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¿BSA para solucionar problemas de PCR fallidos?

¿BSA para solucionar problemas de PCR fallidos?


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Estoy usando PCR para amplificar una región de 1000 pb del gen CytB mt. Algunas de las muestras no se han amplificado y deseo cambiar los componentes de la reacción (o usar aditivos como BSA) para intentar obtener la amplificación. El ADN se extrajo de muestras de hígado / músculo, por lo que no espero que haya muchos inhibidores presentes, pero estoy eluyendo muestras en tampón AE.

Usé las siguientes combinaciones de mezcla de PCR pero las reacciones aún fallaron (volumen de reacción 20 ul)

Combinación1: MasterMix (10ul), Primer 1 (1ul), Primer 2 (1ul), BSA 2mg / ml (2ul), agua (4ul), ADN (2ul) Combinación2: MasterMix (10ul), Primer 1 (1ul), Primer 2 (1 ul), BSA 2 mg / ml (4 ul), agua (3 ul), ADN (1 ul): se intentó aumentar la concentración de BSA y reducir el ADN para disminuir el volumen de inhibidores (si los hay) que entran en la mezcla de reacción.

Alguien que haya usado anteriormente BSA para solucionar problemas de PCR con éxito, ¿estoy haciendo esto de la manera correcta? Si necesito adoptar un enfoque diferente, por favor ayúdenme.

¡Gracias!


¿BSA para solucionar problemas de PCR fallidos? - biología

El artículo aborda muchas preguntas relacionadas con los reactivos utilizados en las reacciones de PCR, incluidas las tasas de error de las ADN polimerasas y los resultados de la encuesta basados ​​en artículos formales. También se incluye un protocolo típico de PCR y algunas preguntas frecuentes.

Consulte Métodos de PCR actuales para obtener una discusión sobre varios métodos de PCR Máquinas de PCR para una encuesta sobre máquinas de PCR basada en la literatura y los programas de software en investigación biomédica para obtener una discusión y los resultados de la encuesta sobre los programas de software de biología molecular, incluidos aquellos para el diseño de cebadores de PCR.

Se encuentran disponibles múltiples polimerasas de PCR de proveedores comerciales. Las polimerasas provienen de diferentes fuentes y con diversos grados de fidelidad de replicación y con diferente velocidad de extensión. La Tabla 1 enumera las principales polimerasas de PCR y algunas de sus características importantes. La polimerasa Taq se purificó inicialmente a partir de T. aquaticus células, y más tarde el gen se clonó y expresó en células de E. coli. La polimerasa Taq recombinante, denominada ADN polimerasa AmpliTaq, se utilizó comúnmente [2]. La polimerasa Taq puede inactivarse químicamente a bajas temperaturas, y esta modificación puede revertirse a alta temperatura esta modificación reversible dependiente de la temperatura de la proteína Taq, AmpliTaq Gold, presente en mezclas como Thermo Power SYBR ™ Green PCR Master Mix, puede ser utilizado como enzima de PCR de arranque en caliente [2]. La ADN polimerasa de Phusion fusiona la ADN polimerasa de Pfu con la proteína de unión al ADN, Sso7d, de S. solfataricus [3] para aumentar su rendimiento de procesividad conservando la alta fidelidad de la polimerasa Pfu [2]. También se han diseñado ADN polimerasas especializadas [4].

Labome recopila sistemáticamente información sobre reactivos, instrumentos y programas de software de artículos formales seleccionados al azar. La Tabla 2 enumera las polimerasas de PCR más comúnmente citadas y sus principales proveedores de una encuesta de artículos formales que citan ADN polimerasas para PCR. Por ejemplo, Liu Y et al midieron los niveles de ARN de múltiples genes de macrófagos peritoneales de ratón en qPCR con SYBR Green Realtime PCR Master Mix de TOYOBO (QPK-201) por QuantStudio 7 Flex de Thermo Fisher Scientific después de la extracción total de ARN con reactivo TRIzol y reverso transcripción utilizando ReverTra Ace qPCR RT Master Mix con gDNA Remover de TOYOBO (FSQ301) [15]. Chopra S et al utilizaron PerfeCTa SYBR green fastmix de Quantabio y TaqMan Universal PCR master mix de Thermo Fisher para RT-PCR cuantitativa [16]. Flaherty SE et al evaluaron la expresión de múltiples genes en macrófagos derivados de la médula ósea con PCR cuantitativa utilizando QIAGEN PCR SYBR Green I QuantiTect Master Mix [21].

Las tasas de error de las ADN polimerasas dependen de las condiciones de la PCR. Por ejemplo, cuando el pH de la reacción cambió de pH 8 a 9, la tasa de error de Pfu disminuyó ∼2 veces y la tasa de error de Pfu exodeficiente aumentó ∼9 veces [36]. El Dr. Peter McInerney y sus colegas compararon seis ADN polimerasas de uso común en aplicaciones de PCR en tampones recomendados por los proveedores en 2014 [1]. La Figura 1 enumera las tablas de su artículo, lo que indica que Pfu (Agilent), Phusion (Finnzymes) y Pwo (Roche) produjeron 10 veces menos errores que la polimerasa Taq regular y que la mayoría de los errores son mutaciones de transición. Q5 La polimerasa de alta fidelidad de NEB, basada en una nueva ADN polimerasa, parece ser una de las polimerasas populares de baja tasa de error [37, 38]. Según su proveedor, NEB, tiene una tasa de error

280 veces más bajo que el de la ADN polimerasa Taq. Boettcher S et al utilizaron la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 para New England Biolab (M0491L) para el cribado TP53 MITE-seq [39]. de Goffau MC et al tenían como objetivo detectar el gen ARNr 16S bacteriano de forma exhaustiva a partir de tejidos placentarios humanos con la misma polimerasa Q5 [40]. D Cervettini et al también lo utilizaron para su trabajo sobre la evolución de nuevos pares de aminoacil-tRNA sintetasa-tRNA [41]. Invitrogen Platinum SuperFi ADN polimerasa con una fidelidad 100 veces mayor en comparación con la Taq nativa, se utilizó en PCR de alta rigurosidad para detectar mutaciones somáticas del gen APP en la enfermedad de Alzheimer y neuronas normales [22]. Lee J et al utilizaron la ADN polimerasa PrimeSTAR GXL de Clontech para detectar cualquier mutación fuera del objetivo en la edición genómica de LMNA mediada por TALEN [42].

Las reacciones de PCR se pueden realizar directamente en muestras biológicas sin ninguna purificación previa de las moléculas de ADN. El Dr. Miura y sus colegas compararon seis polimerasas de ADN de tipo PCR directas (KOD FX, Mighty Amp, Hemo KlenTaq, Phusion Blood II, KAPA Blood y BIOTAQ) en sangre seca eluida de un papel de filtro con tampón TE y concluyeron que KOD FX era lo mejor para la PCR directa basada en sangre debido a su resistencia contra la inhibición de los componentes sanguíneos y contra los detergentes suaves [43].

Plantillas de ADN, cebadores, ddH2O, ADN polimerasa de proveedores comerciales con tampones de reacción específicos, dNTP, MgSO4 (opcional) y DMSO (opcional).


BSA, grado de biología molecular

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Búfer de almacenamiento

Tris-HCl 20 mM
KCl 100 mM
EDTA 0,1 mM
50% de glicerol
pH 8 @ 25 y ° C

Productos complementarios

  • B9000Datasheet-Lot0011301
  • B9000Datasheet-Lot0011306
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  • B9000Datasheet-Lot0081404
  • B9000Datasheet-Lot0031409
  • B9000Datasheet-Lot0051502
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  • B9000Datasheet-Lot0071511
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  • B9000Datasheet-Lot0091603
  • B9000Datasheet-Lot0101607
  • B9000Datasheet-Lot0111610
  1. ¿Cuál es la fuente de su BSA?
  2. ¿Cuál es la composición tampón de su BSA?
  3. ¿Por qué necesito agregar BSA a mi reacción?
  4. ¿Está la BSA en su forma nativa?
  5. ¿Puedo usar su BSA como marcador de peso molecular?
  6. ¿Puedo usar su BSA como estándar de concentración?
  7. ¿Cuál es la diferencia entre BSA (B9001S) que se suspendió y BSA, grado de biología molecular (B9000S)?
  8. ¿Por qué veo bandas de ADN adicionales en mi gel después de una digestión de restricción?
  9. ¿Por qué mi enzima de restricción no corta el ADN?
  10. ¿Por qué veo un frotis de ADN en un gel de agarosa después de una digestión de restricción?
  11. ¿Cuántos nucleótidos debo agregar adyacentes al sitio de reconocimiento de RE para obtener un corte eficiente?
  12. ¿Está acetilada la BSA?

Herramienta de citas de productos

Especificaciones

  • B9000S_v1_0161802
  • B9000S_v1_0171803
  • B9000S_v1_10009983
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Este producto está destinado únicamente a fines de investigación. Este producto no está destinado a ser utilizado con fines terapéuticos o de diagnóstico en humanos o animales.

New England Biolabs (NEB) está comprometido con la práctica de la ciencia ética y creemos que es nuestro trabajo como investigadores hacer las preguntas importantes que, cuando se respondan, ayudarán a preservar nuestra calidad de vida y el mundo en el que vivimos. Sin embargo, esta investigación siempre debe realizarse de manera segura y ética. Aprende más.


¿BSA para solucionar problemas de PCR fallidos? - biología

Cursos de espectrometría de masas, cromatografía, espectroscopia, software, disolución, manipulación de muestras y tecnologías de vacío

Educación continua bajo demanda

Capacitación y talleres de instrumentos

Seminarios web en vivo o bajo demanda sobre presentaciones de productos, aplicaciones y mejoras de software

Ferias, conferencias, seminarios locales y reuniones de grupos de usuarios en todo el mundo

Servicios de gestión de laboratorio

Planes de servicio, reparación bajo demanda, mantenimiento preventivo y reparación del centro de servicio

Software para administrar instalaciones, acceso / uso de instrumentos, procesamiento de muestras y más

Calificaciones de instrumentos / software, consultoría y validaciones de integridad de datos

Mantener, optimizar, implementar o desarrollar métodos en soluciones Agilent nuevas o existentes.

La última tecnología de etiquetado utilizada para rastrear recursos sin interrumpir al personal

Otros servicios Header1

Los servicios CrossLab Connect utilizan datos de laboratorio para mejorar el control y la toma de decisiones

Operaciones de laboratorio avanzadas con servicios en todo el laboratorio, gestión de activos y reubicación

Acorte el tiempo necesario para comenzar a ver el valor total de su inversión en instrumentos


Efectos aditivos de la albúmina sérica bovina, el ditiotreitol y el glicerol en la PCR

Se estudiaron los efectos de la albúmina sérica bovina, el ditiotreitol y el glicerol en la PCR. La PCR en condiciones estándar falló en la amplificación de un fragmento de ADN de E. coli enterohemorrágico cuando se usó como molde el lisado de células bacterianas hervidas. La adición de albúmina de suero bovino, ditiotreitol o glicerol en la mezcla de reacción permitió la amplificación del fragmento específico y las concentraciones óptimas fueron las siguientes: albúmina de suero bovino, 1 mg / ml de ditiotreitol, 10 mM y glicerol, 5%. Además, cuando los tres agentes se incluyeron en las concentraciones anteriores, el rendimiento de la PCR se incrementó aún más. El efecto de la mezcla de tres agentes no fue específico de la plantilla. Además, la mezcla permitió una PCR larga de más de 20 kb cuando se utilizó la ADN polimerasa Taq con actividad exonucleasa 3'-5 'para la amplificación. Nuestro método de PCR simple permite una PCR robusta independiente de la pureza del molde o la longitud de amplificación.


Albúmina recombinante, grado de biología molecular

¿Necesita evitar la BSA o la albúmina de origen animal? La albúmina recombinante, grado de biología molecular, es una albúmina de origen no bovino que puede servir como alternativa a la albúmina de suero bovino (BSA). Al igual que BSA, se ha demostrado que previene la adhesión de enzimas a los tubos de reacción y las superficies de las pipetas. También estabiliza algunas proteínas durante la incubación. Elija Albúmina Recombinante, cuando sea necesario evitar BSA.

Rendimiento de estabilidad equivalente entre BSA y albúmina recombinante. La BSA y la albúmina recombinante se utilizan para estabilizar las enzimas en una reacción. NcoI-HF (NEB # R3193) se formuló con BSA, grado de biología molecular o albúmina recombinante y luego se almacenó a -20 ° C durante 2 años. Luego se realizaron diluciones en serie. Los datos muestran equivalencia entre la enzima formulada con BSA, grado de biología molecular y albúmina recombinante.

Albúmina recombinante que puede servir como alternativa a BSA, que puede prevenir la adhesión de enzimas a los tubos de reacción y superficies de pipetas, así como estabilizar algunas proteínas durante la incubación. Pregunte por formulaciones personalizadas con albúmina recombinante.

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Búfer de almacenamiento

Tris-HCl 20 mM
KCl 100 mM
EDTA 0,1 mM
50% de glicerol
pH 8 @ 25 y ° C


Referencias

Meyerhans, A., Vartanian, J.P. & amp Wain, H.S. Recombinación de ADN durante la PCR. Ácidos nucleicos Res. 18, 1687–1691 (1990).

Polz, M.F. y Cavanaugh, C.M. Sesgo en las proporciones de plantilla a producto en PCR multitemplate. Apl. Reinar. Microbiol. 64, 3724–3730 (1998).

Qiu, X. et al. Evaluación de quimeras, mutaciones y heterodúplex generados por PCR con clonación basada en genes de ARNr 16S. Apl. Reinar. Microbiol. 67, 880–887 (2001).

Ghadessy, F.J., Ong, J.L. & amp Holliger, P. Evolución dirigida de la función de la polimerasa por autorreplicación compartimentada. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 98, 4552–4557 (2001).

Ghadessy, F.J. et al. Expansión genérica del espectro de sustrato de una ADN polimerasa por evolución dirigida. Nat. Biotechnol. 22, 755–759 (2004).

Nakano, M. et al. Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa de una sola molécula utilizando una emulsión de agua en aceite. J. Biosci. Bioeng. 99, 293–295 (2005).

Wetmur, J.G. et al. Haplotipado molecular mediante PCR en emulsión de enlace: análisis de haplotipos y fenotipos de paraoxonasa 1. Ácidos nucleicos Res. 33, 2615–2619 (2005).

Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K.W. & amp Vogelstein, B. Transformación de moléculas de ADN individuales en partículas magnéticas fluorescentes para la detección y enumeración de variaciones genéticas. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 100, 8817–8822 (2003).

Kojima, T. et al. Amplificación por PCR a partir de moléculas de ADN individuales en perlas magnéticas en emulsión: aplicación para el cribado de alto rendimiento de objetivos de factores de transcripción. Ácidos nucleicos Res. 33, e150 (2005).

Margulies, M. et al. Secuenciación del genoma en reactores de picolitro de alta densidad microfabricados. Naturaleza 437, 376–380 (2005).

Shendure, J. et al. Secuenciación polonia multiplex precisa de un genoma bacteriano evolucionado. Ciencias 309, 1728–1732 (2005).


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El sulfato de amonio mejora la sensibilidad y evita falsos negativos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección del virus de la enfermedad por caída de escamas (SDDV)

La precisión es crucial para los laboratorios de diagnóstico de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Notamos resultados de PCR inconsistentes o falsos negativos que a veces ocurrieron al cambiar la marca comercial de la enzima Taq ADN polimerasa. Aquí, probamos 6 conjuntos de cebadores específicos para 3 virus importantes de la acuicultura (virus de la enfermedad de la caída de escamas (SDDV), virus del lago de la tilapia (TiLV) y virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV)) utilizando 7 marcas de enzimas polimerasas de ADN Taq (RBC Bioscience, Invitrogen, PCRBiosystems, Bio-Helix, biotechrabbit, GeneAll y New England BioLabs) con sus tampones de reacción originales. Se observaron falsos negativos y una variación en la sensibilidad de 10 a 1000 veces. Curiosamente, solo las enzimas de RBC Bioscience e Invitrogen podían amplificar los productos SDDV de 252 pb, mientras que otras 5 marcas no lo hicieron. El uso de tampón de reacción de RBC Bioscience con enzimas polimerasa Taq de otras marcas resultó en una mejora de la sensibilidad de detección y evitó falsos negativos. La comparación de los ingredientes de los 7 tampones de reacción indicó que la albúmina de suero bovino (BSA) y el sulfato de amonio estaban presentes en el tampón RBC Bioscience pero no estaban o no estaban especificados en otras 6 marcas. Posteriormente, descubrimos que agregar sulfato de amonio a los tampones originales de las 4 marcas seleccionadas mejoró la eficiencia de detección para la mayoría de las reacciones de prueba, mientras que agregar BSA solo o BSA más sulfato de amonio mostró poca o ninguna mejora. Cuando se prueba con diluciones seriadas de ADN extraído de 2 peces infectados con SDDV, agregar sulfato de amonio al tampón original de la marca biotechrabbit podría mejorar la sensibilidad de detección 100 veces, igual al resultado del kit RBC Bioscience. Por lo tanto, recomendamos que el tampón de reacción de PCR con sulfato de amonio (10 mM) agregado pueda mejorar la sensibilidad de detección y evitar resultados negativos falsos en los ensayos de detección de PCR.

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¿BSA para solucionar problemas de PCR fallidos? - biología

EN EL VERANO DE 1984 los científicos de alto nivel de Cetus Corp., una empresa de biotecnología de Berkeley, se encontraron en un aprieto. Uno de sus empleados, un joven científico prometedor llamado Kary Mullis, había ideado una técnica para replicar exponencialmente pequeños fragmentos de ADN. Lo llamó reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y si funcionaba cambiaría el mundo y probablemente le haría ganar a Cetus una montaña de dinero. El único problema era que Mullis era una bola de demolición interpersonal.

Luchó con sus jefes. Peleó con sus compañeros de trabajo. Peleó con los guardias de seguridad y recepcionistas de Cetus. Aunque estaba casado, salía con sus compañeros de laboratorio y también peleaba con ellos. Detrás de la belicosidad de Mullis parecía haber una certeza permanente de que él era brillante y todos los demás eran tontos, empeñados en socavar su trabajo. La gerencia de Cetus se quedó preguntándose: ¿Qué hacemos con este tipo?

La PCR finalmente cambió el mundo, y Mullis se unió a las filas de los 53 ganadores del Premio Nobel de UC Berkeley. El laureado falleció en agosto de 2019 a los 74 años por complicaciones de una neumonía.

Una gran cantidad de obituarios han bailado hábilmente en torno a los atributos personales más espinosos de Mullis, pero tal vez haya pasado suficiente tiempo para que podamos enfrentar una pregunta no muy diferente a la que hizo la gerencia de Cetus en 1984: ¿Cómo debemos recordar a este tipo?

LAS COSAS HABÍAN HECHO UN POCO DIFERENTE, La PCR podría haber permanecido como un rayo de luz en los ojos de su inventor. Afortunadamente para Mullis, y probablemente para el resto de nosotros, tenía un defensor.

Años antes, como estudiante de doctorado en bioquímica en Berkeley, Mullis se acercó a un compañero de clase más joven llamado Tom White después de ayudar a reparar una válvula rota en el error VW averiado de White.

"Dije, si contratas a este tipo, Mullis, es un excelente químico sintético. Sabía que era un buen químico porque había estado sintetizando drogas alucinógenas en Berkeley ".

“[Mullis] me ordenó como ministro de Vida Universal”, dice White. "Y realicé la ceremonia de la boda de su segunda esposa en los días hippies en el campus".

Mullis era conocido en Berkeley por su enfoque irreverente de la ciencia y su habilidad para sintetizar drogas psicodélicas. Su curiosidad iba mucho más allá de la química. A los 22 años envió un artículo a la prestigiosa revista Naturaleza describiendo, en sus palabras, "el universo entero de principio a fin".

"Había leído mucho sobre astrofísica y había tomado algunas drogas psicoactivas, lo que mejoró mi comprensión percibida del cosmos", recuerda Mullis en sus memorias. Bailando desnudo en el campo mental. El artículo se tituló "La importancia cosmológica de la inversión del tiempo". Increíblemente, Naturaleza lo publicó. Nada mal para un estudiante de posgrado en biología.

Cuando llegó el momento de sus exámenes orales, Mullis no estaba preparado. White recuerda: “No acertó en sus propuestas. No sabía bioquímica general ". El propio Mullis creía que era el Naturaleza artículo que engrasó las ruedas con el comité. Del mismo modo, su tesis fue tan excéntrica que el comité de disertación inicialmente se negó a aprobarla. Según White, varios de sus amigos cercanos editaron sus borradores en un intento de "eliminar todas las cosas locas". Aún así, la versión final conservó su peculiaridad.

"Los profundos misterios del cosmos están por fin a nuestro alcance", escribió Mullis en la conclusión. “La pregunta que debemos hacernos es si debemos ir más allá o no. Quizás haya organismos con otros agentes aglutinantes de hierro en otros planetas. La resonancia magnética nuclear está esperando. ¿Escaparán de los dedos indiscretos y los ojos lascivos del mamífero de dos patas?

En sus memorias, Mullis recordaba haber recorrido el camino oscuro pensando para sí mismo que la idea lo haría famoso, que ganaría el Premio Nobel.

Después de mucho cabildeo por parte del asesor de Mullis, el comité se despidió.

Después de graduarse, Mullis se mudó a Kansas con la esposa número dos, se divorció, conoció a la futura esposa número tres y luego regresó a Berkeley. Mientras administraba un café propiedad de su primera esposa, se encontró con su viejo amigo Tom White, ahora un postdoctorado en UCSF Medical Center. White le consiguió a Mullis un trabajo de laboratorio en UCSF. Poco después, White fue contratado como científico investigador en Cetus Corp. Y una vez más fue a batear por Mullis.

"Dije, si contratas a este tipo, Mullis, es un excelente químico sintético", dice White. "Sabía que era un buen químico porque había estado sintetizando drogas alucinógenas en Berkeley".

A pesar de saber poco sobre biología molecular, Mullis fue contratado para trabajar en el laboratorio de síntesis de ADN de la empresa, donde se le asignó la tarea de agilizar la producción de oligonucleótidos, pequeñas moléculas que se utilizan para aislar secciones de ADN natural para su estudio. Gracias a su ingenio, la producción de oligonucleótidos se disparó. Cuando White fue ascendido a director de investigación molecular y biológica, nombró a Mullis jefe del laboratorio de síntesis de ADN.

Uno de los principales proyectos de Cetus fue la búsqueda para crear una prueba de ADN de diagnóstico general para detectar enfermedades. Los científicos de Cetus habían desarrollado un método para aislar pequeños fragmentos de ADN y probarlos en busca de mutaciones relevantes. El problema era que los fragmentos diana estaban en cantidades tan minúsculas y las muestras estaban tan abarrotadas de otros fragmentos de ADN, que los resultados de la prueba eran débiles y ambiguos.

Mullis no formaba parte del equipo de diagnóstico de ADN (no estaba exactamente calificado), pero como de costumbre, su mente hiperactiva divagaba. “[La gerencia de Cetus] dijo que el 10 por ciento de su tiempo debe hacer lo que quiera”, dijo Mullis más tarde en una entrevista. “Dije, es difícil para ellos medir lo que es el 10 por ciento de mi tiempo. Así que puedo usar todo el tiempo que quiera para mi propia curiosidad ". Una de esas curiosidades fue el desafío al que se enfrentó el equipo de diagnóstico de ADN.

Identificar estos fragmentos de ADN objetivo, escribió Mullis más tarde, fue "como leer una matrícula en particular en la Interestatal 5 por la noche desde la luna". Llevando su metáfora más allá, los científicos de Cetus tenían un telescopio lo suficientemente poderoso como para leer las matrículas, pero lucharon para diferenciar el automóvil objetivo de todos los demás en la carretera.

“Realmente no sabía mucho sobre biología molecular. Entonces, cuando trató de decirles a todos los biólogos moleculares que era una buena idea, la mayoría de ellos se mostraron muy escépticos ".

Oportunamente, la epifanía de Mullis llegó en su automóvil, mientras conducía por las colinas del condado de Mendocino. Razonó que al unir dos oligonucleótidos a una hebra dividida de ADN, podría aislar una sección deseada, como el segmento de ADN que determina la anemia de células falciformes. Añadiendo polimerasa, una enzima natural necesaria para la replicación del ADN, pudo crear dos copias idénticas del fragmento. Su siguiente pensamiento lo golpeó como una revelación: si simplemente repetía este proceso, cada repetición duplicaría el fragmento objetivo, creando una explosión exponencial del ADN objetivo y eliminando los segmentos no deseados. En esencia, los científicos de Cetus ahora tendrían un atasco para examinar a través de su telescopio. Y, lo que es más importante, todos los automóviles tendrían la misma matrícula.

En sus memorias, Mullis recordaba haber recorrido el camino oscuro pensando para sí mismo que la idea lo haría famoso, que ganaría el Premio Nobel.

Lo llamó reacción en cadena de la polimerasa e informó con entusiasmo de su idea explosiva a otros científicos de Cetus. No quedaron impresionados. No era la primera idea supuestamente "revolucionaria" que Mullis había promocionado.

"Realmente no sabía mucho sobre biología molecular", dice White. “Entonces, cuando trató de decirles a todos los biólogos moleculares que era una buena idea, la mayoría de ellos se mostraron muy escépticos. Los científicos siempre son escépticos ".

Para Mullis, el escepticismo era una afrenta. Después de una serie de experimentos fallidos, obtuvo resultados que creía que sugerían que la PCR funcionaba. Pero Mullis nunca había sido un experimentador minucioso, y estos intentos de probar su concepto carecían de controles y repetición apropiados. Los escépticos se mantuvieron escépticos.

El comportamiento errático de Mullis en Cetus no lo estaba ayudando a traer a nadie a su lado. Una fiesta de la empresa tuvo que cerrarse temprano después de que Mullis casi llegara a las manos con otro científico. También había comenzado a salir con un compañero de trabajo en su laboratorio, y los dos se involucraron en peleas públicas de amantes. En un incidente, se puso celoso de las interacciones románticas entre dos compañeros de laboratorio y amenazó con llevar un arma al trabajo.

“Definitivamente me puso en una situación difícil”, dice White. "Su comportamiento fue tan escandaloso que los otros científicos pensaron que la única razón por la que no lo despedí fue porque era un amigo mío".

Mullis guardaba un rencor eterno. Sintió que lo habían estafado, que White, Erlich, Randall Saiki y otros buscaban crédito por lo que debería ser únicamente suyo. Los llamó buitres.

En cambio, White decidió darle a Mullis una última oportunidad para demostrar si la PCR funcionaba. Lo destituyó como jefe del laboratorio de síntesis de ADN y le dijo que trabajara a tiempo completo para probar su idea. “Sabía que Mullis tenía una personalidad tan decidida y obsesiva que trabajaría en ello de una manera fenomenalmente enloquecida para tratar de que funcionara sin importar nada”, dice White. Con astucia, White asignó a un grupo separado de experimentadores de primer nivel para trabajar en el proyecto en paralelo.

Durante los siguientes meses, mientras Mullis continuó produciendo resultados ambiguos, el segundo grupo liderado por Henry Erlich y Norman Arnheim se llevó el premio gordo. Mullis había tenido razón todo el tiempo. PCR funcionó.

La técnica fue un punto de inflexión científico. En tan solo unos años, el uso de PCR se disparó, impulsando la expansión de la industria biotecnológica. El profesor de biología celular y molecular de Berkeley, David Bilder, dice: “La PCR revolucionó todo. Realmente superó a la biología molecular, que luego transformó otros campos, incluso lejanos como la ecología y la evolución. ... Es imposible exagerar el impacto de PCR. La capacidad de generar tanto ADN de una secuencia específica como desee, a partir de unos pocos productos químicos simples y algunos cambios de temperatura, es simplemente mágico ".

En 1986, Mullis dejó su trabajo en Cetus. Antes de irse, la gerencia le otorgó un bono de $ 10,000 por su idea, pero los derechos de PCR pertenecían a la empresa. Años después, Cetus vendería esos derechos por 300 millones de dólares. Mullis guardaba un rencor eterno. Sintió que lo habían estafado, que White, Erlich, Randall Saiki y otros buscaban crédito por lo que debería ser únicamente suyo. Los llamó buitres.

Se mudó a La Jolla, se dedicó al surf y en gran medida le dio la espalda a la ciencia. Pero la ciencia aún no había terminado con él. El 13 de octubre de 1993, Mullis recibió una llamada a las 6:15 a.m. desde Suecia. “Felicitaciones, Dr. Mullis,” dijo la voz. “Me complace poder anunciarle que ha sido galardonado con el Premio Nobel”.

"¡Me lo llevo!" Respondió Mullis.

Si fueras uno de los diez millones de los estadounidenses que sintonizaron con el O.J. Simpson en marzo de 1995, es posible que haya visto a Mullis sentado en la galería. Había sido contratado como testigo experto por la defensa de O.J. para poner en duda las pruebas de ADN de la fiscalía. Normalmente, tener un científico ganador del Premio Nobel en su equipo sería un as en la manga, pero Mullis era más como el bromista en la baraja.

Se había convertido en un vociferante crítico de las ideas científicas ampliamente aceptadas, ridiculizando las nociones de que los CFC causaron el agujero de ozono, que los humanos causaron el cambio climático y que el VIH causó el SIDA. Los científicos de la corriente principal eran corruptos, afirmó, y atraían fondos para su investigación al difundir la paranoia.

"Los científicos podrían ser algo para entretenernos e inventar cosas bonitas para nosotros", escribió Mullis. "No tienen que estar justificando su existencia asustándonos."

Irónicamente, Mullis también cuestionó el análisis de ADN que hizo posible su invención de la PCR, por lo tanto, el interés del equipo legal de Simpson en sus servicios. El problema surgió cuando la fiscalía dejó en claro su plan para socavar la credibilidad de Mullis al citar sus opiniones científicas contrarias y su uso de drogas (todavía incursionaba en el LSD). Diputado D.A. Rockne Harmon pidió al tribunal garantías de que Mullis no estaría drogado con ácido mientras testificaba.

Al final, la defensa decidió no arriesgarse a poner a su testigo Nobel en el estrado, y probablemente fue lo mejor. Mullis escribió que si lo habían hecho, planeaba vengarse de Harmon acusándolo frente al jurado — y al mundo — de un incidente completamente inventado que involucraba a dos niños pequeños en un parque. "Creo que el LSD habría palidecido al lado de los niños jóvenes ficticios", escribió.

Si el O.J. El capítulo de Simpson de la vida posterior al Nobel de Mullis fue extraño, solo estaba en consonancia con el resto. Había renunciado en gran medida a la ciencia profesional y, junto con el surf, se había dedicado a patinar, tocar la guitarra y estudiar astrología. Fue cofundador de una empresa llamada StarGene, que planeaba vender joyas con el ADN de celebridades muertas incrustado en su interior. "No soy un genio 'serio' como Einstein", dijo al Los Angeles Times. "Soy un genio más juguetón".

En 1994, Mullis fue invitado a hablar sobre PCR en la reunión científica anual de la Sociedad Europea de Investigación Clínica. En cambio, aprovechó la oportunidad para impugnar la ciencia detrás de la medicina del SIDA. El presidente de la organización describió más tarde el desempeño de Mullis en una apasionante carta publicada en Naturaleza: “Su charla fue en estilo divagante y en contenido inapropiado para una aparición pública de un líder de la ciencia. ... Sus únicas diapositivas (sobre lo que él llamó su "arte") fueron fotografías que había tomado de mujeres desnudas con luces de colores proyectadas sobre sus cuerpos ". Su discusión sobre el SIDA fue "incoherente e insustancial".

El profesor Randy Schekman lo compara con el hombre de la Casa Blanca. "Es el equivalente en biología molecular de Donald Trump en términos de su
comportamiento."

Sus puntos de vista sobre el sida no solo se veían mal, pueden haber tenido consecuencias mortales. A fines de la década de 1990, Sudáfrica se encontraba en medio de una catastrófica epidemia de SIDA. El presidente Thabo Mbeki, bajo el hechizo de los negacionistas del sida, incluido Mullis, declaró que el sida era causado por la pobreza, no por el VIH. A muchos sudafricanos se les negó el acceso al tratamiento. Un estudio de 2008 publicado en el Revista de síndromes de inmunodeficiencia adquirida estimó que, como resultado, 35.000 bebés nacieron con el VIH y 330.000 sudafricanos murieron de SIDA innecesariamente.

"Nunca lo perdonaré por eso", dice White.

No es inusual que los premios Nobel usen su nueva fama para defender sus causas favoritas. El profesor de biología celular de Berkeley, Randy Schekman, ganó el Nobel en 2013 y utilizó su nuevo púlpito para dar conferencias y escribir artículos de opinión que promuevan la investigación básica, la educación superior pública y las revistas de código abierto. Lo que es inusual es que un laureado use su Nobel para difamar a otros científicos y las instituciones que nutrieron su carrera.

Cuando Mullis ganó el Nobel, Schekman hizo una apuesta con uno de los otros galardonados ese año de que Mullis sería el único ganador del Premio Nobel estadounidense que nunca sería elegido miembro de la Academia Nacional de Ciencias. "Puedo cobrar esa apuesta ahora", dice. "Mullis no calificaría porque no publicó suficientes artículos independientes para siquiera ser considerado".

Schekman, quien dice que el Nobel de Mullis fue una "pura casualidad", lo compara con el hombre de la Casa Blanca. "Es el equivalente en biología molecular de Donald Trump en términos de su comportamiento personal", dice.

El Premio Nobel trajo a Mullis una avalancha de atención de los medios, mientras los reporteros de todo el mundo se apresuraban a obtener una entrevista con el científico loco. La mayoría de los perfiles resultantes describían a Mullis como un narrador caprichoso y encantador, que disfrutaba de lo que él llamaba su "vida de vacaciones". Pero Emily Yoffe, una reportera enviada por don entrevistarlo en persona en La Jolla, pintó un cuadro diferente. Describió a un egoísta grosero con una vena imprudente. "Mullis no tiene conversaciones", escribió, "él sostiene, arrojando opiniones como una ballena limpiando su espiráculo". Ella notó que su refrigerador estaba cubierto de fotos de mujeres parcialmente vestidas con las que había salido. En algún momento durante la entrevista en su apartamento, Mullis la agarró por el cuello y trató de besarla a la fuerza. Ella lo rechazó. Pero lo intentó de nuevo. Y otra vez. Él le preguntó: "¿Cómo puedes decir que me conoces sin dormir conmigo?"

"Kary era tan persistente y tan escandaloso y se puso tan desagradable hacia el final a medida que se emborrachaba más y más", me dijo Yoffe. Por lo general, para un perfil tan importante, planea realizar varias entrevistas con el sujeto. Este no. "Pensé, definitivamente no volveré a estar en una habitación con él".

En don Yoffe escribió que "... el genio y la gentileza no siempre comparten el mismo cromosoma".

UNA NOCHE EN 1985, Mientras Mullis daba un paseo por su propiedad en el condado de Mendocino, se encontró con un mapache resplandeciente.

"Buenas noches, doctor", dijo el mapache.

Lo siguiente que Mullis recordó fue que estaba caminando por una carretera cercana a la luz de la mañana, una brecha de tiempo que atribuyó a la abducción extraterrestre. Él detalló el encuentro en sus memorias, Bailando desnudo en el campo mental.

"Mullis tuvo una gran idea, a la que siguió con años de tergiversación y autopromoción".

En el libro, Mullis también cuenta su versión de la invención de la PCR. Es la historia de un genio solitario que, cuando no perseguía mujeres a través del plano astral, luchó contra los señores corporativos y los gerentes mezquinos y oficiosos para llevar la reacción en cadena de la polimerasa al mundo. Es una historia atractiva, una que Mullis cultivó activamente, dice el antropólogo de Berkeley Paul Rabinow.

"El público quiere ver genios individuales y tal vez existan tales cosas, no lo sé", dice. "[Mullis] se dio cuenta de que este era el tipo de historia que se vendía y sobre la que la gente escribiría historias".

En su propio libro, Haciendo PCR, Una historia etnográfica del desarrollo de la PCR, Rabinow ofrece una descripción más detallada y detallada.

"La búsqueda de ... la verdad científica no es un juego individual", dice Rabinow. “Se necesitan múltiples contribuciones diferentes ... para que algo como esto suceda. Y no le quita ningún crédito a Mullis. Es solo que eso no es lo que es la ciencia ".

Rabinow preguntó a Erlich y Saiki, dos científicos cuyo rigor experimental hizo posible la PCR, cómo se sentían acerca de que Mullis ganara el Nobel. "Me siento mal por no poder sentirme mejor al respecto", dijo Saiki. "Kary tiene sus puntos buenos y malos, el punto es que trabajamos juntos". Erlich dijo: “Mullis tuvo una gran idea, a la que siguió con años de tergiversación y autopromoción. Reescribir la historia fue más productivo que escribir artículos ".

Quizás la mejor manera de recordar a Mullis y su invención de la PCR es hacer un espacio para los otros que lo hicieron realidad.


PCR de ADN genómico: digestión con RE del ADNg antes de la amplificación (14 / Sep / 2005)

Hola,
Quiero amplificar por PCR una región sin codificación del ADN genómico (1,5 kb). Después de varios intentos fallidos para amplificar la región mencionada, decidí realizar una PCR a partir de ADNg digerido con una enzima de restricción que no corta en la secuencia de interés. Creo que la digestión podría de alguna manera hacer del ADNg una plantilla mejor. Quizás el ADN cortado podría ser más accesible a Taq o podría tener menos estructura secundaria o podría desnaturalizarse más fácilmente. No lo sé.

Para asegurarme de que estoy amplificando realmente la secuencia de mi interés, quiero realizar la digestión del ADNg molde con una enzima de restricción que corte dentro del amplicón y luego lo haría mediante PCR. Espero que si mis primers son específicos, no amplificarán esa plantilla.

Por favor, dígame qué piensa al respecto o si tiene otras ideas para ampliar plantillas difíciles.

¿Es el área que desea amplificar GC alta? Esto podría estar causando problemas con la fusión de la plantilla y, en última instancia, con la PCR. Podría intentar agregar betaína o DMSO para ayudar a romper las estructuras secundarias. También encuentro que un arranque en caliente de 10 minutos funciona (agregando el taq después de que hayan transcurrido los 10 minutos). Una vez que obtenga algo de amplificación de su 1,5 kb en la primera ronda, el tiempo de fusión normal (30 segundos - 1 minuto) debería ser suficiente ya que la plantilla es pequeña.

quote = Marvilla, 15 de septiembre de 2005, 14:17]
Hola,
Quiero amplificar por PCR una región no codificante del ADN genómico (1,5 kb). Después de varios intentos fallidos para amplificar la región mencionada, decidí realizar una PCR a partir de ADNg digerido con una enzima de restricción que no corta en la secuencia de interés. Creo que la digestión podría de alguna manera hacer del ADNg una plantilla mejor. Quizás el ADN cortado podría ser más accesible a Taq o podría tener menos estructura secundaria o podría desnaturalizarse más fácilmente. No lo sé.

Para asegurarme de que estoy amplificando realmente la secuencia de mi interés, quiero realizar la digestión del ADNg molde con una enzima de restricción que corte dentro del amplicón y luego lo haría mediante PCR. Espero que si mis primers son específicos, no amplificarán esa plantilla.

Por favor, dígame qué piensa al respecto o si tiene otras ideas para ampliar plantillas difíciles.

¿A qué concentración utiliza DMSO en sus PCR?

Además del DMSO, ¿se utilizan otros agentes en la PCR para superar los problemas con la estructura secundaria? Por favor, dime cómo lo usas (concentración).

Generalmente uso DMSO al 5-10% para PCR a partir de ADN genómico. También debe considerar que la amplificación puede ser muy ineficiente en los primeros ciclos, así que pruebe con 35 ciclos de PCR o vuelva a amplificar su producto (haga 20 ciclos y luego tome parte de eso como plantilla en otra PCR).

La digestión también debería ayudar con la PCR.

¿A qué concentración utiliza DMSO en sus PCR?

Además del DMSO, ¿se utilizan otros agentes en la PCR para superar los problemas con la estructura secundaria? Por favor, dime cómo lo usas (concentración).


Ver el vídeo: How to do Covid 19 Test by Real Time PCR Machine (Febrero 2023).