalentes para la expresión génica (pag-valor & gt0.40) y reducido k 1 nivel de fluorescencia en aproximadamente la mitad.

Empezando desde k 27, reemplazamos la guanina en las posiciones -1 (k 29), −2 (k 30) y −3 (k 31) con una adenina para determinar si una sola adenina en las tres posiciones justo aguas arriba del codón START potenciaría la expresión de fluorescencia cuando los otros sitios de la secuencia de Kozak extendida estuvieran ocupados por una guanina o una citosina. En la posición -1, una adenina no mostró mejoría en la fluorescencia de k 27. Curiosamente, en las posiciones -2 y -3, una adenina provocó una caída en la expresión génica a aproximadamente 7 % de El k 1 nivel de fluorescencia. Estos resultados demuestran que una adenina per se no puede mejorar la expresión génica incluso cuando ocupa la posición -3 o -1. De manera más general, podemos concluir que el efecto sobre la expresión génica de una mutación puntual única en la secuencia líder depende en gran medida del contexto.

Finalmente, para comprender mejor cuán importante es la región aguas arriba para la expresión génica, redujimos progresivamente el número de guaninas de siete (k 28) a uno (k 38). A partir de la posición -9, reemplazamos una guanina con una adenina en cada paso y vimos que el nivel de fluorescencia aumentaba casi linealmente con el número de adeninas (Fig. 2 y archivo adicional 1). La última secuencia en la que el nivel de fluorescencia fue estadísticamente significativamente diferente al de k 1 era k 36, en el que las guaninas estaban presentes en las posiciones -13 a -15. Una guanina sola en la posición -15 o acompañada de otra en la posición -14 no dio como resultado una diferencia significativa en el nivel de fluorescencia con respecto al de k 1. Por lo tanto, incluso en presencia de una secuencia de Kozak extendida optimizada para una alta expresión génica, múltiples mutaciones en la región aguas arriba tienen repercusiones evidentes en la síntesis de proteínas y pueden usarse como un medio para ajustar la abundancia de proteínas. Se presenta una explicación de este resultado en la sección Análisis computacional, a continuación. Curiosamente, cuatro guaninas mezcladas con adeninas (k 33) en la región upstream reducido k 1 fluorescencia en menor medida que cuatro guaninas seguidas (k 32), lo que proporciona una confirmación adicional de que el efecto sobre la expresión génica de las mutaciones puntuales dentro de la 5 ′ -UTR depende en gran medida del contexto nucleotídico (Fig.2, consulte el archivo adicional 1 para una comparación con k 0 fluorescencia).

Múltiples mutaciones puntuales a guanina. La relación entre el nivel de fluorescencia de las 5 ′ -UTR sintéticas de k 26 para k 38 y el de k 1 Están reportados. El número de adeninas o guaninas en la región aguas arriba se da debajo del nombre de la secuencia líder (de k 27 para k 38). Los subíndices -1, -2 y -3 indican que una adenina está presente en la secuencia de Kozak extendida solo en la posición correspondiente. Subíndice I representa entremezclado (ver texto principal). Asteriscos pag-valor & lt0.05 vs. k 1

La región aguas arriba

El análisis anterior confirmó que el efecto sobre la expresión génica debido a mutaciones únicas y múltiples dentro de la 5 '-UTR depende en gran medida del contexto. Además, nuestros datos mostraron claramente que los cambios no solo en la secuencia de Kozak sino también dentro de la región aguas arriba afectan marcadamente la expresión génica. Por lo tanto, realizamos mutaciones puntuales en k 1 entre las posiciones -9 y -15 (Tabla 3) para evaluar si un solo nucleótido diferente de la adenina puede cambiar la tasa de traducción cuando se coloca en la región aguas arriba.

Todas las mutaciones puntuales (excepto la de k 38) resultó en un nivel de fluorescencia más alto que el asociado con k 1. En particular, en ocho casos, el aumento de la fluorescencia fue estadísticamente significativo (& gt10 % más alto que k 1 fluorescencia). Estas ocho mutaciones incluían cuatro posiciones contiguas, de -11 a -14. Ninguno de estos fue tenido en cuenta en el trabajo de referencia de Dvir et al. [9].

En la posición -11, una guanina en lugar de una adenina (k 47) expresión de fluorescencia mejorada por & gt15 %, mientras que la citosina y la timina no tuvieron efectos significativos. Cada mutación en la posición -12 aumentó la fluorescencia de k 1. El mayor cambio (& gt15 %) se debió a una guanina (k 50). Las mutaciones en la posición -13 también mejoraron fuertemente k 1 nivel de fluorescencia. Dos mutaciones puntuales: citosina (k 51) y guanina (k 53) —Resultado en diferencias estadísticamente significativas en la fluorescencia de k 1, mientras que una timina (k 52) aumentado k 1 fluorescencia en aproximadamente 14 % pero esto no alcanzó significación estadística. Cabe señalar que entre todos nuestros 58 5 ′ -UTR sintéticos, k 51 tenía el nivel de fluorescencia más alto, casi 17 % más alto que el de k 1.

Finalmente, dos mutaciones puntuales diferentes en la posición -14 condujeron a un aumento de la fluorescencia: una citosina (k 54) y una timina (k 55) (Fig.3, consulte el archivo adicional 1 para una comparación con k 0).

Efecto de las mutaciones puntuales en la región aguas arriba sobre la fluorescencia en relación con k 1. The nucleotide that replaced an adenine in k 1 and the position at which the mutation took place are given below the name of each synthetic leader sequence. Asterisks, pag-value <0.05 vs. k 1

Together, the results of this last analysis of the upstream region underline another surprising result: single point mutations upstream of the Kozak sequence, in particular at positions −12 and −13, were those that most enhanced gene expression from a context rich in adenines.

Computational analysis

We carried out simulations with RNAfold to investigate possible correlations between computed mRNA secondary structures, together with their corresponding minimum free energies (MFEs), and measured fluorescence levels. Our analysis provides an explanation for the drop in fluorescence due to multiple mutations from adenine to guanine (and cytosine) in the −15…−1 region. In contrast, no plausible justification for the effects of single point mutations on translational efficiency emerged from simulations with RNAfold.

As an input for RNAfold, we used mRNA sequences starting at the transcription start site of pCYC1min [16] and ending at the poly-A site of the CYC1 terminator [20]. Each sequence was 937 nucleotides long. From preliminary simulations, we observed that a poly-A chain with a variable length of 150–200 nucleotides had no significant effect on mRNA folding. All mRNA secondary structures were calculated at 30 °C (the temperature at which we grew S. cerevisiae cells for the FACS experiments).

k 0 y k 1 have the same MFE: −241.21 kcal/mol. This is the highest—and the most common—within the collection of 59 sequences analyzed in this work (see Additional file 1). The mRNA secondary structure corresponding to this MFE is characterized by the presence of a giant hairpin between positions −40 and +10. The hairpin loop goes from position −31 to position +1 and contains the whole 5 ′ -UTR portion we have targeted here. The hairpin stem is made of nine base-pairs, of which only one gave a “mismatch” because of an adenine at position −38 and +8 (see Fig. 4 a).

mRNA secondary structures. a A giant hairpin is present in the mRNA secondary structure corresponding to the MFE of both k 0 y k 1. The hairpin loop contains the −15…−1 region. The portion of the 5 ′ -UTR in our analysis is free from any pairing interactions in its wild-type configuration (k 0) and in that theoretically optimized for high protein expression (k 1). The loop of the giant hairpin is reduced in k 4 owing to the base-pairing interaction between the guanine at position −1 and the cytosine at position −31. In every mRNA structure presented, a green arrow indicates position +1, and a red arrow indicates position −15. B The disruption of the giant hairpin induces a decrease in the MFE of the mRNA secondary structure. k 26 y k 31 are associated with the lowest MFEs computed in our analysis. The two sequences contain multiple guanines in the extended Kozak sequence involved in pairing interactions with the CDS. A similar pattern is also present in k 30. Here, however, a second mini-loop around the START codon provokes an increase in MFE. The MFE of k 26 is substantially lower than those of k 30 y k 31 because of the presence of another stem due to pairing interactions between the upstream region and the CYC1 terminador. Nevertheless, the fluorescence levels of k 30 y k 31 are only approximately 1.2-fold higher than that of k 26

Multiple mutations to guanines either in the upstream region or the extended Kozak sequence originate base-pairing interactions between, at least, a portion of the −15…−1 region and the CDS (yEGFP) or the CYC1 terminador. As a consequence, the giant hairpin is destroyed and replaced by one or two stems that lower the MFE of the mRNA secondary structure (Table 2). Most of the MFE values smaller than −241.21 kcal/mol were associated with fluorescence levels lower than that of k 1 (Fig. 5). This result is in agreement with the notion, supported also by [8, 9], that stable mRNA secondary structures in the 5 ′ -UTR reduce protein expression. However, the fluorescence levels we measured did not increase proportionally to increments in the MFE. Moreover, in two cases (k 32 y k 36) RNAfold predicted a giant hairpin in the mRNA structure, whereas the fluorescence levels from our experiments were significantly lower than that of k 1 (Fig. 5 and Additional file 1).

Low MFE values are associated with reduced fluorescence expression. Red bars, difference between MFEs of the corresponding 5 ′ -UTR and k 1 (ΔMFE). Blue bars, 10-fold magnified ratio between the fluorescence level of the indicated 5 ′ -UTR and that of k 1. Aparte de k 1, sequences are sorted by increasing ΔMFE. All sequences except k 4 contain multiple point mutations with respect to k 1. Asterisks above blue bars, pag-value <0.05 vs. k 1

k 26 was designed by choosing the least frequent nucleotides between positions −15 and −1 among a set of highly expressed S. cerevisiae genes. The corresponding MFE (−261.39 kcal/mol) was the lowest within the ensemble of transcription units considered in this work. No giant hairpin was present in the MFE mRNA secondary structure as the −15…−1 region was sequestered into two different stems. The guanines between positions −1 and −6 were part of a long stem and paired with a hexamer at the beginning of the yEGFP sequence (positions +33 to +38). In contrast, positions −9 to −15 paired with a region of the CYC1 terminator, at positions +750 to +758 (Fig. 4 b).

A fluorescence level just above that of k 26 was registered for k 30 y k 31. Both differed from k 26 for the upstream region (made of seven adenines) and the presence of an adenine in the extended Kozak region (at positions −2 and −3, respectively). Similarly to k 26, the first five nucleotides of the extended Kozak region of k 30 and the first six of k 31 were sequestered into a stem with the CDS. However, differently from k 26, the upstream regions of k 30 y k 31 were entirely free from any pairing interactions (see Fig. 4 b). Their MFEs (−244.28 and −247.26 kcal/mol, respectively) were also significantly higher than that of k 26. These three sequences suggest that a condition for markedly lowering protein expression is to enclose the nucleotides at positions −1 to −5 in an mRNA secondary structure. Moreover, not all of these nucleotides have to participate in base-pairing interactions. Indeed, a guanine at position −1 (k 30) or −2 (k 26 y k 31) is “free” and responsible for the presence of a mini-loop in the mRNA structure.

However, this hypothesis is contradicted by k 29. The MFE of this sequence (−245.97 kcal/mol) is comparable to that of k 30 y k 31, and the corresponding mRNA secondary structure is very similar to that of k 31 (Fig. 6 a). Nevertheless, the fluorescence level associated with k 29 was more than 6-fold higher than that of k 31 and amounted to 45% of that of k 1.

mRNA secondary structures. a k 27 difiere de k 29 only by a guanine instead of an adenine at position −1. However, their mRNA secondary structures are dissimilar. En k 27, the extended Kozak sequence is involved in base-pairing interactions with the CYC1 terminator, whereas in k 29 the extended Kozak sequence is locked into a stem with the CDS. The MFE associated with k 27 is lower than that of k 29, but there is no difference between the fluorescence levels of the two sequences (pag-value =0.20). B Multiple guanines in the upstream region give rise to mRNA structures characterized by base-pairing interactions between the 5 ′ -UTR and the CYC1 terminador. k 28 y k 34 have six guanines in a stem with the CYC1 terminator, whereas k 35 has only 5 guanines in an analogous structure. This causes an increase in MFE and consequently a higher fluorescence

k 27 shared with k 29k 31 an upstream region made only of adenines. However, unlike in these three sequences, the extended Kozak sequence of k 27 did not contain any adenine. The MFE of k 27 (−247.04 kcal/mol) was comparable to that of k 29k 31, but its corresponding mRNA secondary structure had a different configuration. Indeed, all nucleotides of the extended Kozak sequence (with the exception of the cytosine at position −7) were involved in base-pairing interaction not with the CDS but with the CYC1 terminator (positions +755 to +762 Fig. 6 a). The fluorescence level of k 27 was slightly higher than that of k 29, i.e. almost 7-fold greater than that of k 31.

The five sequences considered so far (k 26, k 27, k 29k 31) have in common an extended Kozak region rich in guanine that was sequestered into a stem in the MFE mRNA secondary structure. In four cases, the extended Kozak sequence paired (partially) with the CDS, and in one case (k 27) with the CYC1 terminador. The MFE of k 26 was the lowest, as its upstream region was also sequestered into a stem. The other four sequences showed very similar MFE values but rather different fluorescence levels.

The other group of sequences affected by multiple mutations with respect to k 1 had only adenines in the extended Kozak sequence and a variable number of guanines in the upstream region.

k 28, k 34, y k 35 had, respectively, 7, 6, and 5 guanines in a row from position −15 downstream. Although the MFE of k 35 was clearly higher than that of k 28 y k 34 (Table 2), the three sequences gave rise to similar mRNA structures where at least five guanines of the upstream region (plus the first adenine downstream) were locked into a stem due to base-pairing interactions with the CYC1 terminator (see Fig. 6 b).

Interestingly, both the MFE and fluorescence level of k 28 were comparable to those of k 27 y k 29. Hence, even if the Kozak sequence was free of pairing interactions, the sequestering of the upstream region into a stem was enough to guarantee a clear drop in protein expression. This is further confirmation of the role played by the nucleotides upstream of the Kozak sequence in tuning protein expression.

A different MFE mRNA secondary structure was obtained for k 33 (four guanines, intermixed with adenines), in which half of the extended Kozak sequence and almost the whole upstream region were involved in base-pairing interactions with the CDS, giving rise to a long stem. However, compared to k 35, where only five nucleotides of the upstream region were locked into a stem with the CYC1 terminator, k 33 showed a higher MFE as well as a higher fluorescence level (Fig. 5 and Additional file 1).

Finally, for k 32, k 36, y k 37 (with four, three, and two guanines in the upstream region, respectively) RNAfold returned the same MFE as for k 1. The corresponding mRNA secondary structures were all characterized by the presence of the the giant hairpin (see Additional file 1). Compared to our experimental data, this result was plausible only for k 37 but in apparent disagreement with the measurements for k 32 y k 36, whose fluorescence levels were significantly lower than that of k 1 (Fig. 5). In particular, the fluorescence of k 32 only corresponded to about 69% of that of k 1. Therefore, it can be argued that in vivo k 32 y k 1 share the same MFE and mRNA secondary structure, as suggested by the in silico simulations.

In contrast to the multiple point mutations, of the single point mutations on k 1, solamente k 4 caused a modification in the structure of the giant hairpin and a consequent decrease in the MFE. k 4 carries a guanine at position −1 that pairs with the cytosine at position −31 such that the length of the loop is reduced from 32 to 29 nucleotides and the MFE is lowered to −241.42 kcal/mol (Fig. 4 a). According to our data, this minimal change has no effect on fluorescence expression. All the other point mutations that induced a fluorescence level significantly higher than that of k 1 (namely, k 16, k 47k 51, y k 53k 55) were characterized by the same MFE and corresponding mRNA secondary structure as k 1, according to the RNAfold simulations.


The next steps: making new DNA

One of the original DNA strands is used as a template for the synthesis of new DNA. The primers anneal to the template strand, and the DNA polymerase enzyme makes a new strand of DNA by creating a complementary sequence of nucleotides drawn from the reaction mixture.

The new DNA strand is made by complementary base pairing with the original DNA template. Because all four ordinary DNA nucleotides are present in large amounts, the chain elongation continues normally – until by chance a dideoxynucleotide (terminator) is added in the place of a normal DNA nucleotide.

The dideoxynucleotides are just like ordinary DNA nucleotides except that one hydroxyl (OH) group has been chemically changed to a hydrogen (H). With normal DNA nucleotides, one nucleotide can be attached to another and so on, forming a chain. The chemical change in a dideoxynucleotide, however, means that no additional nucleotides can be added, hence the name ‘terminator nucleotides’.

The synthesis of new DNA is terminated when one of the dideoxynucleotides is added to the strand. Because there are many more ordinary nucleotides than dideoxynucleotides, some chains will be several hundred nucleotides long before a dideoxynucleotide is added. The end result is a whole lot of new DNA fragments, of varying length, all ending with a dideoxynucleotide.


How to identify the GPD gene when the sequence varies between organisms? - biología

Proteomics is the study of the entire set of proteins produced by a cell type in order to understand its structure and function.

Objetivos de aprendizaje

Explain how the field of genomics led to the development of proteomics

Conclusiones clave

Puntos clave

  • Proteomics investigates how proteins affect and are affected by cell processes or the external environment.
  • Within an individual organism, the genome is constant, but the proteome varies and is dynamic.
  • Every cell in an individual organism has the same set of genes, but the set of proteins produced in different tissues differ from one another and are dependent on gene expression.

Términos clave

  • proteómica: the branch of molecular biology that studies the set of proteins expressed by the genome of an organism
  • proteome: the complete set of proteins encoded by a particular genome
  • genómica: the study of the complete genome of an organism

Proteomics is a relatively-recent field the term was coined in 1994 while the science itself had its origins in electrophoresis techniques of the 1970’s and 1980’s. The study of proteins, however, has been a scientific focus for a much longer time. Studying proteins generates insight into how they affect cell processes. Conversely, this study also investigates how proteins themselves are affected by cell processes or the external environment. Proteins provide intricate control of cellular machinery they are, in many cases, components of that same machinery. They serve a variety of functions within the cell there are thousands of distinct proteins and peptides in almost every organism. The goal of proteomics is to analyze the varying proteomes of an organism at different times in order to highlight differences between them. Put more simply, proteomics analyzes the structure and function of biological systems. For example, the protein content of a cancerous cell is often different from that of a healthy cell. Certain proteins in the cancerous cell may not be present in the healthy cell, making these unique proteins good targets for anti-cancer drugs. The realization of this goal is difficult both purification and identification of proteins in any organism can be hindered by a multitude of biological and environmental factors.

El estudio de la función de los proteomas se llama proteómica. Un proteoma es el conjunto completo de proteínas producidas por un tipo de célula. Genomics led to proteomics (via transcriptomics) as a logical step. Proteomes can be studied using the knowledge of genomes because genes code for mRNAs and the mRNAs encode proteins. Although mRNA analysis is a step in the right direction, not all mRNAs are translated into proteins. La proteómica complementa la genómica y es útil cuando los científicos quieren probar sus hipótesis basadas en genes. Even though all cells of a multicellular organism have the same set of genes, the set of proteins produced in different tissues is different and dependent on gene expression. Por tanto, el genoma es constante, pero el proteoma varía y es dinámico dentro de un organismo. In addition, RNAs can be alternately spliced (cut and pasted to create novel combinations and novel proteins) and many proteins are modified after translation by processes such as proteolytic cleavage, phosphorylation, glycosylation, and ubiquitination. There are also protein-protein interactions, which complicate the study of proteomes. Aunque el genoma proporciona un modelo, la arquitectura final depende de varios factores que pueden cambiar la progresión de los eventos que generan el proteoma.

Large-scale proteomics machinery: This machine is preparing to do a proteomic pattern analysis to identify specific cancers so that an accurate cancer prognosis can be made.


Few steps to find amino acid sequence

STEP 1 – Know which DNA strand is given. There are two strands: Coding strand or non-coding strand.

One can either read the coding strand from 3’ to 5’ or read the template strand from 5’ to 3’ when making the corresponding m-RNA strand.

STEP 2 – Write the corresponding m-RNA strand.

Using Coding strand: (A= U, T= A, G=C, C=G) Read from left to right

Using template strand: (T=U)Read from left to right

We can see that we achieve the same sequence irrespective of the strand used.

STEP 3 – Convert m-RNA as a sequence of codons. ALWAYS start from the codon AUG and NEVER count the same nucleotide twice!

STEP 4 – Use the below table to find the relevant amino acid sequence.

Also remember,
una. Start codon AUG stands for Methionine.
B. If you come across a stop codon UAA, UGA, UAG you should stop sequencing.


Ver el vídeo: Metodos y aplicaciones del sistema CRISPR cas para la edicion del genoma en celulas madres (Diciembre 2022).