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11.2: Secuenciación de ADN - Biología

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La secuenciación del ADN determina el orden de las bases de nucleótidos dentro de un fragmento dado de ADN. Esta información se puede utilizar para inferir la secuencia de ARN o proteína codificada por el gen, a partir de la cual se pueden hacer más inferencias sobre la función del gen y su relación con otros genes y productos génicos. La información de la secuencia de ADN también es útil para estudiar la regulación de la expresión génica. Si la secuenciación del ADN se aplica al estudio de muchos genes, o incluso de un genoma completo, se considera un ejemplo de genómica.

Secuenciación didesoxi

Recuerde que las ADN polimerasas incorporan nucleótidos (dNTP) en una hebra de ADN en crecimiento, según la secuencia de una hebra molde. Las ADN polimerasas agregan una nueva base solo al grupo 3'-OH de una hebra existente de ADN; esta es la razón por la que se requieren cebadores en la síntesis de ADN natural y en técnicas como la PCR. La mayoría de las técnicas de secuenciación de ADN que se utilizan actualmente se basan en la incorporación aleatoria de nucleótidos modificados denominados terminadores. Ejemplos de terminadores son los nucleótidos didesoxi (ddNTPs), que carecen de un grupo 3'-OH y, por lo tanto, no pueden servir como un sitio de unión para la adición de nuevas bases a una cadena de ADN en crecimiento (Figura ( PageIndex {1} )). Después de que un ddNTP se incorpora a una hebra de ADN, no puede ocurrir más elongación. Los terminadores están etiquetados con uno de los cuatro tintes fluorescentes, cada uno específico para una de las cuatro bases de nucleótidos.

Para secuenciar un fragmento de ADN, necesita muchas copias de ese fragmento (Figura ( PageIndex {2} )). A diferencia de la PCR, la secuenciación de ADN no amplifica la secuencia diana y solo se usa un cebador. Este cebador se hibrida con el ADN molde desnaturalizado y determina en qué parte de la hebra molde comenzará la reacción de secuenciación. Se agrega una mezcla de dNTP, terminadores marcados con fluorescencia y ADN polimerasa a un tubo que contiene el híbrido cebador-molde. La ADN polimerasa sintetizará una nueva hebra de ADN hasta que se incorpore un nucleótido marcado con fluorescencia, en cuyo punto finaliza la extensión. Debido a que la reacción contiene millones de moléculas molde, se sintetiza un número correspondiente de moléculas más cortas, cada una terminando en una etiqueta fluorescente que corresponde a la última base incorporada.

Las hebras recién sintetizadas pueden desnaturalizarse de la plantilla y luego separarse electroforéticamente en función de su longitud (Figura ( PageIndex {3} )). Dado que cada banda difiere en longitud en un nucleótido, y la identidad de ese nucleótido se conoce por su fluorescencia, la secuencia de ADN puede leerse simplemente a partir del orden de los colores en bandas sucesivas. En la práctica, la longitud máxima de secuencia que se puede leer en una única reacción de secuenciación es de aproximadamente 700 pb.

Un método de electroforesis particularmente sensible que se utiliza en el análisis de reacciones de secuenciación de ADN se llama electroforesis capilar (Figura ( PageIndex {6} )). En este método, una corriente tira de los productos de secuenciación a través de una matriz similar a un gel que está encerrada en un tubo fino de plástico transparente. Como en la electroforesis convencional, los fragmentos más pequeños se mueven a través del capilar con mayor rapidez. A medida que pasan por un punto cerca del final del capilar, se lee la intensidad fluorescente de cada tinte. Esto produce un gráfico llamado cromatograma. La secuencia se determina identificando el pico más alto (es decir, el tinte con la señal fluorescente más intensa) en cada posición.

Secuenciación de próxima generación

Los avances tecnológicos de las dos últimas décadas han aumentado la velocidad y la calidad de la secuenciación, al tiempo que han reducido el costo. Esto se ha vuelto especialmente cierto con los métodos desarrollados más recientemente llamados secuenciación de próxima generación. No todos estos nuevos métodos se basan en terminadores, pero uno que sí lo hace es un método utilizado en instrumentos vendidos por una empresa llamada Illumina. Los secuenciadores de Illumina utilizan una variante especial de PCR llamada PCR puente para hacer muchos miles de copias de un fragmento de plantilla corto (45 pb). Cada uno de estos fragmentos de plantilla cortos se adjunta en un grupo en un pequeño lugar en una superficie de reacción. Millones de otros grupos, cada uno formado por un fragmento de plantilla diferente, se encuentran en otras posiciones de la superficie de reacción. Luego, la síntesis de ADN en cada hebra de plantilla procede utilizando terminadores marcados con colorante que se utilizan son reversibles. Por tanto, la síntesis se termina (temporalmente) después de la incorporación de cada nucleótido. Por lo tanto, después de que se incorpora el primer nucleótido en cada hebra, una cámara registra el color de la fluorescencia emitida por cada grupo. A continuación, se modifican los terminadores, se incorpora un segundo nucleótido en cada hebra y se fotografía de nuevo la superficie de reacción. Este ciclo se repite un total de 45 veces. Debido a que millones de plantillas de 45 pb se secuencian en paralelo en un solo proceso, la secuenciación de Illumina es muy eficiente en comparación con otras técnicas de secuenciación. Sin embargo, la corta longitud de las plantillas limita actualmente la aplicación de esta tecnología.


11 Biología molecular del gen

La biología molecular es la rama de la biología que se ocupa de la base molecular de la actividad biológica en y entre las células, incluida la síntesis, modificación, mecanismos e interacciones moleculares. La biología molecular surgió como un intento de responder a las preguntas sobre los mecanismos de herencia genética y la estructura de un gen. En 1953, James Watson y Francis Crick publicaron la estructura de doble hélice del ADN por cortesía del trabajo de cristalografía de rayos X realizado por Rosalind Franklin y Maurice Wilkins. Watson y Crick describieron la estructura del ADN y las interacciones dentro de la molécula. Esta publicación impulsó la investigación en biología molecular y aumentó el interés en el tema.

Los ácidos nucleicos son biopolímeros que son esenciales para todas las formas de vida conocidas. El término ácido nucleico es el nombre general de ADN y ARN. Están compuestos por nucleótidos, que son los monómeros formados por tres componentes: un azúcar de 5 carbonos, un grupo fosfato y una base nitrogenada. Si el azúcar es un compuesto ribosa, el polímero es ARN (ácido ribonucleico) si el azúcar se deriva de la ribosa como desoxirribosa, el polímero es ADN (ácido desoxirribonucleico).

En un influyente artículo publicado en 1941, George Beadle y Edward Tatum propusieron la idea de que los genes actúan a través de la producción de enzimas, y cada gen es responsable de producir una sola enzima que a su vez afecta a un solo paso en una vía metabólica. El concepto surgió del trabajo sobre mutaciones genéticas en el moho. Neurospora crassa, y posteriormente su colaborador Norman Horowitz la denominó “hipótesis de un gen, una enzima”. En 2004 Norman Horowitz recordó que “estos experimentos fundaron la ciencia de lo que Beadle y Tatum llamaron 'genética bioquímica'. Algunos consideran que estos experimentos constituyen el comienzo de lo que se convirtió en genética molecular y el desarrollo de la hipótesis de un gen, una enzima es a menudo se considera el primer resultado significativo en lo que se denominó biología molecular. Aunque ha sido extremadamente influyente, la hipótesis fue reconocida poco después de su propuesta como una simplificación excesiva. Incluso la posterior reformulación de la hipótesis "un gen, un polipéptido" se considera ahora demasiado simple para describir la relación entre genes y proteínas. Al atribuir un papel de instrucción a los genes, Beadle y Tatum asignaron implícitamente a los genes una capacidad de información. Esta idea proporcionó la base para el concepto de código genético. Sin embargo, no fue hasta que se realizaron los experimentos que demostraron que el ADN era el material genético, que las proteínas consisten en una secuencia lineal definida de aminoácidos y que la estructura del ADN contenía una secuencia lineal de pares de bases, no hubo una base clara para resolver el problema. codigo genetico.

Al atribuir un papel de instrucción a los genes, Beadle y Tatum asignaron implícitamente a los genes una capacidad de información. Esta idea proporcionó la base para el concepto de código genético. Sin embargo, no fue hasta que se realizaron los experimentos que demostraron que el ADN era el material genético, que las proteínas consisten en una secuencia lineal definida de aminoácidos y que la estructura del ADN contenía una secuencia lineal de pares de bases, no hubo una base clara para resolver el problema. codigo genetico.

Aunque se sabía que los genes existían en los cromosomas, los cromosomas están compuestos tanto de proteínas como de ADN, y los científicos no sabían cuál de los dos es responsable de la herencia. En 1928, Frederick Griffith descubrió el fenómeno de la transformación: las bacterias muertas podían transferir material genético para "transformar" otras bacterias aún vivas. Dieciséis años después, en 1944, el experimento de Avery-MacLeod-McCarty identificó al ADN como la molécula responsable de la transformación. El papel del núcleo como depósito de información genética en eucariotas había sido establecido por Hämmerling en 1943 en su trabajo sobre el alga unicelular Acetabularia. El experimento de Hershey-Chase en 1952 confirmó que el ADN (en lugar de la proteína) es el material genético de los virus que infectan a las bacterias, lo que proporciona más evidencia de que el ADN es la molécula responsable de la herencia.

James Watson y Francis Crick determinaron la estructura del ADN en 1953, utilizando el trabajo de cristalografía de rayos X de Rosalind Franklin y Maurice Wilkins que indicó que el ADN tiene una estructura helicoidal (es decir, con forma de sacacorchos). Su modelo de doble hélice tenía dos hebras de ADN con los nucleótidos apuntando hacia adentro, cada uno con un nucleótido complementario en la otra hebra para formar lo que parecen peldaños en una escalera retorcida. Esta estructura mostró que existe información genética en la secuencia de nucleótidos en cada hebra de ADN. La estructura también sugirió un método simple de replicación: si las hebras se separan, se pueden reconstruir nuevas hebras asociadas para cada una en función de la secuencia de la hebra antigua. Esta propiedad es lo que le da al ADN su naturaleza semi-conservadora donde una hebra de ADN nuevo es de una hebra parental original.

Figura 11.1: Una representación de dibujos animados de ADN basada en coordenadas atómicas de PDB 1BNA, renderizada con la herramienta de visualización molecular de código abierto PyMol.

Aunque la estructura del ADN mostró cómo funciona la herencia, todavía no se sabía cómo influye el ADN en el comportamiento de las células. En los años siguientes, los científicos intentaron comprender cómo el ADN controla el proceso de producción de proteínas. Se descubrió que la célula usa ADN como plantilla para crear ARN mensajero coincidente, moléculas con nucleótidos muy similares al ADN. Los ribosomas utilizan la secuencia de nucleótidos de un ARN mensajero como plantilla para crear una secuencia de aminoácidos en la proteína. Esta correspondencia entre las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos se conoce como código genético.

Con la recién descubierta comprensión molecular de la herencia, se produjo una explosión de investigación. Un avance importante fue la secuenciación de ADN de terminación de cadena en 1977 por Frederick Sanger. Esta tecnología permite a los científicos leer la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN. En 1983, Kary Banks Mullis desarrolló la reacción en cadena de la polimerasa, que proporciona una forma rápida de aislar y amplificar una sección específica de ADN de una mezcla. Los esfuerzos del Proyecto Genoma Humano, el Departamento de Energía, los NIH y los esfuerzos privados paralelos de Celera Genomics llevaron a la secuenciación del genoma humano en 2003.


14.2 Estructura y secuenciación del ADN

En esta sección, explorará las siguientes preguntas:

  • ¿Cuál es la estructura molecular del ADN?
  • ¿Cuál es el método Sanger de secuenciación de ADN? ¿Qué es una aplicación de secuenciación de ADN?
  • ¿Cuáles son las similitudes y diferencias entre el ADN eucariota y procariota?

Conexión para cursos AP ®

El modelo actualmente aceptado de la estructura del ADN fue propuesto en 1953 por Watson y Crick, quienes hicieron su modelo después de ver una fotografía de ADN que Franklin había tomado usando cristalografía de rayos X. La foto mostraba la forma y las dimensiones de la molécula de doble hélice. Las dos hebras que componen la doble hélice son de naturaleza complementaria y antiparalela. Es decir, una hebra corre en la dirección de 5 'a 3', mientras que la hebra complementaria corre en la dirección de 3 'a 5'. (La importancia de la direccionalidad será importante cuando exploremos cómo se copia el ADN). El ADN es un polímero de nucleótidos que consta de azúcar desoxirribosa, un grupo fosfato y una de las cuatro bases nitrogenadas (A, T, C y G) con una purina siempre combinada con una pirimidina (como descubrió Chargaff). El "lenguaje" genético del ADN se encuentra en secuencias de nucleótidos. Durante la división celular, cada célula hija recibe una copia de ADN en un proceso llamado replicación. En los años transcurridos desde el descubrimiento de la estructura del ADN, se han desarrollado muchas tecnologías, incluida la secuenciación del ADN, que nos permiten comprender mejor el ADN y su función en nuestros genomas.

La información presentada y los ejemplos resaltados en la sección apoyan los conceptos descritos en la Gran Idea 3 del Marco del Currículo de Biología AP ®. Los objetivos de aprendizaje enumerados en el marco curricular proporcionan una base transparente para el curso de biología AP ®, una experiencia de laboratorio basada en la investigación, actividades de instrucción y preguntas del examen AP ®. Un objetivo de aprendizaje fusiona el contenido requerido con una o más de las siete prácticas científicas.

Gran idea 3 Los sistemas vivos almacenan, recuperan, transmiten y responden a información esencial para los procesos de la vida.
Comprensión duradera 3.A La información heredable asegura la continuidad de la vida.
Conocimiento esencial 3.A.1 El ADN, y en algunos casos el ARN, es la principal fuente de información hereditaria.
Práctica de la ciencia 6.5 El alumno puede evaluar explicaciones científicas alternativas.
Objetivo de aprendizaje 3.1 El estudiante es capaz de construir explicaciones científicas que utilizan las estructuras y mecanismos del ADN para respaldar la afirmación de que el ADN es la fuente principal de información hereditaria.
Conocimiento esencial 3.A.1 El ADN, y en algunos casos el ARN, es la principal fuente de información hereditaria.
Práctica de la ciencia 4.1 El estudiante puede justificar la selección del tipo de datos necesarios para responder una pregunta científica en particular.
Objetivo de aprendizaje 3.2 El alumno es capaz de justificar la selección de datos de investigaciones históricas que apoyan la afirmación de que el ADN es la fuente de información hereditaria.
Conocimiento esencial 3.A.1 El ADN, y en algunos casos el ARN, es la principal fuente de información hereditaria.
Práctica de la ciencia 6.4 El estudiante puede hacer afirmaciones y predicciones sobre fenómenos naturales basados ​​en teorías y modelos científicos.
Objetivo de aprendizaje 3.5 El estudiante puede justificar la afirmación de que los humanos pueden manipular la información hereditaria identificando al menos dos tecnologías de uso común.

Apoyo a los profesores

Las imágenes de difracción de rayos X de Franklin ayudaron a conducir al descubrimiento de la estructura del ADN, pero Watson y Crick no mencionaron a Franklin en su artículo fundamental de 1953, que se puede encontrar aquí. Este artículo incluye anotaciones que ayudan a ubicar el trabajo en un contexto histórico. Los estudiantes podrían estar interesados ​​en aprender cómo Watson y Crick descubrieron la estructura del ADN. Los detalles se pueden encontrar en este sitio web de PBS. Si es posible, busque una copia del anuncio del descubrimiento tal como apareció en The New York Times. La redacción es interesante y la importancia del descubrimiento es subestimada.

Las preguntas del desafío de práctica científica contienen preguntas de prueba adicionales para esta sección que lo ayudarán a prepararse para el examen AP. Estas preguntas abordan los siguientes estándares:
[APLO 3.3] [APLO 3.5] [APLO 3.13]

Los componentes básicos del ADN son los nucleótidos. Los componentes importantes del nucleótido son una base nitrogenada, desoxirribosa (azúcar de 5 carbonos) y un grupo fosfato (Figura 14.5). El nombre del nucleótido depende de la base nitrogenada. La base nitrogenada puede ser una purina como adenina (A) y guanina (G), o una pirimidina como citosina (C) y timina (T).

Los nucleótidos se combinan entre sí mediante enlaces covalentes conocidos como enlaces o enlaces fosfodiéster. Las purinas tienen una estructura de doble anillo con un anillo de seis miembros fusionado a un anillo de cinco miembros. Las pirimidinas son de tamaño más pequeño y tienen una estructura de anillo única de seis miembros. Los átomos de carbono del azúcar de cinco carbonos se numeran 1 ', 2', 3 ', 4' y 5 '(1' se lee como “un primo”). El residuo de fosfato está unido al grupo hidroxilo del carbono 5 'de un azúcar de un nucleótido y al grupo hidroxilo del carbono 3' del azúcar del siguiente nucleótido, formando así un enlace fosfodiéster 5'-3 '.

En la década de 1950, Francis Crick y James Watson trabajaron juntos para determinar la estructura del ADN en la Universidad de Cambridge, Inglaterra. Otros científicos como Linus Pauling y Maurice Wilkins también estaban explorando activamente este campo. Pauling había descubierto la estructura secundaria de las proteínas mediante cristalografía de rayos X. En el laboratorio de Wilkins, la investigadora Rosalind Franklin estaba usando métodos de difracción de rayos X para comprender la estructura del ADN. Watson y Crick pudieron armar el rompecabezas de la molécula de ADN sobre la base de los datos de Franklin porque Crick también había estudiado la difracción de rayos X (figura 14.6). En 1962, James Watson, Francis Crick y Maurice Wilkins recibieron el Premio Nobel de Medicina. Desafortunadamente, para entonces Franklin había muerto y los premios Nobel no se otorgan póstumamente.

Watson y Crick propusieron que el ADN está formado por dos hebras que se retuercen entre sí para formar una hélice a la derecha. El apareamiento de bases tiene lugar entre una purina y pirimidina, a saber, los pares A con T y los pares G con C. La adenina y la timina son pares de bases complementarios, y la citosina y la guanina también son pares de bases complementarios. Los pares de bases están estabilizados por enlaces de hidrógeno, la adenina y la timina forman dos enlaces de hidrógeno y la citosina y la guanina forman tres enlaces de hidrógeno. Las dos hebras son de naturaleza antiparalela, es decir, el extremo 3 'de una hebra se enfrenta al extremo 5' de la otra hebra. El azúcar y el fosfato de los nucleótidos forman la columna vertebral de la estructura, mientras que las bases nitrogenadas se apilan en el interior. Cada par de bases está separado del otro par de bases por una distancia de 0,34 nm, y cada vuelta de la hélice mide 3,4 nm. Por lo tanto, hay diez pares de bases por vuelta de hélice. El diámetro de la doble hélice de ADN es de 2 nm y es uniforme en toda su extensión. Solo el emparejamiento entre una purina y pirimidina puede explicar el diámetro uniforme. La torsión de las dos hebras entre sí da como resultado la formación de ranuras mayores y menores uniformemente espaciadas (Figura 14.7).

Conexión de práctica científica para cursos AP®

Actividad

Lea el original de Watson y Crick Naturaleza artículo, "Estructura molecular de los ácidos nucleicos: una estructura para el ácido nucleico desoxirribosa", ¿Cómo se basó el modelo de Watson y Crick en los hallazgos de Rosalind Franklin? ¿Cómo se basó su modelo de ADN en los hallazgos de Hershey y Chase, y otros, mostrando que el ADN puede codificar y transmitir información a la siguiente generación?

Piénsalo

El trabajo de Watson y Crick determinó la estructura del ADN. Sin embargo, todavía era relativamente desconocido cómo el ADN codificaba la información en genes. Seleccione una forma moderna de biotecnología e investigue sus métodos básicos en línea. Los ejemplos incluyen secuenciación de genes, huellas dactilares de ADN, PCR (reacción en cadena de la polimerasa), alimentos modificados genéticamente, etc. Describa brevemente la tecnología que eligió y los beneficios que nos brinda. Luego, describa cómo los hallazgos de Watson y Crick fueron vitales para el desarrollo de la tecnología que eligió.

Apoyo a los profesores

La actividad es una aplicación del Objetivo de aprendizaje 3.1 y la Práctica científica 6.5 porque los estudiantes están analizando el modelo de ADN de Watson y Crick en relación con los hallazgos de otros investigadores de ADN que determinaron que el ADN es la molécula de la herencia. La actividad también es una aplicación del Objetivo de aprendizaje 3.2 y la Práctica científica 4.1 porque los estudiantes están analizando los resultados históricos publicados de Watson y Crick y seleccionando evidencia que Watson y Crick usaron para crear su modelo de ADN y además muestran que el ADN es la molécula de la herencia. .

Posible respuesta:

La pregunta Piénselo es una aplicación del Objetivo de aprendizaje 3.5 y la Práctica científica 6.4 porque los estudiantes están investigando los métodos mediante los cuales los humanos pueden manipular la información heredable y describen cómo esos métodos se basaron en las teorías y modelos científicos de Watson y Crick.

Posible respuesta:

Técnicas de secuenciación de ADN

Hasta la década de 1990, la secuenciación del ADN (leer la secuencia del ADN) era un proceso relativamente costoso y largo. El uso de nucleótidos radiomarcados también agravó el problema por motivos de seguridad. Con la tecnología disponible actualmente y las máquinas automatizadas, el proceso es barato, más seguro y se puede completar en cuestión de horas. Fred Sanger desarrolló el método de secuenciación utilizado para el proyecto de secuenciación del genoma humano, que se utiliza ampliamente en la actualidad (Figura 14.8).

Enlace al aprendizaje

Visite este sitio para ver un video que explica la técnica de lectura de la secuencia de ADN que resultó del trabajo de Sanger.

  1. El método de Sanger se puede utilizar para secuenciar más de una hebra a la vez, lo que requiere menos tiempo. Los desafíos del método de Sanger incluyen su menor precisión para secuenciar cadenas de ADN.
  2. El método de Sanger es una forma confiable y precisa de secuenciar cadenas de ADN. Sin embargo, solo se puede secuenciar una hebra a la vez. Además, solo puede buscar una base a la vez, lo que puede llevar mucho tiempo.
  3. El método de Sanger es muy económico y menos preciso. Sin embargo, no se adapta fácilmente a los kits comerciales.
  4. El método de Sanger requiere menos tiempo y es altamente preciso. Sin embargo, es más caro que otros métodos disponibles para la secuenciación.

El método se conoce como método de terminación de cadena didesoxi. El método de secuenciación se basa en el uso de terminadores de cadena, los didesoxinucleótidos (ddNTP). Los didesoxinucleótidos, o ddNTPS, se diferencian de los desoxinucleótidos por la falta de un grupo 3 'OH libre en el azúcar de cinco carbonos. Si se agrega un ddNTP a una cadena de ADN en crecimiento, la cadena no se extiende más porque el grupo 3 'OH libre necesario para agregar otro nucleótido no está disponible. Usando una proporción predeterminada de desoxinucleótidos a didesoxinucleótidos, es posible generar fragmentos de ADN de diferentes tamaños.

La muestra de ADN que se va a secuenciar se desnaturaliza o separa en dos hebras calentándola a altas temperaturas. El ADN se divide en cuatro tubos en los que se añaden un cebador, la ADN polimerasa y los cuatro nucleótidos (A, T, G y C). Además de cada uno de los cuatro tubos, se añaden cantidades limitadas de uno de los cuatro didesoxinucleótidos a cada tubo, respectivamente. Los tubos están etiquetados como A, T, G y C de acuerdo con el ddNTP agregado. Para fines de detección, cada uno de los cuatro didesoxinucleótidos lleva una etiqueta fluorescente diferente. El alargamiento de la cadena continúa hasta que se incorpora un didesoxi nucleótido fluorescente, después de lo cual no tiene lugar ningún alargamiento adicional. Una vez finalizada la reacción, se realiza la electroforesis. Incluso se puede detectar una diferencia en la longitud de una sola base. La secuencia se lee desde un escáner láser. Por su trabajo en la secuenciación del ADN, Sanger recibió un Premio Nobel de Química en 1980.

Enlace al aprendizaje

La secuenciación del genoma de Sanger ha llevado a una carrera para secuenciar genomas humanos a una velocidad rápida y a bajo costo, lo que a menudo se conoce como la secuencia de $ 1000 en un día. Obtenga más información seleccionando la animación Secuenciación a velocidad aquí.

  1. La secuenciación genética más rápida ayudará en un análisis rápido de la composición genética de las bacterias que pueden causar enfermedades en los seres humanos para obtener tratamientos mejores y más eficientes. Además, la secuenciación del ADN de una célula cancerosa puede proporcionar mejores formas de tratar o prevenir el cáncer.
  2. La secuenciación rápida del ADN puede ayudarnos a analizar rápidamente la información genética de solo las bacterias existentes (no de las cepas nuevas) solo que causan enfermedades en los humanos, lo que puede conducir a tratamientos más eficientes.
  3. La secuenciación rápida del ADN puede ayudar a los médicos a tratar y diagnosticar enfermedades que no son raras en las poblaciones.
  4. Se puede utilizar una secuenciación genética más rápida para tratar y prevenir algunos tipos de cánceres y así aumentar la esperanza de vida de los pacientes que padecen las enfermedades.

La electroforesis en gel es una técnica que se utiliza para separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños. Por lo general, el gel está hecho de una sustancia química llamada agarosa. Se añade agarosa en polvo a un tampón y se calienta. Después de enfriar, la solución de gel se vierte en una bandeja de colada. Una vez que el gel se ha solidificado, el ADN se carga en el gel y se aplica corriente eléctrica. El ADN tiene una carga neta negativa y se mueve desde el electrodo negativo hacia el electrodo positivo. La corriente eléctrica se aplica durante el tiempo suficiente para permitir que el ADN se separe según el tamaño, los fragmentos más pequeños estarán más lejos del pozo (donde se cargó el ADN) y los fragmentos de peso molecular más pesado estarán más cerca del pozo. Una vez que se separa el ADN, el gel se tiñe con un tinte específico de ADN para verlo (Figura 14.9).

Conexión Evolution

Genoma neandertal: ¿cómo nos relacionamos?

El primer borrador de secuencia del genoma neandertal fue publicado recientemente por Richard E. Green et al. en 2010. 1 Los neandertales son los antepasados ​​más cercanos de los humanos actuales. Se sabía que habían vivido en Europa y Asia occidental antes de que desaparecieran de los registros fósiles hace aproximadamente 30.000 años. El equipo de Green estudió restos fósiles de casi 40.000 años que fueron seleccionados de sitios en todo el mundo. Se emplearon medios extremadamente sofisticados de preparación de muestras y secuenciación de ADN debido a la naturaleza frágil de los huesos y la fuerte contaminación microbiana. En su estudio, los científicos pudieron secuenciar unos cuatro mil millones de pares de bases. La secuencia neandertal se comparó con la de los humanos actuales de todo el mundo. Después de comparar las secuencias, los investigadores encontraron que el genoma del neandertal tenía entre un 2 y un 3 por ciento más de similitud con las personas que viven fuera de África que con las personas en África. Si bien las teorías actuales han sugerido que todos los seres humanos actuales se pueden rastrear hasta una pequeña población ancestral en África, los datos del genoma neandertal pueden contradecir este punto de vista. Green y sus colegas también descubrieron segmentos de ADN entre personas en Europa y Asia que son más similares a las secuencias de Neandertal que a otras secuencias humanas contemporáneas. Otra observación interesante fue que los neandertales están tan estrechamente relacionados con la gente de Papúa Nueva Guinea como con los de China o Francia. Esto es sorprendente porque los restos fósiles de neandertales se han localizado solo en Europa y Asia occidental. Lo más probable es que el intercambio genético tuvo lugar entre los neandertales y los humanos modernos cuando los humanos modernos emergieron de África, antes de la divergencia de europeos, asiáticos orientales y Papúa Nueva Guinea.

Varios genes parecen haber sufrido cambios con respecto a los neandertales durante la evolución de los humanos actuales. Estos genes están involucrados en la estructura craneal, el metabolismo, la morfología de la piel y el desarrollo cognitivo. Uno de los genes de especial interés es RUNX2, que es diferente en los humanos y los neandertales de hoy en día. Este gen es responsable del hueso frontal prominente, la caja torácica en forma de campana y las diferencias dentales que se observan en los neandertales. Se especula que un cambio evolutivo en RUNX2 fue importante en el origen de los seres humanos de hoy en día, y esto afectó el cráneo y la parte superior del cuerpo.

  1. Los primeros humanos emergieron de África y luego se expandieron para poblar diferentes partes del mundo. Una población aislada de estos primeros humanos se cruzó con los neandertales.
  2. Los primeros humanos se cruzaron con los neandertales, emergieron de África y luego se expandieron para poblar diferentes partes del mundo.
  3. Los primeros humanos emergieron de África, se cruzaron con los neandertales y luego se expandieron para poblar diferentes partes del mundo.
  4. Los primeros humanos no se cruzaron con los neandertales, pero tenemos muchas similitudes genéticas porque compartimos un ancestro común.

Enlace al aprendizaje

Vea la charla de Svante Pääbo que explica la investigación del genoma neandertal en la conferencia anual TED (Tecnología, Entretenimiento, Diseño) de 2011.

  1. Se ha sugerido que es muy probable que todos los seres humanos desciendan de África. Esto está respaldado por la investigación de que la variación genética en África también se encontró en el resto del mundo.
  2. La teoría de que los humanos descienden de África fue respaldada por la investigación de que la mayoría de los genomas humanos probados fuera de África tenían vínculos estrechos con los genomas de las personas en África, pero no se encontró una variación genética en África en el resto del mundo.
  3. Lo más probable es que los seres humanos hayan descendido de África. Esta investigación está respaldada por el hecho de que todos los genomas humanos probados fuera de África tenían vínculos estrechos con los genomas de las personas en África. Además, existe una variación genética en África que no se encontró en el resto del mundo.
  4. La transición a los humanos modernos ocurrió dentro de África y fue repentina. Por lo tanto, los genomas humanos probados fuera de África tenían vínculos estrechos con los genomas de las personas en África.

Empaquetado de ADN en células

Cuando se comparan células procariotas con células eucariotas, las procariotas son mucho más simples que las eucariotas en muchas de sus características (figura 14.10). La mayoría de los procariotas contienen un cromosoma circular único que se encuentra en un área del citoplasma llamada nucleoide.

Conexión visual

  1. La compartimentación en células eucariotas permite la construcción de proteínas y productos de ARN más complejos. En los procariotas, la ventaja es que la síntesis de ARN y proteínas se produce mucho más rápidamente porque se produce en un solo compartimento.
  2. La compartimentación en células procariotas permite la construcción de proteínas y productos de ARN más complejos. En eucariotas, la ventaja es que la síntesis de ARN y proteínas ocurre mucho más rápidamente porque ocurren en un solo compartimiento.
  3. La compartimentación en células eucariotas permite la construcción de proteínas y productos de ARN más simples. En los procariotas, la ventaja es solo proteínas y productos de ARN más simples porque no se necesitan los complejos.
  4. La compartimentación en células eucariotas permite la construcción de proteínas y productos de ARN más complejos. En los procariotas, la ventaja es que la síntesis de ARN y proteínas lleva más tiempo porque ocurre en un solo compartimento.

El tamaño del genoma en uno de los procariotas mejor estudiados, E. coli, es de 4,6 millones de pares de bases (aproximadamente 1,1 mm, si se corta y se estira). Entonces, ¿cómo encaja esto dentro de una pequeña célula bacteriana? El ADN se tuerce mediante lo que se conoce como superenrollamiento. Superenrollamiento significa que el ADN está subenrollado (menos de una vuelta de la hélice por cada 10 pares de bases) o sobreenrollado (más de 1 vuelta por cada 10 pares de bases) desde su estado relajado normal. Se sabe que algunas proteínas están involucradas en el superenrollamiento de otras proteínas y enzimas como la ADN girasa ayudan a mantener la estructura superenrollada.

Los eucariotas, cuyos cromosomas consisten cada uno en una molécula de ADN lineal, emplean un tipo diferente de estrategia de empaquetamiento para encajar su ADN dentro del núcleo (Figura 14.11). En el nivel más básico, el ADN se envuelve alrededor de proteínas conocidas como histonas para formar estructuras llamadas nucleosomas. Las histonas son proteínas conservadas evolutivamente que son ricas en aminoácidos básicos y forman un octámero. El ADN (que está cargado negativamente debido a los grupos fosfato) se envuelve firmemente alrededor del núcleo de las histonas. Este nucleosoma está vinculado al siguiente con la ayuda de un ADN enlazador. Esto también se conoce como estructura de “cuentas en una cuerda”. Esto se compacta aún más en una fibra de 30 nm, que es el diámetro de la estructura. En la etapa de metafase, los cromosomas son más compactos, miden aproximadamente 700 nm de ancho y se encuentran asociados con proteínas de andamio.

En la interfase, los cromosomas eucariotas tienen dos regiones distintas que se pueden distinguir por tinción. La región compacta se conoce como heterocromatina y la región menos densa se conoce como eucromatina. La heterocromatina generalmente contiene genes que no se expresan y se encuentra en las regiones del centrómero y los telómeros. La eucromatina generalmente contiene genes que se transcriben, con ADN empaquetado alrededor de nucleosomas pero no más compactado.

Notas al pie

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    • Autores: Julianne Zedalis, John Eggebrecht
    • Editor / sitio web: OpenStax
    • Título del libro: Biología para cursos AP®
    • Fecha de publicación: 8 de marzo de 2018
    • Ubicación: Houston, Texas
    • URL del libro: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/1-introduction
    • URL de la sección: https://openstax.org/books/biology-ap-courses/pages/14-2-dna-structure-and-sequencing

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    Iniciacion

    El inicio de la replicación ocurre en una secuencia de nucleótidos específica llamada origen de replicación, donde varias proteínas se unen para comenzar el proceso de replicación. E. colitiene un solo origen de replicación (como la mayoría de los procariotas), llamado oriC, en su único cromosoma. El origen de replicación tiene una longitud de aproximadamente 245 pares de bases y es rico en secuencias de adenina-timina (AT).

    Algunas de las proteínas que se unen al origen de la replicación son importantes para hacer que las regiones de ADN monocatenarias sean accesibles para la replicación. El ADN cromosómico generalmente se envuelve alrededor histonas (en eucariotas y arqueas) o proteínas similares a las histonas (en bacterias), y es superenrollado, o bien envuelto y retorcido sobre sí mismo. Este empaquetado hace que la información contenida en la molécula de ADN sea inaccesible. Sin embargo, unas enzimas llamadas topoisomerasas cambian la forma y el superenrollamiento del cromosoma. Para que comience la replicación del ADN bacteriano, el cromosoma superenrollado se relaja topoisomerasa II, también llamado ADN girasa. Una enzima llamada helicasa luego separa las cadenas de ADN rompiendo los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases nitrogenadas. Recuerde que las secuencias de AT tienen menos enlaces de hidrógeno y, por lo tanto, las interacciones de la girasa de ADNv tienen interacciones más débiles que las secuencias de guanina-citosina (GC). Estas enzimas requieren hidrólisis de ATP. A medida que el ADN se abre, las estructuras en forma de Y llamadas horquillas de replicación están formados. Se forman dos horquillas de replicación en el origen de la replicación, lo que permite la replicación bidireccional y la formación de una estructura que parece una burbuja cuando se ve con un microscopio electrónico de transmisión. burbuja de replicación. El ADN cerca de cada horquilla de replicación está recubierto con proteínas de unión monocatenarias para evitar que el ADN monocatenario se rebobine en una doble hélice.

    Una vez que se puede acceder al ADN monocatenario en el origen de la replicación, puede comenzar la replicación del ADN. Sin embargo, el ADN pol III puede agregar nucleótidos solo en la dirección 5 'a 3' (una nueva cadena de ADN solo puede extenderse en esta dirección). Esto se debe a que la ADN polimerasa requiere un grupo 3'-OH libre al que puede agregar nucleótidos formando un enlace fosfodiéster covalente entre el extremo 3'-OH y el fosfato 5 'del siguiente nucleótido. Esto también significa que no puede agregar nucleótidos si no hay disponible un grupo 3'-OH libre, que es el caso de una sola hebra de ADN. El problema se resuelve con la ayuda de una secuencia de ARN que proporciona el extremo libre 3'-OH. Debido a que esta secuencia permite el inicio de la síntesis de ADN, se le llama apropiadamente el cebador. El cebador tiene una longitud de cinco a 10 nucleótidos y es complementario al ADN original o molde. Es sintetizado por ARN primasa, que es un Polimerasa de ARN. A diferencia de las ADN polimerasas, las ARN polimerasas no necesitan un grupo 3'-OH libre para sintetizar una molécula de ARN. Ahora que el cebador proporciona el grupo 3'-OH libre, la ADN polimerasa III ahora puede extender este cebador de ARN, agregando nucleótidos de ADN uno por uno que son complementarios a la hebra molde (Figura 1).


    El recurso de secuenciación del genoma completo identifica 18 nuevos genes candidatos para el trastorno del espectro autista

    Estamos realizando una secuenciación del genoma completo de familias con trastorno del espectro autista (TEA) para construir un recurso (MSSNG) para subcategorizar los fenotipos y los factores genéticos subyacentes involucrados. Aquí reportamos la secuenciación de 5,205 muestras de familias con TEA, acompañadas de información clínica, creando una base de datos accesible en una plataforma en la nube y a través de un portal de internet de acceso controlado. Encontramos un promedio de 73,8 variantes de novo de un solo nucleótido y 12,6 inserciones y deleciones de novo o variaciones en el número de copias por sujeto con TEA. Identificamos 18 nuevos genes candidatos con riesgo de TEA y descubrimos que los participantes que portaban mutaciones en los genes de susceptibilidad tenían una capacidad de adaptación significativamente menor (P = 6 × 10 -4). En 294 de 2620 (11,2%) de los casos de TEA, se pudo determinar una base molecular y el 7,2% de estos tenían variaciones en el número de copias y / o anomalías cromosómicas, lo que enfatiza la importancia de detectar todas las formas de variación genética como dianas diagnósticas y terapéuticas en los TEA. .

    Declaracion de conflicto de interes

    Intereses financieros en competencia: los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

    Cifras

    Figura 1. Esquema de muestra y datos ...

    Figura 1. Esquema del procesamiento de datos y muestras en MSSNG

    Un comité ejecutivo supervisa el ...

    Figura 2. Características y calidad de WGS ...

    Figura 2. Características y calidad de WGS de diferentes plataformas de secuenciación

    Figura 3. Genes / loci de susceptibilidad a TEA

    Figura 3. Genes / loci de susceptibilidad a TEA

    (a) Genes de riesgo de TEA con una tasa de mutación de MSSNG superior a la esperada…

    Figura 4. Caracterización de CNV a través de lecturas WGS ...

    Figura 4. Caracterización de CNV a través de lecturas WGS en el Portal MSSNG

    Figura 5. Comparación de fenotipos para las muestras ...

    Figura 5. Comparación de fenotipos para las muestras con y sin mutaciones identificadas


    Resultados

    Retenemos 175,326 lecturas totales después de un estricto filtrado y recorte de calidad, que van desde 3,965 a 50,063 lecturas en los siete sitios de muestreo. De ellos, 59.705 se identificaron mediante BLAST como secuencias del gen de ARNr 16S. BC07 retuvo el número más bajo de lecturas con 506, mientras que quedaron 27.629 lecturas para BC02. El análisis de Qiime2 mediante vsearch cerrado con un límite de identidad del 80% identificó un total de 53 OTU medusozoos (Figura complementaria 4). A pesar del bajo recuento de lecturas para varias muestras, el análisis de rarefacción por diversidad alfa sugirió que nuestro método era suficiente para evaluar el progreso en la recuperación de eDNA medusozoos representativos por ubicación de muestra, dada nuestra profundidad de secuenciación (Figuras complementarias 5, 6). Una búsqueda BLASTN de nuestro conjunto de datos filtrado de genes de ARNr 16S recuperado arrojó 59 taxones medusozoos únicos, lo que sugiere que pueden ocurrir discrepancias menores con variaciones en la base de datos y el algoritmo (agrupamiento versus homología) utilizados para la clasificación de lectura. Además, aunque las secuencias correspondientes al eDNA para el gen COI fueron en gran medida un objetivo secundario en este estudio, logramos detectar tres OTU medusozoos que comprenden dos hidrozoos y C. frondosa (Los detalles se proporcionan en las Figuras complementarias 5A, B) estos datos no se incorporaron en nuestros análisis de biodiversidad medusozoos.

    Fauna Medusozoan en los Cayos de Florida

    En general, la riqueza de OTU de medusozoos fue más baja en Rock Harbor-BC02 (24 OTU), seguida por el control de acuario-BC04 (15 OTU) (Figuras 6C, D). Buttonwood Sound (BC03) y Finger Pier (BC05), ambos hábitats pelágicos, tuvieron el mayor número de OTU (42) (Figuras 6B, E). En promedio, detectamos 30 OTU de sitios protegidos (BC01 y BC02) y 36 OTU de sitios pelágicos (BC03, BC05, BC06 y BC07) (Figura 6). Aunque Hydrozoa representó la clase con el mayor número de OTU detectadas, en promedio, el 65,2% de las lecturas se asignaron a Scyphozoa, el 26,7% a Hydrozoa, seguido por el 18,6% a Cubozoa, con Staurozoa representado por la menor cantidad de lecturas (0,9%). Con la excepción de Buttonwood Sound, Cassiopea fue consistentemente el taxón más representado (basado en el total de lecturas correspondientes) en cada sitio.

    Figura 6. Mapa que muestra la distribución de especies de medusas en los sitios de muestreo de los Cayos de Florida basado en el gen 16S rRNA. Upper Keys (Key Largo y Marathon Key), muestras de agua (14 de mayo y # x201316, 2018). (a) Sonido Buttonwood (BC03). 25.10143, & # x201380.43861. (B) Cantera (BC01). 24.74975, & # x201380.97812. (C) Rock Harbour (BC02). 25.07924, & # x201380.45245. (D) Acuario (BC04). 25.10135, & # x201380.43861. Lower Keys (Fleming Key), muestras de agua (17 de mayo de 2018). (mi) Muelle de dedo (BC05). 24.57581, & # x201381.79922. (F) Torre SFUWOS FAA (BC06). 24.59015, & # x201381.79704. (gramo) Gota SFUWOS (BC07). 24.59181, & # x201381.79487 No se muestra el control negativo (BC08). Los símbolos rojos corresponden a las ubicaciones de muestreo en el mapa. Los gráficos circulares grandes y multicolores muestran la diversidad de medusozoos detectada en cada sitio y el número total de lecturas de genes de ARNr 16S detectadas por ubicación según el análisis Qiime2. Los porcentajes por encima de los gráficos circulares monocromáticos más pequeños resaltan el porcentaje del total de lecturas correspondiente a Cassiopea y especies cubozoos, respectivamente. Los resultados de la función de gráfico de barras Qiime2 se modificaron y visualizaron aquí usando Krona (Ondov et al., 2011). Los porcentajes reflejan proporciones antes del análisis de rarefacción (normalización de submuestra), que resultó en la pérdida de tres taxones mínimamente representados.

    Cassiopea lecturas se recuperaron de todos los sitios de muestreo, pero la mayoría de las lecturas fueron de sitios protegidos, con C. xamachana lecturas que abarcan el 96,3% de Cassiopea lecturas generadas para Rock Harbor (Figura 6 y Figura complementaria 6). A pesar de que Cassiopea medusas no fueron confirmadas visualmente en Fleming Key, se esperaba la detección de eDNA para este taxón dado que la medusa al revés es la medusa más común en los Cayos de Florida y se ha documentado en los manglares de la vecina Key West, a varios kilómetros de distancia (NOAA , 2020). El análisis filogenético de las lecturas de consenso, según lo determinado por BLASTN, reveló que tres putativos Cassiopea Es probable que haya especies presentes en los Cayos de Florida. C. xamachana domina en los Cayos de Florida con respecto al eDNA detectado (Figura 7) y la confirmación visual (Ohdera et al., 2018), mientras que C. frondosa ocurre con menos frecuencia (Tabla 1).

    Figura 7. Fauna de medusozoos identificada a partir del gen ARNr 16S utilizando FeDS. La tabla destaca las características morfológicas y la residencia en las áreas de muestreo de los Cayos de Florida o la ubicación geográfica más cercana. Los dibujos de líneas a la izquierda representan un taxón representativo para cada clase, dibujado en escala comparativa. Las flechas indican las especies para las que se han publicado genomas parcialmente anotados (Ohdera et al., 2019). BH, altura de campana BW, ancho de campana L, longitud del hidroide W, ancho ND, no hay datos disponibles FLMNH, Museo de Historia Natural de Florida NMNH, Museo Nacional de Historia Natural, Institución Smithsonian.

    Además de Cassiopea, detectamos un segundo género de escifozoos Aurelia, para el cual el consenso de lecturas en el umbral de identidad del 80% (BLASTN) compartió & # x223C86% de similitud con Aurelia Aurita (GenBank DQ787873) & # x2013 un complejo de especies de medusas ampliamente distribuidas conocidas como medusas lunares (Dawson, 2003), con al menos una especie conocida en aguas de Florida (Figura 7). Usando Qiime2, esta coincidencia solo se recuperó usando cortes de identidad porcentuales por debajo del 75%. Curiosamente, el consenso de lecturas en el umbral de identidad del 80% en nuestra búsqueda BLASTN mostró & # x003E98% de identidad con secuencias no publicadas de Aurelia sp. muestras del sur de Brasil (J. Lawley, pers. com.). Por lo tanto, es probable que las secuencias de ADN de las especies que detectamos aún no estén en GenBank, lo que destaca la importancia de construir bases de datos de referencia sólidas de códigos de barras genéticos.

    Las especies venenosas de medusa de caja (Cubozoa) detectadas por metabarcoding de eDNA incluyen taxones de las familias cubozoos Alatinidae y Tamoyidae (Figuras 4 & # x20137). Aunque se informó anteriormente de la región del Caribe y los Cayos de Florida (Figura 7), no se confirmó visualmente ninguna medusa de ninguna de las familias durante este estudio. Como estas medusas de caja son bastante grandes y conspicuas (Figura 7), es concebible que nuestras secuencias correspondan a eDNA de etapas microscópicas de vida (plánulas o pólipos) presentes en los sitios de recolección, en línea con los hallazgos recientes de la señal de eDNA detectada para cnidarios bentónicos. (Sawaya et al., 2019 Bolte et al., 2021). A. alata es la especie mejor documentada de la familia Alatinidae, pero se ha reportado al menos otra en el Golfo de México (Graham, 1998 Lewis et al., 2013 Lasley et al., 2016 Lawley et al., 2016). Nuestros resultados iniciales indicaron que se habían detectado dos especies de Tamoyidae en este estudio: Tamoya cf. haplonema (que coincide con una muestra de New Jersey GenBank KR093033) y una secuencia muy similar de Tamoya ohboya (que coincide con una muestra del Caribe GenBank GQ150263). Tamoya Se han reportado especies anteriormente en esta región geográfica (Collins et al., 2011 Figura 7), aunque se necesitan más estudios para delinear adecuadamente las especies dentro de este género. Si bien se identificaron dos secuencias ejemplares diferentes mediante puntuaciones máximas de BLASTN, las secuencias de consenso de estas lecturas tenían casi un 100% de identidad con la T. cf. haplonema Gen de ARNr de Nueva Jersey. Además, el pequeño cubozoo, Tripedalia cystophora, también se detectó mediante eDNA (como singleton). Descrito por primera vez desde Jamaica, T. cystophora solo recientemente se ha documentado en aguas de Florida (Orellana y Collins, 2011 Lasley et al., 2016). Finalmente, un conjunto de 17 lecturas correspondientes a una especie no identificada de Caribdea (secuencias muy parecidas de las especies del Caribe Carybdea xaymacana), sugieren la presencia de otra especie de jalea de caja aún por describir en los Cayos de Florida (Figura 7).

    Aunque ninguna especie de medusas de acecho bentónico en la clase Staurozoa fue reportada previamente en Florida (Miranda et al., 2018), en este estudio identificamos eDNA de los estaurozoos. Calvadosia cruxmelitensis y Haliclystus cf. tenuis (Figuras 4 y # x20137). El primero es de particular interés ya que su genoma se publicó recientemente junto con el de C. xamachana y A. alata (Ohdera et al., 2019). Los estaurozoos son medusozoos relativamente pequeños (Figura 7), a menudo crípticos y difíciles de encontrar en el campo porque viven y se mezclan bien con las macroalgas. Estas especies son exclusivamente bentónicas, por lo que la presencia de secuencias correspondientes a estos taxones (C. cruxmelitensis representado en cada lugar de muestreo en este estudio) sugiere que FeDS fue capaz de detectar eDNA de especies bentónicas además del de medusas pelágicas. H. tenuis fue descrita originalmente en Japón (Kishinouye, 1910), pero recientemente se ha considerado una especie introducida en el Atlántico norte (Holst y Laakmann, 2019) y nunca se ha reportado desde el Atlántico occidental (Figura 7). C. cruxmelitensis se distribuye a lo largo de las Islas Británicas, mientras que los congéneres son los únicos estaurozoos conocidos que se distribuyen en aguas cálidas tropicales y subtropicales, incluidos informes de C. hawaiiensis de Hawai (Edmondson, 1930), una especie indeterminada de la India (Panikkar, 1944), y C. corbini de Brasil (Grohmann et al., 1999), Puerto Rico (Capriles y Martínez, 1970 Larson, 1980) y el oeste del Golfo de México (Lechuga y Fern & # x00E1ndez - & # x00C1lamo, 2005). Si bien las distribuciones geográficas conocidas de estaurozoos (Miranda et al., 2018) sugerirían que C. corbini es la especie más probable que se encuentre en las aguas de Florida, nuestros datos indican inequívocamente que C. cruxmelitensis habita los Cayos de Florida (Figura 7). Sin embargo, esta afirmación debe confirmarse mediante una inspección visual de los hábitats costeros adecuados de Florida para evaluar una introducción hipotética. En general, estos resultados sugieren que un análisis extenso de eDNA podría hacer avanzar rápidamente nuestra comprensión de la distribución de organismos crípticos.

    Identificamos 36 OTU de Hydrozoa, a pesar de que solo el 15% del total de lecturas se asigna a secuencias de hidrozoos. Varios de estos taxones (por ejemplo, especies de Aglaofenia, Eudendrium, y Halopteris) carecen de una etapa de medusa, lo que proporciona más evidencia de que nuestro muestreo de eDNA capturó taxones bentónicos (Figuras 4, 7). Dada la extensa diversidad de hidrozoos de más de 3500 especies conocidas, incluidas cientos descritas del Caribe, la representación de más del 50% de todas las OTU por taxones de hidrozoos no fue inesperada (Figuras 4, 5).


    Contenido

    Se puede modular cualquier paso de la expresión génica, desde el paso de transcripción de ADN-ARN hasta la modificación postraduccional de una proteína. La siguiente es una lista de etapas en las que se regula la expresión génica, el punto más utilizado es la iniciación de la transcripción:

    En eucariotas, la accesibilidad de grandes regiones de ADN puede depender de su estructura de cromatina, que puede alterarse como resultado de modificaciones de histonas dirigidas por metilación de ADN, ncRNA o proteína de unión a ADN. Por tanto, estas modificaciones pueden regular hacia arriba o hacia abajo la expresión de un gen. Algunas de estas modificaciones que regulan la expresión génica son heredables y se denominan regulación epigenética.

    Edición estructural

    La transcripción del ADN está dictada por su estructura. En general, la densidad de su empaque es indicativa de la frecuencia de transcripción. Los complejos de proteínas octaméricos llamados histonas junto con un segmento de ADN enrollado alrededor de las ocho proteínas histonas (en conjunto denominadas nucleosoma) son responsables de la cantidad de superenrollamiento del ADN, y estos complejos pueden modificarse temporalmente mediante procesos como la fosforilación o de forma más permanente modificado por procesos como la metilación. Se considera que tales modificaciones son responsables de cambios más o menos permanentes en los niveles de expresión génica. [2]

    Química Editar

    La metilación del ADN es un método común de silenciamiento de genes. El ADN es típicamente metilado por enzimas metiltransferasas en nucleótidos de citosina en una secuencia de dinucleótidos CpG (también llamados "islas CpG" cuando están densamente agrupados). El análisis del patrón de metilación en una región determinada del ADN (que puede ser un promotor) se puede lograr mediante un método llamado mapeo de bisulfito. Los residuos de citosina metilados no se modifican con el tratamiento, mientras que los no metilados se cambian a uracilo. Las diferencias se analizan mediante secuenciación de ADN o mediante métodos desarrollados para cuantificar SNP, como Pyrosequencing (Biotage) o MassArray (Sequenom), midiendo las cantidades relativas de C / T en el dinucleótido CG. Se cree que los patrones de metilación anormales están involucrados en la oncogénesis. [3]

    La acetilación de histonas también es un proceso importante en la transcripción. Las enzimas histonas acetiltransferasas (HAT), como la proteína de unión a CREB, también disocian el ADN del complejo de histonas, lo que permite que prosiga la transcripción. A menudo, la metilación del ADN y la desacetilación de histonas trabajan juntas en el silenciamiento de genes. La combinación de los dos parece ser una señal de que el ADN se empaqueta de forma más densa, lo que reduce la expresión génica. [ cita necesaria ]

    Por tanto, la regulación de la transcripción controla cuándo se produce la transcripción y cuánto ARN se crea. La transcripción de un gen por la ARN polimerasa puede regularse mediante varios mecanismos. Los factores de especificidad alteran la especificidad de la ARN polimerasa por un determinado promotor o conjunto de promotores, lo que hace que sea más o menos probable que se una a ellos (es decir, factores sigma usados ​​en la transcripción procariota). Los represores se unen al Operador, codificando secuencias en la hebra de ADN que están cerca o superpuestas a la región promotora, impidiendo el progreso de la ARN polimerasa a lo largo de la hebra, impidiendo así la expresión del gen. La imagen de la derecha muestra la regulación de un represor en el operón lac. Los factores de transcripción generales colocan la ARN polimerasa al comienzo de una secuencia que codifica una proteína y luego liberan la polimerasa para transcribir el ARNm. Los activadores mejoran la interacción entre la ARN polimerasa y un promotor particular, fomentando la expresión del gen. Los activadores hacen esto aumentando la atracción de la ARN polimerasa por el promotor, a través de interacciones con subunidades de la ARN polimerasa o indirectamente cambiando la estructura del ADN. Los potenciadores son sitios en la hélice de ADN que están unidos por activadores para hacer un bucle del ADN que lleva un promotor específico al complejo de iniciación. Los potenciadores son mucho más comunes en eucariotas que en procariotas, donde solo existen algunos ejemplos (hasta la fecha). [4] Los silenciadores son regiones de secuencias de ADN que, cuando están unidas por factores de transcripción particulares, pueden silenciar la expresión del gen.

    En los vertebrados, la mayoría de los promotores de genes contienen una isla CpG con numerosos sitios CpG. [5] Cuando muchos de los sitios CpG promotores de un gen están metilados, el gen se silencia. [6] Los cánceres colorrectales suelen tener de 3 a 6 mutaciones de conductor y de 33 a 66 mutaciones de autoestopista o pasajero. [7] Sin embargo, el silenciamiento transcripcional puede ser más importante que la mutación para provocar la progresión al cáncer. Por ejemplo, en los cánceres colorrectales alrededor de 600 a 800 genes son silenciados transcripcionalmente por la metilación de la isla CpG (ver regulación de la transcripción en el cáncer). La represión transcripcional en el cáncer también puede ocurrir por otros mecanismos epigenéticos, como la expresión alterada de microARN. [8] En el cáncer de mama, la represión transcripcional de BRCA1 puede ocurrir con mayor frecuencia por microARN-182 sobreexpresado que por hipermetilación del promotor BRCA1 (ver Baja expresión de BRCA1 en cánceres de mama y ovario).

    Una de las características cardinales de la adicción es su persistencia. Los cambios de comportamiento persistentes parecen deberse a cambios duraderos, como resultado de alteraciones epigenéticas que afectan la expresión génica, dentro de regiones particulares del cerebro. [9] Las drogas de abuso causan tres tipos de alteraciones epigenéticas en el cerebro. Estos son (1) acetilaciones de histonas y metilaciones de histonas, (2) metilación de ADN en sitios CpG y (3) regulación a la baja o regulación al alza epigenética de microARN. [9] [10] (Consulte Epigenética de la adicción a la cocaína para obtener algunos detalles).

    La ingesta crónica de nicotina en ratones altera el control epigenético de la expresión génica de las células cerebrales mediante la acetilación de histonas. Esto aumenta la expresión en el cerebro de la proteína FosB, importante en la adicción. [11] La adicción al cigarrillo también se estudió en unos 16.000 seres humanos, incluidos los que nunca habían fumado, los fumadores actuales y los que habían dejado de fumar hasta por 30 años. [12] En las células sanguíneas, más de 18.000 sitios CpG (de los aproximadamente 450.000 sitios CpG analizados en el genoma) habían alterado con frecuencia la metilación entre los fumadores actuales. Estos sitios CpG ocurrieron en más de 7.000 genes, o aproximadamente un tercio de los genes humanos conocidos. La mayoría de los sitios CpG metilados diferencialmente regresaron al nivel de nunca fumadores dentro de los cinco años posteriores a la cesación del tabaquismo. Sin embargo, 2.568 CpGs entre 942 genes permanecieron metilados diferencialmente en exfumadores versus nunca fumadores. Estos cambios epigenéticos restantes pueden verse como "cicatrices moleculares" [10] que pueden afectar la expresión génica.

    En modelos de roedores, las drogas de abuso, incluida la cocaína, [13] la metanfeamina, [14] [15] el alcohol [16] y los productos del humo del tabaco, [17] causan daños en el ADN del cerebro. Durante la reparación de daños en el ADN, algunos eventos de reparación individuales pueden alterar la metilación del ADN y / o las acetilaciones o metilaciones de histonas en los sitios del daño y, por lo tanto, pueden contribuir a dejar una cicatriz epigenética en la cromatina. [18]

    Estas cicatrices epigenéticas probablemente contribuyan a los cambios epigenéticos persistentes que se encuentran en la adicción.

    En los mamíferos, la metilación de la citosina (ver Figura) en el ADN es un mediador regulador importante. Las citosinas metiladas se encuentran principalmente en secuencias de dinucleótidos donde a la citosina le sigue una guanina, un sitio CpG. El número total de sitios CpG en el genoma humano es de aproximadamente 28 millones. [19] y generalmente alrededor del 70% de todos los sitios CpG tienen una citosina metilada. [20]

    En una rata, una experiencia de aprendizaje dolorosa, condicionamiento de miedo contextual, puede resultar en un recuerdo atemorizante de por vida después de un solo evento de entrenamiento. [21] La metilación de la citosina está alterada en las regiones promotoras de aproximadamente el 9,17% de todos los genes en el ADN de la neurona del hipocampo de una rata que ha sido sometida a una breve experiencia de condicionamiento del miedo. [22] El hipocampo es donde se almacenan inicialmente los nuevos recuerdos.

    La metilación de CpG en una región promotora de un gen reprime la transcripción [23], mientras que la metilación de CpG en el cuerpo de un gen aumenta la expresión. [24] Las enzimas TET juegan un papel central en la desmetilación de citosinas metiladas. La desmetilación de CpG en un promotor de gen mediante la actividad de la enzima TET aumenta la transcripción del gen. [25]

    Cuando se aplica condicionamiento de miedo contextual a una rata, se producen más de 5.000 regiones metiladas diferencialmente (DMR) (de 500 nucleótidos cada una) en el genoma neural del hipocampo de rata tanto una hora como 24 horas después del condicionamiento en el hipocampo. [22] Esto hace que unos 500 genes se regulen al alza (a menudo debido a la desmetilación de los sitios CpG en una región promotora) y que unos 1000 genes se regulen negativamente (a menudo debido a la 5-metilcitosina recién formada en los sitios CpG en un promotor) región). El patrón de genes inducidos y reprimidos dentro de las neuronas parece proporcionar una base molecular para formar el primer recuerdo transitorio de este evento de entrenamiento en el hipocampo del cerebro de rata. [22]

    Una vez que se transcribe el ADN y se forma el ARNm, debe haber algún tipo de regulación sobre cuánto se traduce el ARNm en proteínas. Las células hacen esto modulando la protección, el empalme, la adición de una cola de poli (A), las tasas de exportación nuclear específicas de la secuencia y, en varios contextos, el secuestro de la transcripción de ARN. Estos procesos ocurren en eucariotas pero no en procariotas. Esta modulación es el resultado de una proteína o transcripción que, a su vez, está regulada y puede tener afinidad por ciertas secuencias.

    Tres regiones primarias no traducidas (3'-UTR) de ARN mensajeros (ARNm) a menudo contienen secuencias reguladoras que influyen postranscripcionalmente en la expresión génica. [26] Tales 3'-UTR a menudo contienen tanto sitios de unión para microARN (miARN) como para proteínas reguladoras. Al unirse a sitios específicos dentro de la 3'-UTR, los miARN pueden disminuir la expresión génica de varios ARNm inhibiendo la traducción o provocando directamente la degradación del transcrito. El 3'-UTR también puede tener regiones silenciadoras que se unen a proteínas represoras que inhiben la expresión de un ARNm.

    El 3'-UTR a menudo contiene elementos de respuesta de miARN (MRE). Los MRE son secuencias a las que se unen los miARN. Estos son motivos prevalentes dentro de 3'-UTR. Entre todos los motivos reguladores dentro de los 3'-UTR (por ejemplo, incluidas las regiones silenciadoras), los MRE constituyen aproximadamente la mitad de los motivos.

    A partir de 2014, el sitio web miRBase, [27] un archivo de secuencias y anotaciones de miARN, enumeró 28.645 entradas en 233 especies biológicas. De estos, 1.881 miARN estaban en loci de miARN humanos anotados. Se predijo que los miARN tenían un promedio de aproximadamente cuatrocientos ARNm diana (que afectaban la expresión de varios cientos de genes). [28] Freidman y col. [28] estiman que & gt45,000 sitios diana de miARN dentro de los ARNm 3'-UTR humanos se conservan por encima de los niveles de fondo, y & gt60% de los genes codificadores de proteínas humanas han estado bajo presión selectiva para mantener el apareamiento con los miARN.

    Los experimentos directos muestran que un solo miRNA puede reducir la estabilidad de cientos de mRNA únicos. [29] Other experiments show that a single miRNA may repress the production of hundreds of proteins, but that this repression often is relatively mild (less than 2-fold). [30] [31]

    Los efectos de la desregulación de la expresión génica por miARN parecen ser importantes en el cáncer. [32] For instance, in gastrointestinal cancers, a 2015 paper identified nine miRNAs as epigenetically altered and effective in down-regulating DNA repair enzymes. [33]

    The effects of miRNA dysregulation of gene expression also seem to be important in neuropsychiatric disorders, such as schizophrenia, bipolar disorder, major depressive disorder, Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorders. [34] [35] [36]

    The translation of mRNA can also be controlled by a number of mechanisms, mostly at the level of initiation. Recruitment of the small ribosomal subunit can indeed be modulated by mRNA secondary structure, antisense RNA binding, or protein binding. In both prokaryotes and eukaryotes, a large number of RNA binding proteins exist, which often are directed to their target sequence by the secondary structure of the transcript, which may change depending on certain conditions, such as temperature or presence of a ligand (aptamer). Some transcripts act as ribozymes and self-regulate their expression.

      is a process in which a molecule (e.g., a drug) induces (i.e., initiates or enhances) the expression of an enzyme.
  • The induction of heat shock proteins in the fruit fly Drosophila melanogaster.
  • The Lac operon is an interesting example of how gene expression can be regulated.
  • Viruses, despite having only a few genes, possess mechanisms to regulate their gene expression, typically into an early and late phase, using collinear systems regulated by anti-terminators (lambda phage) or splicing modulators (HIV).
  • Gal4 is a transcriptional activator that controls the expression of GAL1, GAL7, and GAL10 (all of which code for the metabolic of galactose in yeast). The GAL4/UAS system has been used in a variety of organisms across various phyla to study gene expression. [37]
  • Biología del desarrollo Editar

    A large number of studied regulatory systems come from developmental biology. Ejemplos incluyen:

    • The colinearity of the Hox gene cluster with their nested antero-posterior patterning
    • Pattern generation of the hand (digits - interdigits): the gradient of sonic hedgehog (secreted inducing factor) from the zone of polarizing activity in the limb, which creates a gradient of active Gli3, which activates Gremlin, which inhibits BMPs also secreted in the limb, results in the formation of an alternating pattern of activity as a result of this reaction-diffusion system.
    • Somitogenesis is the creation of segments (somites) from a uniform tissue (Pre-somitic Mesoderm). They are formed sequentially from anterior to posterior. This is achieved in amniotes possibly by means of two opposing gradients, Retinoic acid in the anterior (wavefront) and Wnt and Fgf in the posterior, coupled to an oscillating pattern (segmentation clock) composed of FGF + Notch and Wnt in antiphase. [38]
    • Sex determination in the soma of a Drosophila requires the sensing of the ratio of autosomal genes to sex chromosome-encoded genes, which results in the production of sexless splicing factor in females, resulting in the female isoform of doublesex. [39]

    Up-regulation and down-regulation Edit

    Up-regulation is a process that occurs within a cell triggered by a signal (originating internal or external to the cell), which results in increased expression of one or more genes and as a result the protein(s) encoded by those genes. Conversely, down-regulation is a process resulting in decreased gene and corresponding protein expression.

      occurs, for example, when a cell is deficient in some kind of receptor. In this case, more receptor protein is synthesized and transported to the membrane of the cell and, thus, the sensitivity of the cell is brought back to normal, reestablishing homeostasis. occurs, for example, when a cell is overstimulated by a neurotransmitter, hormone, or drug for a prolonged period of time, and the expression of the receptor protein is decreased in order to protect the cell (see also tachyphylaxis).

    Inducible vs. repressible systems Edit

    Gene Regulation can be summarized by the response of the respective system:

    • Inducible systems - An inducible system is off unless there is the presence of some molecule (called an inducer) that allows for gene expression. The molecule is said to "induce expression". The manner by which this happens is dependent on the control mechanisms as well as differences between prokaryotic and eukaryotic cells.
    • Repressible systems - A repressible system is on except in the presence of some molecule (called a corepressor) that suppresses gene expression. The molecule is said to "repress expression". The manner by which this happens is dependent on the control mechanisms as well as differences between prokaryotic and eukaryotic cells.

    The GAL4/UAS system is an example of both an inducible and repressible system. Gal4 binds an upstream activation sequence (UAS) to activate the transcription of the GAL1/GAL7/GAL10 cassette. On the other hand, a MIG1 response to the presence of glucose can inhibit GAL4 and therefore stop the expression of the GAL1/GAL7/GAL10 cassette. [40]

    Theoretical circuits Edit

    • Repressor/Inducer: an activation of a sensor results in the change of expression of a gene
    • negative feedback: the gene product downregulates its own production directly or indirectly, which can result in
      • keeping transcript levels constant/proportional to a factor
      • inhibition of run-away reactions when coupled with a positive feedback loop
      • creating an oscillator by taking advantage in the time delay of transcription and translation, given that the mRNA and protein half-life is shorter
      • signal amplification
      • bistable switches when two genes inhibit each other and both have positive feedback
      • pattern generation

      In general, most experiments investigating differential expression used whole cell extracts of RNA, called steady-state levels, to determine which genes changed and by how much. These are, however, not informative of where the regulation has occurred and may mask conflicting regulatory processes (see post-transcriptional regulation), but it is still the most commonly analysed (quantitative PCR and DNA microarray).

      When studying gene expression, there are several methods to look at the various stages. In eukaryotes these include:


      In the early days (1970s), scientists were not worried about having to align too many sequences. They wanted to find the best alignment between two sequences. Many bioinformatics courses start with learning these, although it is not the main focus of our course. We included two videos in case you are interested.

      The Needlemen-Wunsch algorithm is the earliest algorithm to find the alignment between two sequences and score their similarity.

      When two sequences are long, and only a portion of them can align well with each other, the Smith-Waterman algorithm can find the best local sequence alignment. It is still considered the best alignment approach, although it is slow.


      11.2: DNA Sequencing - Biology

      Google Classroom codes for second Semester

      Tests and Quiz

      Chapter 14 Test -EVEN ONLY

      Chapter 14 Test - ODD ONLY

      Assignment and Video Links

      Make Up Tests

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      Extra Credit Assignments and Publisher Practice Tests

      Self-Check Quiz zes to help you study for your tests.

      An excellent way to study for your tests is to complete

      the chapters which we are covering this semester.

      Practice Test s to help you prepare for your tests and FINAL EXAM.

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      Dear Biology Students,

      Welcome to second semester. Everyone begins with a 100 % and my goal is to help you keep an A grade in this class. You will see a sign up in my class that states "Have Fun but also get your work done" , I reall mean that. If you have any questions or need help please ask. Remember to Check Google Classroom for all your assignments and due dates and keep in mind that unexcused late work will no longer be accepted this semester.


      Tabla de contenido

      Prefacio
      Expresiones de gratitud
      1. The Basics of Molecular Biology
      2. The Tools of the Molecular Biologist
      3. General Preparations, Procedures, and Considerations for Use of Manual
      Section 3-1 Using This Manual
      3-2 Safety Considerations
      3-3 Equipment Needed for Molecular Biology Studies
      4. Cloning Vectors and Bacterial Cells
      Section 4-1 pBR322
      4-2 M13
      4-3 pUC
      4-4 λgtlO
      4-5 λgtll
      4-6 EMBL3 and EMBL4
      4-7 Charon 28
      4-8 Bacterial Strains
      5. Preparation of DNA from Eukaryotic Cells
      Section 5-1 Rapid DNA Preparation
      5-2 Preparation of DNA from Eukaryotic Cells: General Method
      5-3 DNA Preparation from Cultured Cells and Tissue
      5-4 Restriction Endonucleases (REs) and Their Use
      5-5 Agarose Gel Electrophoresis
      5-6 Southern Blot
      6. Probing Nucleic Acids with Labeled Synthetic Probes
      Section 6-1 Making Synthetic DNA Probes: General Description
      6-2 End Labeling of Synthetic Probes
      6-3 Hybridization with Synthetic 32P End-Labeled Probe
      7. Probing Nucleic Acids with Plasmid-Derived Probes
      Section 7-1 Nick Translation
      7-2 DNA Hybridization (Southern Blot Hybridization)
      8. Plasmid DNA Preparation
      Section 8-1 Transformation of Bacteria
      8-2 Plasmid DNA Preparation: Triton-Lysozyme Method
      8-3 Large-Scale Alkaline Lysis Method: Plasmid Purification
      8-4 Plasmid "Mini-Prep" Method
      9. DNA Restriction Fragment Preparation
      Section 9-1 Minigels 1
      9-2 Analysis of DNA Fragments After Enzymatic Cleavage: Agarose Gel Electrophoresis
      9-3 Electroelution
      9-4 Polyacrylamide Gel Electrophoresis of DNA Restriction Fragments
      10. Purification of DNA
      Section 10-1 Spermine Purification of DNA
      10-2 Glass Powder Elution of DNA
      10-3 Purification of DNA: Other Methods
      11. Preparation and Analysis of RNA from Eukaryotic Cells
      Section 11-1 Guanidine Isothiocyanate Preparation of Total RNA
      11-2 RNA Preparation: Mini Method
      11-3 Selection of Poly(A+) RNA on Oligo(dT) Cellulose
      11-4 Formaldehyde Gel for Electrophoretic Separation of RNA and Northern Blot
      11-5 "Dot Blot" Hybridization of Labeled Probe to DNA or RNA Samples
      11-6 Probing RNA Gels: General Notes
      11-7 Preparation of RNA Probes from DNA Cloned into Plasmids
      12. Preparation of DNA from Bacteriophage Clones
      Section 12-1 Growth and Preparation of Bacteriophage
      12-2 Large-Scale Preparation and Purification of DNA from Bacteriophage
      13. Cloning DNA from the Eukaryotic Genome
      Section 13-1 Cloning DNA from the Eukaryotic Genome: Introduction
      13-2 Preparation of Genomic DNA: Partial Mbol Digestion Method
      13-3 Preparation of Bacteriophage Vector for Genomic Cloning
      13-4 Ligation of Genomic DNA into Bacteriophage Arms and Packaging to Form Library
      13-5 Titering and Plating of Packaged Library
      13-6 Screening a Plated Library with Radiolabeled Probes
      13-7 Library Amplification
      14. cDNA Cloning into λgtlO and λgt11
      Section 14-1 Preparation of λgt10 and λgt11 cDNA Cloning Vectors
      14-2 Generation of cDNA Insert from Eukaryotic mRNA
      14-3 Ligation and Packaging of cDNA Library into λgt10 or λgt11 Arms
      14-4 Plating and Screening of λgt10 and λgt11 Packaged Inserts
      14-5 Preparation of DNA from λgt10 and λgt11 cDNA Clones
      15. Subcloning into Plasmids
      Section 15-1 Subcloning into Plasmids: General Notes
      15-2 Preparing pBR322 Plasmids for Subcloning and Ligation of Insert
      15-3 pBR322 Colony Hybridization
      15-4 Subcloning into pUC Plasmids
      16. M13 Cloning and Sequencing
      Section 16-1 M13 Cloning and Sequencing: General Notes
      16-2 Preparation of Insert for Cloning from Specific Restriction Sites
      16-3 Preparation of Insert for Μ13 Cloning by Successive BAL 31 Exonuclease Deletion
      16-4 Μ13 Vector Preparation and Ligation of Insert into Vector
      16-5 Transformation of M13 into JM103 E. coli Host
      16-6 Screening Μ13 Clones with a Radiolabeled Probe to Select Inserts for Sequencing
      16-7 Preparation of Single-Stranded Μ13 DNA for Sequencing
      16-8 Single-Lane Screen Analysis of Μ13 Clones
      16-9 Preparation of Polyacrylamide Sequencing Gel
      16-10 Sequencing Μ13 Clones
      17. Further Characterization of Cloned DNA
      Section 17-1 Si Nuclease Protection Assay
      18. Transfection of Mammalian Cells in Culture
      Section 18-1 Calcium Phosphate Transfection of Nonadherent and Adherent Cells with Purified Plasmids
      18-2 DEAE Dextran-Mediated Transfection of Nonadherent and Adherent Mammalian Cells
      18-3 Electroporation
      18-4 Selection of Transfected Mammalian Cells: The G418 Method
      18-5 Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) Assay
      19. Protein Methods
      Section 19-1 In Vitro Translation and Immunoprecipitation
      19-2 Polyacrylamide Gels for Protein Separation
      19-3 Western Blot Analysis
      19-4 Silver Staining of Gels for Proteins or RNA
      20. General Methods
      Section 20-1 DNA/RNA Extraction and Precipitation
      20-2 Plastic Bag Sealing
      20-3 Optical Density Analytical Measurements
      20-4 Photographing Gels or Autoradiograms
      20-5 Autoradiography
      20-6 Making Plates for Bacterial Growth
      20-7 Titering and Plating of Phage
      21. Specialized Methods
      Section 21-1 Transgenic Mouse Preparation
      21-2 Monoclonal Antibody Production: Hybridoma Fusion
      21-3 In Situ Hybridization of Labeled Probes to Tissue Sections
      21-4 Cloning into Yeast
      Appendix I Stock Solutions
      Appendix II Enzymes
      Appendix III Suppliers of Reagents and Equipment
      Índice


      Ver el vídeo: Sanger Sequencing of DNA Legendado PT (Octubre 2022).