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¿Las nuevas proteínas que incorporan nuevos aminoácidos desencadenarán una respuesta inmune?

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Este artículo informó que los científicos han logrado agregar dos nuevas bases al cuarteto de A, C, G y T, dando como resultado un aminoácido no canónico. Además, las bacterias en las que se hizo esto pudieron producir nuevas proteínas utilizando las bases recién agregadas. El artículo cita a los científicos diciendo que los aminoácidos adicionales "podrían convertirse en bloques de construcción para nuevos fármacos y materiales novedosos".

Mi pregunta es que si las nuevas proteínas están hechas de aminoácidos que no ocurren naturalmente, ¿no las rechazará el cuerpo?


El mecanismo del cuerpo para detectar objetos extraños tiene un mecanismo de seguridad incorporado que minimiza la probabilidad de malinterpretar un antígeno auto-derivado como extraño.

La tolerancia inmunológica (falta de respuesta) normalmente previene las reacciones contra los autoantígenos; si se rompe la tolerancia inmunológica, pueden ocurrir reacciones autoinmunes. Gran parte del desarrollo de tolerancia se produce en el timo mediante la eliminación (deleción clonal) o inactivación (anergia clonal) de clones de células T autorreactivos. Otros mecanismos de tolerancia ocurren extratímicamente e incluyen la activación de células supresoras T específicas de antígeno y la deleción clonal, que da como resultado la eliminación de células B o células T autorreactivas, y anergia clonal.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7795/

Básicamente, antes de que una célula T comience a buscar posibles antígenos, por lo general pasa un tiempo en el timo siendo examinada contra antígenos que son nativos del cuerpo. Si responde a tal antígeno, la célula T será destruida o desactivada.

Es poco probable que tener aminoácidos no naturales como parte de este proceso cambie su eficacia. Las células T que apuntarían a péptidos con estos aminoácidos no naturales se compararán con las células del cuerpo antes de enviarlas a realizar su trabajo; el mecanismo funcionaría de la misma manera. Sospecho que la tasa de enfermedades autoinmunes no cambiaría en comparación con los organismos normales.


Introducción

Esta pregunta tiene dos componentes. La primera es la cuestión casi retórica de si las proteínas con aminoácidos no naturales serán consideradas por el sistema inmunológico como "no propias". A menos que, por casualidad, el aminoácido no natural se parezca a algún componente macromolecular normal, la respuesta es obviamente que se lo considerará como "no propio".

La segunda pregunta es, en mi opinión, mucho más interesante, pero no parece ser considerada (o se ha dado por sentada) en la respuesta de @Astrolamb. Se trata de si la respuesta inmune provocaría la eliminación de tales proteínas artificiales, si se administraran terapéuticamente. Es importante, en esta coyuntura, enfatizar que Las proteínas que contienen aminoácidos no naturales como resultado de la expansión del código genético no plantean, en principio, ningún problema de 'rechazo' inmunológico que no se haya visto ya en proteínas 'no naturales' que contienen aminoácidos normales.. Por lo tanto, cualquier respuesta inmune debe considerarse como una "proteína no propia" y más que como un "aminoácido no propio".

Como ha habido muchos estudios de este tipo con las últimas proteínas (y con proteínas que contienen aminoácidos no naturales introducidos por modificación química), existen estudios extensos en los que basar una respuesta. Un inmunólogo sería una mejor persona para hacer esto, pero en ausencia de cualquier “respuesta inmune” intentaré una respuesta a partir de mi lectura de la literatura, apoyándome particularmente en:

K. Wals y H. Ovaa “Incorporación de aminoácidos no naturales en E. coli: aplicaciones actuales y futuras en el diseño de proteínas terapéuticas” Parte delantera. Chem 2, 1-12 (2014)

y

B. Líder et al. "Terapéutica de proteínas: resumen y clasificación farmacológica" Nature Reviews Descubrimiento de medicamentos 7, 21-39 (2008)

Agradezco los comentarios que sugieran mejoras o correcciones.

Resumen

La pregunta pregunta:

"Si las nuevas proteínas están hechas de aminoácidos que no ocurren naturalmente, ¿no las rechazará el cuerpo?"

lo que entiendo que significa:

"Si las nuevas proteínas están hechas de aminoácidos que no ocurren naturalmente, ¿no inducirán una respuesta inmune que las hará ineficaces?"

La breve respuesta a esto es:

  1. Depende: la inmunogenicidad de las proteínas extrañas varía.
  2. Incluso si se provoca una respuesta inmune, esto no necesariamente hará que tales proteínas sean ineficaces.
  3. En algunos casos, la intención terapéutica es en realidad provocar una respuesta inmunitaria, es decir, producir una proteína débilmente inmunogénica más.

Las proteínas extrañas varían en inmunogenicidad

El quid de la respuesta a esta pregunta radica en lo siguiente:

El hecho de que una proteína utilizada con fines terapéuticos difiera de las de un sujeto humano no en sí mismo significa que invocará una respuesta inmune.

Consideremos dos ejemplos para ilustrar esto.

El primero es el caso de la insulina porcina, que se ha administrado a pacientes durante muchos años, pero tiene un aminoácido diferente a la insulina humana. Con respecto a esta insulina no humana, esta revisión establece que “las complicaciones inmunológicas graves ocurren raramente, y los eventos menos graves afectan a una pequeña minoría de pacientes”.

El segundo ejemplo está tomado de un trabajo más reciente de D-A. Silva et al. en el diseño de proteínas artificiales. (Véase también el resumen de Nature News & Views). Diseñaron imitaciones de las citocinas, interleucina-2 e interleucina-5, que tenían grandes diferencias en la organización de la hélice y la secuencia de aminoácidos de las proteínas nativas. Sin embargo, informaron que "la inmunogenicidad contra las proteínas diseñadas de novo parece ser baja".

Resulta que una amplia variedad de factores afectan la inmunogenicidad de las macromoléculas extrañas, de modo que incluso si una proteína terapéutica provoca una respuesta inmune, puede ser lo suficientemente débil como para permitir que se produzca la acción terapéutica. En el trabajo que acabo de citar, Silva et al. sugieren que la razón de la baja inmunogenicidad podría ser "el pequeño tamaño y la alta estabilidad" de las proteínas sobre la base del trabajo previo que habían realizado con 20.000 miniproteínas.

Es cierto que en algunos casos se producirá una fuerte respuesta inmune y obviamente puede ser un problema, por lo que es necesario tomar medidas para reducir la inmunogenicidad. Esto es ampliamente reconocido y discutido en el siguiente documento:

V. Brinks et al. "Inmunogenicidad de proteínas terapéuticas: el uso de modelos animales" Pharm Res (2011) 28:2379-2385

A veces, la modificación química de las proteínas puede reducir su inmunogenicidad, como es el caso del polietilenglicol en relación con el interferón (B. Leader et al. revisión, citada anteriormente).

Uso de proteínas terapéuticas para provocar una respuesta inmune

Un uso previsto para las proteínas modificadas es la inmunoterapia contra el cáncer. En resumen, el objetivo es intentar que el organismo genere una respuesta inmunitaria contra las células cancerosas, que pueden presentar antígenos tumorales "extraños". Sin embargo, en muchos casos estas diferencias con las células normales no son suficientes para provocar una respuesta inmune adecuada. Se ha demostrado que la modificación de la proteína de unión al retinol mediante la introducción de un aminoácido no natural puede ayudar a superar la autotolerancia a los tumores en ratones, lo que sugiere un posible uso en la inmunoterapia del cáncer (J. Grünewald et al. "Estudios mecanicistas de la terminación inmunoquímica de la auto-tolerancia con aminoácidos no naturales" PNAS (2009) 106, 4337-4342).

Conclusión

Las proteínas que contienen aminoácidos no naturales como resultado de la expansión del código genético no plantean, en principio, ningún problema de "rechazo" inmunológico que no se haya visto ya en proteínas "no naturales" que contienen aminoácidos normales o aminoácidos modificados químicamente. El problema de la inmunogenicidad potencial está ampliamente reconocido y ha sido ampliamente estudiado por aquellos que desean desarrollar el considerable potencial terapéutico de todas estas proteínas.


¿Podría un extremófilo tener el secreto del tratamiento de heridas devastadoras?

Una ilustración de un tardígrado, que es capaz de resistir la deshidratación y la radiación cósmica. Crédito: iStock / Eraxion

Oso de agua. Lechón musgo. Tardígrado

Las suaves características de osito de peluche de este animal polonímico desmienten su naturaleza resistente.

Capaz de resistir la deshidratación y la radiación cósmica y sobrevivir a temperaturas tan bajas como -450 grados F y tan altas como 300 grados F, esta criatura microscópica de ocho miembros tiene la clave de uno de los mayores secretos de la biología: la supervivencia extrema.

Los tardígrados han cautivado la imaginación de los astrobiólogos (varios miembros del clan han viajado al espacio como parte de experimentos de investigación) y han seducido las fantasías de los fanáticos de la ciencia ficción como una criatura alienígena gigante en Star Trek: Descubrimiento.

Ahora los científicos de la Escuela de Medicina de Harvard (HMS) se preguntan: ¿Puede la fisiología de este extremófilo aportar conocimientos que puedan aplicarse a los humanos?

Inspirado en la naturaleza, optimizado en el laboratorio

El grupo HMS, que trabaja con colegas de la Universidad de Washington, Seattle y el MIT, espera responder a esta misma pregunta en un nuevo y ambicioso proyecto destinado a descifrar la estructura y función de varias proteínas tardígradas que se sospecha que desempeñan un papel en la resiliencia del organismo. , y luego usar estas proteínas como base para terapias humanas que detienen el daño tisular y previenen la muerte celular.

El objetivo del equipo es diseñar una versión optimizada de estas proteínas y usarlas para ralentizar la actividad metabólica en las células lesionadas, el equivalente biológico de presionar el botón de pausa en los procesos celulares, incluida la inflamación que causa daño, la infección y, en última instancia, la desaparición celular.

El objetivo final del equipo es desarrollar una terapia basada en proteínas que pueda detener el daño tisular en lesiones traumáticas, ataques cardíacos, accidentes cerebrovasculares y sepsis, entre otras afecciones.

"Realmente comenzó como una idea loca y de alto riesgo", dijo Pamela Silver, co-investigadora principal del proyecto y profesora de biología de sistemas en el Instituto Blavatnik del HMS y miembro del Instituto Harvard Wyss en Harvard.

En la primavera de 2018, Silver se encontró con un desafío de subvención publicado por el ejército de los EE. UU. Que buscaba soluciones novedosas para estabilizar las lesiones traumáticas en las zonas de combate. Sabía de quién elegir el cerebro.

Roger Chang, bioinformático y biólogo molecular en el laboratorio de Silver, ha estado fascinado durante mucho tiempo con la resistencia a las proteínas, estudiando, entre otras cosas, el papel de las proteínas en el estrés térmico y protegiendo a las células bacterianas de la radiación gamma. No hace mucho, Chang había visto un estudio que mostraba que cuando se introducen proteínas tardígradas en E. coli y levadura, hacen que los organismos sean inusualmente tolerantes a la desecación.

¿Y si estos procesos pudieran replicarse en células humanas ?, se preguntó Chang. La proteína tardígrada de tipo salvaje mostró solo un efecto protector modesto en E. coli y levadura, pero ¿y si estas proteínas pudieran hacerse más potentes en el laboratorio? Preguntó Chang.

"Comencé a concebir cómo podríamos mejorar las materias 'primas' de la naturaleza y funcionalizarlas para uso humano", dijo Chang.

La belleza del desorden

¿Qué permite a los tardígrados sobrevivir en condiciones que matarían a la mayoría de los demás organismos? Los mecanismos precisos detrás de su capacidad para someterse a una criptobiosis autoconservadora siguen siendo poco conocidos. Sin embargo, la evidencia sugiere que cuando se somete a este proceso, despliega una serie de bioquímicos, incluidas proteínas y moléculas de azúcar, que protegen a los ácidos nucleicos y las proteínas dentro de las células del daño.

Las proteínas en cuestión pertenecen a una clase conocida como proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP). La característica más llamativa de los desplazados internos, que da nombre a la clase, es la falta de una estructura ordenada y ordenada que se pueda visualizar fácilmente en los estudios de imágenes en 3D.

Los tardígrados no son, de ninguna manera, los únicos animales que presentan la presencia de desplazados internos. Estas proteínas son casi omnipresentes en todas las especies, incluidos los humanos. Los tardígrados tampoco son los únicos organismos capaces de sobrevivir a un estrés extremo. Otros extremófilos conocidos incluyen ciertos nematodos, camarones de salmuera y la planta de la resurrección de nombre poético, que puede sobrevivir a la deshidratación durante años y volver a florecer a las pocas horas de haber sido regada.

Los biólogos han sido conscientes de la existencia de proteínas desordenadas durante décadas, pero las descartaron durante mucho tiempo como intrascendentes. Los desplazados internos son tan poco conocidos que todavía no existe un consenso claro sobre lo que los constituye. De hecho, en su mayor parte, sus funciones siguen siendo desconocidas. Lo que los científicos saben es que no todas las proteínas desordenadas son capaces de ralentizar la actividad celular. Mapear su estructura sigue siendo un problema fundamental, un desafío que deja a los científicos preguntándose cuáles de estas proteínas están realmente desordenadas y cuáles simplemente no son susceptibles de las técnicas actuales de mapeo de estructuras.

Diseñar cualquier proteína es un desafío formidable, no muy diferente al diseño de un automóvil. Diseñar una proteína desordenada es similar a crear el plano de un avión.

Silver y Chang sabían que era hora de llamar a Debora Marks, matemática y bióloga computacional del Instituto Blavatnik en HMS con un gran interés en los desplazados internos y experiencia en el modelado informático predictivo.

Sería una tarea abrumadora. Sin embargo, combinar la experiencia de Silver en biología sintética con la destreza de Marks en el aprendizaje automático y la computación pondría esto dentro del ámbito de lo posible.

Proteínas diseñadas por computadora

Hace tan solo 10 años, los biólogos sintéticos se acercaban al desarrollo de proteínas mediante la fuerza bruta: diseño de prueba y error seguido de pruebas en una larga, aparentemente interminable, serie de experimentos para llegar a la receta correcta. Hoy en día, los avances en biología computacional y aprendizaje automático están haciendo que el proceso sea más enfocado y eficiente.

Una proteína es una cadena de aminoácidos, cuya secuencia determina la forma de la proteína. La forma, a su vez, dicta la función y el papel de la proteína: lo que puede y no puede hacer. El número de posibles combinaciones de aminoácidos es infinito, entonces, ¿cómo se elige la secuencia correcta para producir una proteína que realiza un conjunto predeterminado de tareas biológicas?

Marks, el otro co-investigador principal del proyecto, encabezará el diseño computacional de los desplazados internos sintéticos adecuados para su uso en células humanas. Lo que esto implica, explica Marks, es descubrir qué características de las secuencias de aminoácidos de una proteína le permitirían ralentizar las funciones biológicas de una célula y hacerlo de forma reversible. La tarea requeriría el uso de modelos probabilísticos por computadora para construir una proteína que sea segura y funcional en humanos. Un requisito previo crítico para su uso en humanos sería garantizar que la proteína pueda eludir las defensas inmunitarias del cuerpo. En otras palabras, la proteína candidata no debería desencadenar una respuesta de anticuerpos en los tejidos humanos y provocar un ataque por parte del sistema inmunológico del huésped. Para optimizar las características de diseño de la proteína, Marks colaborará con David Baker en la Universidad de Washington para predecir cómo interactuaría la proteína con decenas de miles de componentes celulares cuando se introduzcan dentro de las células humanas.

En lugar de probar infinitas posibilidades, este diseño predictivo tiene como objetivo, dijo Marks. Es una prueba previa informada de un número finito y, con suerte, pequeño de posibles combinaciones de aminoácidos.

"Este no es un enfoque de caja negra en el que incluimos todas las combinaciones posibles y ponemos un montón de funciones y vemos qué se pega", dijo Marks. "Es una forma de aprendizaje automático no supervisado que no presume un resultado. El universo de posibles secuencias de proteínas es infinito, por lo que queremos ser dirigidos y seleccionados".

El equipo comenzará probando las proteínas candidatas en células humanas derivadas de varios tejidos: células musculares, vasculares, cardíacas, nerviosas, etc. Luego probarán la proteína en organoides humanos y, finalmente, en animales. Sería posible dirigir con precisión la proteína a tipos específicos de células, tejidos y órganos, dijo Silver.

"Hemos estudiado la selección de proteínas durante años y tenemos un truco que hemos desarrollado sobre cómo ubicar una proteína en objetivos específicos, pero no en otros", dijo Silver.

La forma en que se administrará la proteína que detiene el daño dentro de las células será uno de los desafíos fundamentales de este proyecto. Si se resuelve, proporcionaría una solución a un gran obstáculo en el desarrollo farmacéutico.

"Esperamos poder encontrar algunos nuevos puntos de entrada en la célula para administrar la proteína", dijo Silver.

Si tiene éxito, tal plantilla podría adaptarse para desarrollar otras proteínas.

"La visión es tener un banco de pruebas donde podamos implementar muchos estilos diferentes de estas proteínas y descubrir cuáles son las mejores", dijo Silver. "El sueño final sería diseñar proteínas totalmente nuevas, nunca antes vistas. El trabajo puede convertirse en una nueva plataforma para diseñar proteínas".

Más allá del campo de batalla

En diciembre de 2018, el equipo recibió un acuerdo de cooperación de cinco años por un valor de hasta $ 14.8 millones de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) para perseguir la idea.

La aplicación inicial de los compuestos a base de proteínas sería detener el sangrado y la necrosis tisular en lesiones traumáticas. El uso de un compuesto que detiene la muerte celular permitiría el transporte y el tratamiento al tiempo que evitaría el daño tisular diseminado, la infección y la muerte celular que se produce cuando se retrasa el tratamiento de tales lesiones.

Pero el objetivo a largo plazo, y mucho más ambicioso, es extender el beneficio terapéutico de tales compuestos mucho más allá del campo de batalla, dijo Silver.

Dos condiciones que pueden beneficiarse de este enfoque son los ataques cardíacos y los accidentes cerebrovasculares.

En el caso de los ataques cardíacos, por ejemplo, incluso cuando los pacientes son tratados con relativa rapidez, el infarto de miocardio ya ha destruido las células del músculo cardíaco carente de oxígeno. Cuanto mayor sea la demora, más extenso será el daño y mayor será el radio de muerte del tejido. El adagio "el tiempo es músculo" se refiere a la noción de que incluso los pequeños retrasos en el tratamiento pueden causar una pérdida muscular irreversible, que a su vez conduce a un daño cardíaco a largo plazo, la eventual pérdida de la función del músculo cardíaco, insuficiencia cardíaca y, en casos extremos, muerte.

Lo mismo ocurre con las agresiones cerebrales, como accidentes cerebrovasculares o lesiones traumáticas, en las que el daño a un área diminuta del cerebro puede extenderse y afectar las células nerviosas circundantes. Si las personas que sufren un ataque cardíaco o un derrame cerebral pudieran ser tratadas con agentes derivados de proteínas que pausan de manera efectiva el daño continuo hasta que los pacientes sean transportados al hospital, sus resultados podrían mejorar dramáticamente. Dicho tratamiento sería particularmente útil para las lesiones que ocurren en áreas geográficamente aisladas donde no se dispone de atención de emergencia o traumatología especializada.

Un compuesto de biopausa también podría permitir la conservación sin refrigeración de medicamentos a base de proteínas, lo que permitiría un transporte más fácil y económico, dijo el equipo. Otro posible uso sería la crioconservación más eficaz de óvulos para la fertilización in vitro. Las técnicas actuales de conservación de ovocitos implican la congelación profunda clásica (criopreservación) y un enfoque más nuevo llamado vitrificación, un proceso que coloca los tejidos en un estado cristalizado inducido químicamente. La vitrificación requiere el uso de varios productos químicos, incluido el etilenglicol, el ingrediente activo del anticongelante. Si bien la vitrificación aumenta la viabilidad de los óvulos, aún faltan datos sobre los resultados a largo plazo para la descendencia.

"Un producto biológico que está diseñado para evitar la toxicidad basado en un diseño que aprovecha millones de años de evolución para conferir protección celular no solo es más seguro, sino que también puede ofrecer una viabilidad mejorada del huevo sobre la tecnología existente", dijo Chang. Existe un potencial similar para la preservación de órganos para trasplantes y podría complementar las técnicas emergentes para la preservación de todo el cuerpo, agregó.

Los compuestos criptobióticos también podrían mejorar los esfuerzos de investigación al permitir a los científicos realizar un silenciamiento dirigido de proteínas o tipos de células específicos durante los experimentos. Por ejemplo, si un investigador busca determinar si la proteína A es sensible a un fármaco experimental, podría usar un compuesto basado en IDP para desactivar la proteína en cuestión y luego medir cómo responde la célula a un fármaco dado en ausencia de la proteína silenciada.

Aunque suena a ciencia ficción, el concepto tiene un elegante sentido evolutivo. Después de todo, los esfuerzos del equipo se basan en la adaptación de recetas biológicas preexistentes probadas durante decenas de millones de años de evolución.

"Lo que hacemos como biólogos sintéticos es mirar la naturaleza", dijo Silver. "Luego preguntamos qué podemos sacar de él y usarlo como plataforma para resolver un problema".

"Si alguien te lo dijera, tomemos un organismo multicelular, un animal o un ser humano, y cambiemos su metabolismo para que pueda soportar grandes cantidades de estrés (calor, frío, deshidratación) y luego revivírselo, diría usted. eso es solo ciencia ficción, ¿no crees? " Dijo Marks. "Pero el hecho es que la vida real ya lo ha hecho".


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Mark Looney, M.D.

Medicina pulmonar y de cuidados intensivos, lesión pulmonar aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda, transfusiones de sangre, lesión pulmonar aguda relacionada con transfusiones, neutrófilos, trampas extracelulares de neutrófilos, plaquetas, trasplante de pulmón

Mi laboratorio es muy interesante en el estudio de la biología inmune innata en el pulmón normal y lesionado. Utilizando modelos preclínicos de lesión pulmonar aguda, nos hemos centrado en los neutrófilos y las plaquetas, siendo estas últimas una célula inmune buena con un potente potencial inflamatorio. Una consecuencia de las interacciones plaquetas-neutrófilos es la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET), que estudiamos en modelos de lesión pulmonar estériles e inducidos por patógenos. Estamos determinando los mecanismos por los cuales las plaquetas desencadenan los TNE y nuevas vías para apuntar a los TNE, que hemos descubierto que son una barrera general disruptiva en el pulmón.

También utilizamos microscopía pulmonar intravital de dos fotones como herramienta para el descubrimiento. Usando esta técnica, hemos determinado que el pulmón es una fuente importante de producción de plaquetas maduras en ratones. Además, los megacariocitos residen en el pulmón extravascular y pueden tener potentes efectos inmunitarios locales. El pulmón también contiene una amplia gama de progenitores hematopoyéticos, que tienen la capacidad de salir del pulmón e injertarse en la médula ósea para la producción de sangre de múltiples linajes. Estamos determinando los factores promotores de nicho responsables de la residencia del progenitor hematopoyético en el pulmón y las contribuciones de estas células al repertorio inmunológico local.

Tenemos un interés cada vez mayor en los estudios de trasplante de pulmón, incluida la lesión por isquemia-reperfusión (disfunción primaria del injerto) y el modelado de la disfunción crónica del aloinjerto pulmonar (bronquiolitis obliterante). Usamos la técnica de trasplante de un solo pulmón de ratón para estos estudios y para crear quimeras pulmonares para la investigación.


Anticuerpo & # x0201c Inmunogenicidad & # x0201d puede reflejar la homeostasis

Parece contradictorio que los anticuerpos derivados de la secuencia completamente humana provoquen respuestas inmunitarias en los seres humanos. Las inmunoglobulinas se encuentran en cantidades de mg / ml en suero e inician la expresión muy temprano en la ontogenia, cuando la tolerancia a las proteínas propias está impresa en el sistema inmunológico naciente. 52 Los linfocitos T CD4 + se toleran o eliminan en el timo durante el desarrollo, y se anergizan y eliminan en la periferia al entrar en contacto con el antígeno expresado de manera inapropiada. 53, 54 Múltiples subconjuntos diferenciales de células T reguladoras controlan las respuestas inapropiadas al antígeno en la periferia. 55, 56 Las células B son toleradas por mecanismos delecionales y anergísticos durante el desarrollo, pero también pueden rescatarse a sí mismas mediante un proceso de edición de receptores. 57 La edición del receptor es el proceso de desarrollo en el que las células B pueden reorganizar sus segmentos de la región V por segunda vez, alterando así la especificidad para evitar la deleción. 58, 59 Sin embargo, a pesar de estos mecanismos, el suero humano de donantes normales no enfermos contiene niveles detectables de anticuerpos anti-idiotipo contra una amplia variedad de autoanticuerpos. 60 & # x02013 65 Los anticuerpos anti-idiotipo son similares a los anticuerpos anti-fármaco contra mAb terapéuticos, es decir, son anticuerpos con especificidad para la región V única de otras moléculas de inmunoglobulina. La presencia de autoanticuerpos indica que el sistema de tolerancia no es perfecto y de hecho, la polirreactividad a los autoantígenos reaparece durante la hipermutación somática que tiene lugar durante una respuesta inmune. 66 Los anticuerpos anti-idiotipo específicos para los anticuerpos polirreactivos potencialmente problemáticos que surgen recientemente pueden representar un mecanismo adicional para asegurar la tolerancia a las proteínas propias. De hecho, para ciertas enfermedades autoinmunes, estos anticuerpos antiidiotípicos IgG pueden ser protectores ya que la ausencia de una respuesta antiidiotípica se correlaciona con la presencia de enfermedad en la diabetes de tipo I. 62 La presencia de anticuerpos anti-idiotipo es un mecanismo propuesto para la eficacia de la IgIV en tantas enfermedades autoinmunes diferentes. 64, 65 Por lo tanto, montar una respuesta inmune mediada por anticuerpos dirigida a los sitios de combinación de otros anticuerpos probablemente sea un evento normal, no patógeno. 67, 68

Si las células auxiliares T CD4 + específicas de anticuerpos pueden activarse en donantes normales, incluso en condiciones de estado estacionario que conducen a anticuerpos anti-autoinmunes no patógenos, entonces no debería sorprender que la administración de grandes cantidades de anticuerpos con una sola especificidad podría inducir respuestas de IgG neutralizadoras de anti-idiotipo en algunos pacientes. Este efecto sería especialmente pronunciado si el anticuerpo lleva consigo un epítopo de células T auxiliares CD4 + presentable por las moléculas de HLA de clase II de los pacientes en su región V. Estos tipos de respuestas inmunes a los anticuerpos terapéuticos son los más preocupantes, ya que tienden a no disminuir con el tiempo y pueden afectar la eficacia y asociarse con problemas farmacocinéticos y de seguridad. 69, 70 Solo cuando los autoanticuerpos, o las respuestas de anticuerpos antiterapéuticos, inducen secuelas clínicas, prestamos atención.


Discusión

Anteriormente hemos demostrado que la deleción del gen SARS-CoV E conduce a un virus atenuado que es un candidato a vacuna prometedor [30-34]. Sin embargo, dado que la seguridad y la estabilidad son las principales preocupaciones de los candidatos a vacunas vivas atenuadas, nos centramos en la estabilidad de rSARS-CoV-∆E in vitro y en vivo y en la generación de una vacuna candidata segura mediante la identificación de los mecanismos de reversión a la virulencia.

Inesperadamente, el paso en serie de rSARS-CoV-∆E en cultivo celular dio como resultado la generación de proteínas quiméricas compuestas por una duplicación parcial del gen de la membrana fusionado a una parte de la secuencia líder. Nuestros resultados están de acuerdo con un MHV recombinante que carece de la proteína E (rMHV-∆E) que era viable pero su replicación se vio drásticamente afectada [60]. El rMHV-∆E se replicó a títulos 10.000 veces más bajos que el virus parental y, sorprendentemente, evolucionó de manera similar al SARS-CoV-∆E después de pases seriados en células de cultivo de tejidos [61]. A pesar de que la generación de una proteína quimérica se observó previamente en MHV cuando se eliminó el gen E [61], la presencia de un motivo PBM dentro de la secuencia quimérica insertada y su función principal en proporcionar estabilidad genética al SARS-CoV-ΔE durante el pase se describe en este manuscrito, no se notaron previamente. La alteración del genoma del coronavirus no fue inesperada debido a la alta frecuencia de recombinación y mutación de ARN descrita para estos virus, tanto en cultivos celulares como en animales [37, 62-64].

Se expresaron todas las proteínas quiméricas del SARS-CoV M generadas en el cultivo celular, lo que intensificó el crecimiento del virus en el cultivo celular en comparación con rSARS-CoV-∆E. De manera similar, el rMHV-∆E que contenía proteínas quiméricas también mostró aumentos significativos en los rendimientos virales [61, 65]. Por el contrario, los ratones infectados con rSARS-CoV que contienen proteínas quiméricas generadas en cultivo celular mostraron una disminución en los títulos virales en los pulmones de los ratones infectados incluso en comparación con el virus rSARS-CoV-∆E. De manera similar, el paso extenso en cultivo celular de otros CoV, incluido el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) y el virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV), condujo a cepas menos patógenas en comparación con los virus de tipo salvaje, posiblemente debido a la aparición de mutantes por deleción que perdieron la secuencia. dominio no necesario para su crecimiento en cultivo celular, pero que influyó en su tropismo y en vivo replicación [66-68]. Las proteínas quiméricas que contienen un PBM insertado en el genoma viral después del pase aumentaron la aptitud viral en cultivo celular de una manera específica de tejido, es decir, la proteína quimérica insertada en el genoma viral durante el pase en células de mono promovió el crecimiento del virus en células de esta especie, mientras que el insertado durante el paso en células murinas aumentó específicamente la aptitud del virus en células de ratones. Además, estas proteínas quiméricas no mejoraron el crecimiento viral ni la virulencia. en vivo. Estos datos indicaron que la inserción de proteínas quiméricas adaptó específicamente el virus para un crecimiento óptimo en cultivo celular pero no mejoró en vivo crecimiento ni virulencia. En este contexto, también es importante señalar que la actividad de los PBM depende de su secuencia específica, y también del contexto de secuencia en el que se insertan [27, 28, 69, 70].

El paso en serie de rSARS-CoV-∆E en ratones introdujo una duplicación parcial de 45 nucleótidos en la proteína 8a, lo que resultó en su reversión a un fenotipo virulento. Este fenotipo se asoció a su capacidad para activar p38 MAPK ya la inducción de la expresión de citocinas inflamatorias y aumento del daño pulmonar, como se describió previamente [24, 71].

La proteína 8a es una proteína transmembrana corta compuesta por 39 aminoácidos que forma canales iónicos selectivos de cationes [72]. Las variantes del SARS-CoV con deleciones en el ORF 8a se han transmitido y mantenido en humanos en las últimas fases de la epidemia del SARS-CoV [73, 74]. Curiosamente, una proteína mutante 8a generada durante el paso del virus en vivo contenía un nuevo potencial PBM (CTTV) localizado en la región interna del dominio carboxi-terminal de la proteína (Fig. 5). A pesar de que la secuencia de CTVV ya estaba presente en la proteína 8a original, lo más probable es que no represente una PBM funcional, ya que se encuentra dentro del dominio transmembrana de la proteína 8a. Los PBM activos se localizan en general en las regiones expuestas de las proteínas, habitualmente en el extremo del extremo carboxi-terminal o, excepcionalmente, en posiciones internas dentro del dominio carboxi-terminal, permitiendo su interacción con los dominios PDZ, como se ha observado en el Proteínas NS5 del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV) y el virus del dengue [75, 76]. Sin embargo, las PBM que forman parte de un dominio transmembrana no son accesibles a las proteínas que contienen PDZ y no se han descrito [29]. Por lo tanto, la nueva secuencia de CTVV colocada en un ambiente expuesto puede constituir un PBM nuevo y activo. La inserción de PBM dentro de la proteína 8a después de pasar en vivo Podría deberse al hecho de que el ORF8 es una de las regiones donde se observaron más variaciones entre los aislados humanos y animales de SARS-CoV [4]. De hecho, una secuencia completa del genoma de coronavirus similares al SARS en aislados de murciélagos mostró la presencia de un PBM dentro del ORF8 [5]. Como se mencionó anteriormente, las especies de murciélagos son un anfitrión natural de coronavirus estrechamente relacionados con los responsables del brote de SARS.

Los dominios PDZ se encuentran entre los módulos implicados con mayor frecuencia en las interacciones proteína-proteína que se encuentran en todos los metazoos [69]. In the human genome, there are more than 900 PDZ domains in at least 400 different proteins [77]. Many pathogenic viruses produce PDZ ligands that disrupt host protein complexes for their own benefit, such as hepatitis B virus, influenza virus, rabies virus and human immunodeficiency virus, influencing their replication, dissemination in the host, transmission and virulence [29]. Generation of new proteins containing a PBM after passaging in cell culture and in mice may affect their interaction with a wide range of cellular PDZ-containing proteins, affecting diverse biological functions with high relevance in pathogenesis. E protein PBM participates in two different and independent issues, virus stability and virulence. Our data suggest that when the PBM was present in a proper environment at the end of the E protein, either a native or a mutant protein, viruses remained stable. An independent observation is that the presence of a PBM within E protein confers pathogenicity to the virus [24]. This virulence is prevented either by PBM removal [24] or by the introduction of small deletions within the carboxy-terminus of E protein [53], which by themselves may cause attenuation or, alternatively, by indirectly affecting the PBM. Our results highlighted the critical requirement of viral proteins containing a PBM in the generation of CoVs with virulent phenotypes, and opened up new approaches for the rational design of genetically stable vaccines.

Maintaining the attenuated phenotype of the vaccine candidate after passage in vitro was crucial to avoid the reversion to a virulent phenotype during the design and production of a genetically stable vaccine candidate. To this end, the identification of the relevance of the presence of a functional PBM motif at the carboxy-terminus of a transmembrane protein of the virus has been instrumental in the development of a stable SARS-CoV vaccine candidate. To minimize the risk of regain of virulence after passage, we engineered viruses with small deletions in E gene, instead of deletion of the entire E gene. By preserving the PBM, we observed no evidence for the development of chimeric proteins and thus no gain in virulence. As additional measures to ensure safety of this live attenuated vaccine candidate, we incorporated attenuating mutations into nsp1, in the context of the rSARS-CoV-ΔE or EΔ3. Nsp1 was chosen as a second attenuation target because this gene is located at a distant site (>20 kb) from that of the E gene in the viral genome, making it very unlikely that a single recombination event with a circulating wt coronavirus could result in the restoration of a virulent phenotype.

To analyze the role of SARS-CoV nsp1 in the pathogenesis of the virus, recombinant viruses encoding four different small deletions were generated. Deletion of amino acids 121–129 and 154–165, in the carboxy terminal region of nsp1 led to virus attenuation, indicating that nsp1 enhanced virus pathogenicity, as was previously shown for MHV [45, 48, 49]. Interestingly, these attenuated mutants grew in mice to lower titers than rSARS-CoV, probably by inducing higher IFN responses, indicating that these regions of nsp1 are critical for IFN antagonism. The induction of a higher innate immune response by the nsp1 deletion is most probably responsible for the decrease in SARS-CoV-nsp1* virus titers observed in mice and, to a lesser extent, in DBT-mACE–2 cells. In fact, a rSARS-CoV lacking the nsp1 protein grew poorly in IFN competent cells, but replicated as efficiently as the wt virus in IFN deficient cells [46], consistent with our findings. Similarly, titers of MHV deleted in nsp1 are restored almost to wild type levels in type I IFN receptor-deficient mice [48].

Immunization with singly deleted rSARS-CoV protected mice against challenge with rSARS-CoV, as it was previously shown with MHV nsp1-deletion mutants [48, 49]. SARS-CoV-nsp1ΔD-EΔ3, which contained deletions in nsp1 and E protein, maintained its attenuated phenotype after passage in Vero E6 cells and in mice. In addition, immunization with this double mutant fully protected mice from challenge with the parental virulent virus, indicating that it is a promising vaccine candidate in terms of both stability and efficacy.

Both humoral and cellular responses are relevant to protect from SARS [18, 19, 78, 79]. The viruses generated in this work express all viral proteins, except for small regions deleted in the E and nsp1 proteins, therefore have the potential of inducing both antibody and T cell responses, making this type of live vaccine more attractive than subunit or non replicating virus vaccines. Understanding of the molecular mechanisms by which an attenuated SARS-CoV reverted to a virulent phenotype could also be applied to the development of other relevant CoVs vaccines, such as MERS-CoV.


The Feasibility of Genetic Engineering to Produce More Potent Lantibiotics

RiPPs Recombinant Expression for Classical Engineering—Nisin as an Example

A wide range of technologies are at our disposal for producing a peptide such as chemical synthesis, recombinant DNA technologies, and in vitro translation systems. The choice of a strategy for gene-encoded peptide production is largely determined by their size and chemical complexity. Peptides with sophisticated PTMs-generated structures such as RiPPs are preferably produced biosynthetically using host expression cells. Host cells with installed and functional PTM enzymes should be able to express RiPPs in an intact active form with distinctive architecture dominated by lanthionine bridges. In this context, the absence of a widely used large-scale production platform for lantibiotics with consistent quality is one of the main drawbacks of their therapeutic application.

There are generally two options for recombinant expression of lantibiotics, homologous or heterologous expression systems. Homologous expression strategies have limited use in particular due to the difficulty of cultivating the original producers (Maffioli et al., 2015 Mohr et al., 2015) and/or the difficulty of lantibiotics expression induction under laboratory conditions (Wescombe et al., 2011 Garg et al., 2012). Conversely, heterologous biosynthesis with host cells such as Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, y E. coli are normally preferred and, in many cases, well established. So far, several genetically manipulatable Streptomyces strains, including Streptomyces lividans (Ahmed et al., 2020), S. albus (Myronovskyi et al., 2018), S. coelicolor M145 (Gomez-Escribano and Bibb, 2011), S. venezuelae ATCC 15439 (Kim et al., 2015), S. avermitilis (Komatsu et al., 2010) have been reported to synthesize natural products from genetically engineered biosynthetic gene clusters. Sin embargo, Escherichia coli is still the most common and attractive option. A list of successful examples of recombinant expression of different RiPPs families in heterologous hosts such as E. coli y Streptomyces strains were recently compiled by Zhang and colleagues (Zhang et al., 2018). Heterologous production of lantibiotics is generally conducted as inactive form of the antimicrobial peptide (pre-lantibiotic) to prevent any detrimental effects on host cell growth and viability.

In addition, there is great interest to express lantibiotics in microbial host that should facilitate a straightforward and efficient engineering (Kuipers et al., 1996). Numerous conventional protein engineering approaches such as site-directed mutagenesis, directed evolution and various computational tools aid synthetic biologists and biochemists to selectively diversify the properties of expressed therapeutic peptides. These include manipulations of thermodynamic stability, increased bioavailability, reduced aggregation or enhanced specificity and proteolytic stability (Adhikari et al., 2019). In addition, the implementation of in vitro y en vivo approaches in combination with genome mining data and high-throughput screening strategies has opened up unprecedented opportunities to modify and even improve antimicrobial activity, manipulate the physicochemical properties and widening of the antibacterial spectrum in the production of lantibiotics (Field et al., 2015). Recently an attempt to design and biosynthesize a two-lipid II binding motifs-containing lantibiotic, called TL19, is the latest example showing 64-fold stronger activity against Enterococcus faecium than nisin (Zhao et al., 2020).

The potential of classical protein engineering in complex RiPPs is perhaps best illustrated by recombinant nisin, well known for its broad-spectrum antibacterial activity produced in certain strains of L. lactis (Lubelski et al., 2008). Nisin as the most widely used lantibiotic in the food industry over the past 50 years has undergone various methods of bioengineering with an aim to improving its function and/or physicochemical features (Shin et al., 2016). To expand the scope of its activity, several bioengineered variants of nisin have been generated by site-directed mutagenesis and by classical chemical modifications (Ross et al., 2012), including in vitro chemical synthesis (Knerr and van der Donk, 2012 Koopmans et al., 2015). For example, the use of the saturation mutagenesis approach has led to the production of nisin S29 derivatives with increased activity against a number of Gram-positive antibiotic-resistant pathogens. In addition, the increased antimicrobial activity was generated in comparison to the wild type nisin A when tested against Gram-negative food-borne pathogens (Field et al., 2012). Moreover, recombinant production of the nisin Z mutants N20K, M21K, N27K, H31K improved peptide solubility at alkaline pH (Rollema et al., 1995). Next, residue alterations at distinct locations enabled the improvement of antimicrobial activity (Islam et al., 2009 Healy et al., 2013 Geng and Smith, 2018), the enhancement of diffusion through complex polymers (Rouse et al., 2012), and widening effect on some Gram-negative bacteria (Field et al., 2012).

Studies on the effects of the hinge region (NMK) length between rings C and D on antimicrobial activity and host specificity of nisin was also performed (Zhou et al., 2015). Although most variants with shorter or larger hinge length are less active than the wild type, some variants (+2, +1, 𢄡, 𢄢) exhibited higher antimicrobial activity than the wild type nisin A in agar-well-diffusion assays against L. lactis MG1363, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis VE14089, Bacillus sporothermodurans IC4, and Bacillus cereus 4153. In addition, an extended nisin A variant of the hinge region (20NMKIV24) has been introduced, bypassing the human pathogen’s lantibiotic resistance while showing a slight decrease in antimicrobial activity (Zaschke-Kriesche et al., 2019). In this context, Figure 3 represents different variants of nisin produced by classical protein engineering together with a graphical representation of the mechanism of action of this bioactive peptide.

Figura 3. Nisin is one of the best-studied ribosomally synthesized, pore-forming, cationic, antimicrobial peptides. (A) Sequence comparison of three nisin variants from L. lactis and marking the important regions of nisin targeted for bioengineering by classical molecular biology approaches (Chatterjee et al., 2005) (B) two-steps mode of action of nisin.

However, the expression of lantibiotics in popular prokaryotic hosts like E. coli is challenging as these bacteria have no enzymes to perform suitable PTMs to convert pro-peptide into a mature bioactive peptide. Therefore, their recombinant expression has to be coupled with the co-expression of active PTM biosynthetic gene clusters either in vitro o en vivo. These strategies are not in the focus of our study and interested readers are directed to numerous studies and reviews dedicated to this topic (Zhang et al., 2018 Myronovskyi and Luzhetskyy, 2019). We are mainly concerned with the en vivo design strategies that focus to expand the functional scope of AMPs from ribosomal templates beyond the classical protein engineering approaches.

Beyond Classical Protein Engineering: Expanding the Scope of Protein Translation

It was argued that chemical and functional diversity delivered by PTMs in AMPs such as lantibiotics can be further supplemented or even expanded by the co-translational insertion of non-canonical amino acids (ncAAs) (Budisa, 2013). Indeed, a limited and conservative set of 20 canonical amino acids used by ribosomes to encode polypeptides in nature usually does not cover enough chemical space required to substantially expand their functional and structural diversity. In nature, this is normally achieved by site-selective PTMs that create special non-canonical amino acid side chains such as dehydroalanine (Dha) and dehydrobutyrine (Dhb) in lantibiotics (Figure 3). To directly mimic these and similar PTMs, chemists used, e.g., rhodium-catalyzed arylations (Key and Miller, 2017), P450-catalyzed cyclopropanations (Gober et al., 2017), and photocatalytic activation (de Bruijn and Roelfes, 2018) in thiopeptides, as well as metalloporphyrin-catalyzed alkylation of methionine in nisin (Maaskant and Roelfes, 2019) as attempts to obtaining novel AMPs with improved properties and/or activities. However, it is difficult to mimic PTM machinery chemically, whereas classical peptide synthetic protocols such as solid-phase peptide synthesis (SPPS) could not cover the chemical complexity of these natural products.

Therefore, the use of recombinant DNA technology that operates with heterologous expression of biosynthetic gene clusters and enriched with reprogrammed protein translation (Figure 4) can provide a reasonable solution to the above-mentioned problems (Hoesl and Budisa, 2012). It enables specific insertion of the biological, chemical, and physical properties delivered by ncAAs that can be accurately defined by the chemist at the bench. Cells equipped with various bioorthogonal chemistries have the potential to perform catalytic transformations that are not found in biology, including the creation of new metabolic and informational pathways (Devaraj, 2018). These modifications can also serve as redox sensors, spectroscopic markers (e.g., spin-labeling) or sensors of protein-ligand interactions. Metal-binding amino acids could lead to new structural, catalytic, or regulatory elements in proteins, while diazirines allow site-specific photo-crosslinking of the target protein to its substrate. Photoactive and photo-isomerizable ncAAs with novel photo-physical properties such as azobenzene side chains can be used to photo-regulate protein activity. Similarly, photocaged ncAAs can be activated by light to turn on enzymatic activity spatiotemporally (for review see Young and Schultz, 2010).

Figura 4. The radial arrangement of the standard genetic code in RNA format (A) with the side chains of 20 canonical amino acids (cAA). The standard amino acid repertoire of the genetic code can be modified or expanded (B) by non-canonical amino acids (ncAAs). By reprogramming protein translation, the ncAAs can be incorporated into recombinant proteins using en vivo y in vitro métodos. These insertions offer useful modifications that can be made to the protein main chain (backbone) and the amino acid side chains (aliphatic or aromatic). Modified backbones and side chains often have unique physicochemical properties with the potential to dramatically expand the chemical and functional space of ribosomally synthesized peptides and proteins.

Directed evolution of aminoacyl-tRNA synthase (aaRS) plays a key role in the generation of such molecular tools. Desired ncAAs can be incorporated in a site-directed manner by reading in-frame stop codons, usually amber stop codons (UAG) with a suitable orthogonal pair (o-pair). Such a pair consists of an aaRS enzyme to activate the ncAA and its associated orthogonal tRNA (vide infra). However, the transition to recombinant production with such a possibility by using heterologous expression hosts is not trivial. For that reason, the residue-specific replacement of a particular amino acid at all positions in a protein sequence (known as selective pressure incorporation, vide infra) is a reasonable alternative as it does not require o-pairs (Budisa, 2004). Finally, the capacity of ncAAs incorporation should not interfere with the sequence of posttranslational modifications leading to the formation of lantibiotics and the restoration of their bioactivity.

With such systems in hands we would have very sophisticated tools to rationally engineer RiPPs scaffolds as now they can be redesigned by reprogrammed protein translation which utilize various ncAAs. This approach would have many advantages over the above discussed classical chemical or recombinant approaches as it enables: (i) genetic encoding of desired ncAAs and its sequence positioning (ii) recombinant production under mild conditions at room temperature and atmospheric pressure (iii) the targeted functionalization (e.g., various site-directed bioconjugations, light induced cross-linking, metal or cofactor binding, fluorophore or pharmacophore attachment, adhesiveness, etc.) (Cropp and Schultz, 2004). Crucial requirements to expand the scope of protein synthesis with ncAAs should be cellular uptake, their intracellular metabolic stability and translational activity (i.e., incorporation). Finally, it is necessary to reallocate (reassign) coding triplets (codons) in the genetic code to insert ncAAs in target protein/peptide sequences.


References and Notes

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First Life with "Alien" DNA Created in Lab

For billions of years, the history of life has been written with just four letters &mdash A, T, C and G, the labels given to the DNA subunits contained in all organisms. That alphabet has just grown longer, researchers announce, with the creation of a living cell that has two 'foreign' DNA building blocks in its genome.

Hailed as a breakthrough by other scientists, the work is a step towards the synthesis of cells able to churn out drugs and other useful molecules. It also raises the possibility that cells could one day be engineered without any of the four DNA bases used by all organisms on Earth.

&ldquoWhat we have now is a living cell that literally stores increased genetic information,&rdquo says Floyd Romesberg, a chemical biologist at the Scripps Research Institute in La Jolla, California, who led the 15-year effort. Their research appears online today in Naturaleza.

Each strand of the DNA's double helix has a backbone of sugar molecules and, attached to it, chemical subunits known as bases. There are four different bases: adenine (A), thymine (T), cytosine (C) and guanine (G). These letters represent the code for the amino-acid building blocks that make up proteins. The bases bind the two DNA strands together, with an A always bonding to a T on the opposite strand (and vice versa), and C and G doing likewise.

Test-tube letters
Scientists first questioned whether life could store information using other chemical groups in the 1960s. But it wasn&rsquot until 1989 that Steven Benner, then at the Swiss Federal Institute of Technology in Zurich, and his team coaxed modified forms of cytosine and guanine into DNA molecules. In test-tube reactions, strands made of these &ldquofunny letters&rdquo, as Benner calls them, copied themselves and encoded RNA and proteins.

The bases engineered by Romesberg&rsquos team are more alien, bearing little chemical resemblance to the four natural ones, Benner says. In a 2008 paper, and in follow-up experiments, the group reported efforts to pair chemicals together from a list of 60 candidates and screen the 3,600 resulting combinations. They identified a pair of bases, known as d5SICS and dNaM, that looked promising. In particular, the molecules had to be compatible with the enzymatic machinery that copies and translates DNA.

&ldquoWe didn&rsquot even think back then that we could move into an organism with this base pair,&rdquo says Denis Malyshev, a former graduate student in Romesberg&rsquos lab who is first author of the new paper. Working with test-tube reactions, the scientists succeeded in getting their unnatural base pair to copy itself and be transcribed into RNA, which required the bases to be recognized by enzymes that had evolved to use A, T, C and G.

The first challenge to creating this alien life was to get cells to accept the foreign bases needed to maintain the molecule in DNA through repeated rounds of cell division, during which DNA is copied. The team engineered the bacterium Escherichia coli to express a gene from a diatom &mdash a single-celled alga &mdash encoding a protein that allowed the molecules to pass through the bacterium's membrane.

The scientists then created a short loop of DNA, called a plasmid, containing a single pair of the foreign bases, and inserted the whole thing into E. coli células. With the diatom protein supplying a diet of foreign nucleotides, the plasmid was copied and passed on to dividing E. coli cells for nearly a week. When the supply of foreign nucleotides ran out, the bacteria replaced the foreign bases with natural ones.

Alien control
Malyshev sees the ability to control the uptake of foreign DNA bases as a safety measure that would prevent the survival of alien cells outside the lab, should they escape. But other researchers, including Benner, are trying to engineer cells that can make foreign bases from scratch, obviating the need for a feedstock.

Romesberg&rsquos group is working on getting foreign DNA to encode proteins that contain amino acids other than the 20 that together make up nearly all natural proteins. Amino acids are encoded by 'codons' of three DNA letters apiece, so the addition of just two foreign DNA 'letters' would vastly expand a cell&rsquos ability to encode new amino acids. &ldquoIf you read a book that was written with four letters, you&rsquore not going to be able to tell many interesting stories,&rdquo Romesberg says. &ldquoIf you&rsquore given more letters, you can invent new words, you can find new ways to use those words and you can probably tell more interesting stories.&rdquo

Potential uses of the technology include the incorporation of a toxic amino acid into a protein to ensure that it kills only cancer cells, and the development of glowing amino acids that could help scientists to track biological reactions under the microscope. Romesberg&rsquos team has founded a company called Synthorx in San Diego, California, to commercialize the work.

Ross Thyer, a synthetic biologist at the University of Texas at Austin who co-authored a related News and Views article, says that the work is &ldquoa big leap forward in what we can do&rdquo. It should be possible to get the foreign DNA to encode new amino acids, he says.

&ldquoMany in the broader community thought that Floyd's result would be impossible,&rdquo says Benner, because chemical reactions involving DNA, such as replication, need to be exquisitely sensitive to avoid mutation.

The alien E. coli contains just a single pair of foreign DNA bases out of millions. But Benner sees no reason why a fully alien cell isn&rsquot possible. &ldquoI don&rsquot think there&rsquos any limit,&rdquo he says. &ldquoIf you go back and rerun evolution for four billion years, you could come up with a different genetic system.&rdquo

But creating a wholly synthetic organism would be a huge challenge. &ldquoA lot of times people will say you&rsquoll make an organism completely out of your unnatural DNA,&rdquo says Romesberg. &ldquoThat&rsquos just not going to happen, because there are too many things that recognize DNA. It&rsquos too integrated into every facet of a cell&rsquos life.&rdquo

This article is reproduced with permission from the magazine Nature. The article was first published on May 7, 2014.


Conclusión

It has been a great pleasure to see our science grow in many new and exciting ways over the past few years. I have been fortunate to have very talented people come to my laboratory from a wide range of backgrounds, from total chemical synthesis to transgenic animals, through biochemistry, genetics, molecular evolution, structural biology and cell biology, and to be surrounded by some great collaborators. It has been a great pleasure to learn from everyone in the laboratory and to watch people in the laboratory learn from each other.

I believe that we are training a new generation of scientists who can seamlessly engineer across a range of scales from molecules to systems. They can engineer the specificity of biological networks and biological molecules as well as control the structures of small molecules atom by atom. By coupling these abilities, we have begun to provide solutions to problems previously viewed as intractable. I hope that the people that invested in training me get satisfaction from seeing the fragments of everything I learned from them fused to create something new, and I look forward to being surprised and excited by what the extraordinarily talented alumni that are beginning to emerge from my laboratory may do in the future.


Scientists direct bacteria with expanded genetic code to evolve extreme heat tolerance

Escherichia coli. Credit: Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH

In recent years, scientists have engineered bacteria with expanded genetic codes that produce proteins made from a wider range of molecular building blocks, opening up a promising front in protein engineering.

Now, Scripps Research scientists have shown that such synthetic bacteria can evolve proteins in the laboratory with enhanced properties using mechanisms that might not be possible with nature's 20 amino acid building blocks.

Exposing bacteria with an artificially expanded genetic code to temperatures at which they cannot normally grow, the researchers found that some of the bacteria evolved new heat-resistant proteins that remain stable at temperatures where they would typically inactivate. The researchers reported their findings in the Revista de la Sociedad Química Estadounidense (JACS).

Virtually every organism on earth uses the same 20 amino acids as the building blocks to make proteins—the large molecules that carry out the majority of cellular functions. Peter Schultz, Ph.D., the senior author of the JACS paper and president and CEO of Scripps Research, pioneered a method to reprogram the cell's own protein biosynthetic machinery to add new amino acids to proteins, termed non-canonical amino acids (ncAAs), with chemical structures and properties not found in the common 20 amino acids.

This expanded genetic code has been used in the past to rationally design proteins with novel properties for use as tools to study how proteins work in cells and as new precision-engineered drugs for cancer. The researchers now asked whether synthetic bacteria with expanded genetic codes have an evolutionary advantage over those that are limited to 20 building blocks—is a 21 amino acid code better than a 20 amino acid code from an evolutionary fitness perspective?

"Ever since we first expanded the range of amino acids that can be incorporated in proteins, much work has gone into using these systems to engineer molecules with new or enhanced properties," says Schultz. "Here, we've shown that combining an expanded genetic code with a laboratory evolution one can create proteins with enhanced properties that may not be readily achievable with nature's more limited set."

The scientists started by tweaking the genome of E. coli so that the bacteria could produce the protein homoserine o-succinyltransferase (metA) using a 21 amino acid code instead of the common 20 amino acid code. An important metabolic enzyme, metA dictates the maximum temperature at which E. coli can thrive. Above that temperature, metA begins to inactivate and the bacteria die. The researchers then made mutants of metA, in which almost any amino acid in the natural protein could be replaced with a 21st noncanonical amino acid.

At this point, they let natural selection—the central mechanism of evolution—work its magic. By heating the bacteria to 44 degrees Celsius—a temperature at which normal metA protein cannot function, and as a consequence, bacteria cannot grow—the scientists put selective pressure on the bacteria population. As expected, some of the mutant bacteria were able to survive beyond their typical temperature ceiling, thanks to possessing a mutant metA that was more heat stable—all other bacteria died.

In this way, the researchers were able to drive the bacteria to evolve a mutant metA enzyme that could withstand temperatures 21 degrees higher than normal, nearly twice the thermal stability increase that people typically achieve when restricted to mutations limited to the common 20 amino acid building blocks.

The researchers then identified the specific genetic sequence change that resulted in the mutant metA and found it was due to the unique chemical properties of one of their noncanonical amino acids that laboratory evolution exploited in a clever way to stabilize the protein.

"It's striking how making such a small mutation with a new amino acid not present in nature leads to such a significant improvement in the physical properties of the protein," says Schultz.

"This experiment raises the question of whether a 20 amino acid code is the optimal genetic code—if we discover life forms with expanded codes will they have an evolutionary advantage, and what would we be like if God had worked on the seventh day and added a few more amino acids to the code?"


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