Información

Un número de gen de la base de la mosca (FBgn), muchas identificaciones de Affymetrix

Un número de gen de la base de la mosca (FBgn), muchas identificaciones de Affymetrix


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Estoy tratando de convertir un conjunto de ID de Affymetrix, como este 143053_at_3745, a Flybase Gene Numbers (FBgn) como este FBgn0000015. He descargado el archivo Flybase requerido para hacerlo (como se describe aquí) pero he notado que la mayoría de los FBgn tienen más de una identificación Affy asociada.

Mi pregunta es, ¿cómo sé cuál asignar a mis datos? De la lista de affy-ids que tengo, ¿cómo etiqueto cada uno con el apropiado FBgn? Estoy usando datos de Ayroles et al 2009 (DGRP) que tiene una columna de AffyID que se parece a las del archivo Flybase pero más corta (1638273_at). Quizás no entiendo por qué habría más de uno.

Algunos tienen un ID de affy que se repite en 15 columnas en el archivo, mientras que algunos parecen tener varios ID de affy asociados.

Algunas preguntas que plantea este problema:

¿Por qué un identificador FBgn singular tiene más de un identificador affy asociado?

¿Por qué algunos conjuntos de datos, como el conjunto de datos que tengo, tienen versiones más cortas del identificador affy?

¿Dónde puedo encontrar una lista actualizada y apropiada que coincida correctamente con estos identificadores de Affy y los identificadores de FBgn?


Puedo responder a esto: es posible que no tenga tiempo para examinar el archivo al que está apuntando ... pero aquí hay una explicación: lmk si necesita más.

Los nombres más cortos (123456_at) son los nombres originales de los conjuntos de sondas que dio Affymetrix. El archivo sobre el que pregunta se ha ampliado para el propósito de FlyBase y solo soy vagamente consciente de su existencia. Parece que Flybase ha intentado cambiar el nombre del conjunto de sondas a una lista mínima de genes y crear asignaciones menos ambiguas. No estoy familiarizado con eso. Si tengo tiempo, intentaré mirarlo y poner algo aquí, pero esta semana estoy bastante mal.

En general, debe saber que existe una relación de muchos a muchos entre los conjuntos de sondas de las matrices y los genes.

Hay algunas razones para esto. Las razones más comunes:

Más de un conjunto de sondas por gen 1) Más de una secuencia inicial por gen. Las matrices IVT como las que está viendo leen solo el extremo 3 'del gen. Si hay más de uno de esos terminales, tendrá más de un conjunto de sondas. 2) Genes duplicados. Si el extremo 3 'del gen se ha duplicado recientemente, entonces un conjunto de sondas puede leer más de un gen y no ser capaz de distinguirlos, por lo que tendrá referencias de ambos genes en sus archivos de anotaciones. 3) Conjuntos de sondas duplicados. Para matrices más antiguas, esto sucedió donde las sondas en dos conjuntos de sondas serán en su mayor parte o totalmente iguales. 4) genes que antes estaban separados ahora se unen en un solo gen. Esto es similar a (1) anterior, pero con la razón adicional de que actualmente se sabe que dos transcripciones vecinas vistas por separado en el momento del diseño de la matriz forman parte de la misma transcripción. Esto es algo en lo que a menudo no pensamos, pero es posible que la matriz se haya diseñado antes de que su gen de interés actual tuviera una secuencia completa.

En varios casos, el comportamiento de transcripción de los dos conjuntos de sondas será bastante diferente y puede decidir cuál tomar basándose en cómo se comporta experimentalmente. por ejemplo, es posible que uno de los conjuntos de sondas nunca responda, mientras que otro puede registrar grandes cambios con las condiciones biológicas de la muestra. Lo siento, no puedo ser de más ayuda aquí. Hay demasiados escenarios posibles para considerar para escribir de manera convincente.

Más de un gen por conjunto de sondas 1) un solo tramo de ADN, incluso en la misma hebra, puede simplemente estar asociado con más de un gen y el conjunto de sondas leerá ambos. 2) Incluso si no son exactamente iguales, algunos genes se parecen entre sí en la secuencia de nucleótidos, por lo que es imposible elegir sondas que no los lean a ambos.

Dado que tienen una longitud de lectura similar a un conjunto de sondas, todo esto también es cierto hasta cierto punto para los secuenciadores NGS de lectura corta en datos RNASeq.

Como puede ver con suerte, la ambigüedad es algo que debe esperar hasta cierto punto al decidir trabajar con un sistema biológico. En muchos casos (~ 80%) tendrá una sola lectura de gen por conjunto de sondas, pero con esas probabilidades, estará buscando en el navegador del genoma media docena de sus resultados experimentales favoritos.


Un número de gen de la base de la mosca (FBgn), muchas identificaciones de Affymetrix - Biología

Clasificación: proteasa específica de ubiquitina

El sistema visual de Drosophila proporciona un poderoso sistema genético para analizar los mecanismos celulares y moleculares que regulan la selección de los axones. El ojo compuesto comprende

750 ommatidios, cada uno de los cuales contiene ocho neuronas fotorreceptoras (células R R1-R8). Cada clase de células R forma conexiones específicas con neuronas en dos ganglios diferentes en el lóbulo óptico, la lámina y la médula. Los axones R1-R6 terminan en la lámina, mientras que los axones R7 y R8 atraviesan la lámina y se detienen en la médula. Cuando los axones de las células R entran en la lámina, se encuentran con células gliales y neuronas. non-stop (que codifica una proteasa específica de ubiquitina) se aisló en un cribado genético de defectos de proyección de células R (Martin, 1995). se requiere ininterrumpido para el desarrollo de las células gliales y erizo para el desarrollo neuronal. La eliminación de las células gliales pero no de las neuronas interrumpe el direccionamiento de R1-R6. Se propone que las células gliales proporcionen la señal de parada inicial que promueve la terminación del cono de crecimiento en la lámina. Estos hallazgos descubren una función novedosa para las interacciones neuronal-glial en la regulación de la especificidad del objetivo (Poeck, 2001).

La selección de la capa objetivo ocurre durante el desarrollo larvario. En esta etapa, el área objetivo de la lámina consiste en células gliales y neuronas. Los conos de crecimiento R1-R6 terminan entre filas de células gliales epiteliales y marginales. Los cuerpos celulares de las neuronas de la lámina forman columnas por encima de la lámina del plexo. Estas neuronas representan los futuros socios sinápticos de los axones R1-R6 en el adulto. Aunque los conos de crecimiento de las células R terminan dentro de la lámina del plexo en la larva, no forman sinapsis hasta unos cuatro días después, durante la segunda mitad del desarrollo de la pupa (Poeck, 2001).

La formación del patrón de proyección de las células R se basa en interacciones bidireccionales complejas entre los axones de las células R y diferentes poblaciones de células en el objetivo. Los axones de las células R proporcionan señales anterógradas (incluidos el ligando Hedgehog y Spitz) para inducir la proliferación y diferenciación de las neuronas de la lámina, así como la diferenciación y migración de las células gliales. A su vez, las neuronas de la lámina, las células gliales o ambos tipos de células pueden proporcionar señales retrógradas que actúan como señales de orientación para los axones de las células R. Los genes que codifican receptores, moléculas de señalización y factores nucleares que actúan dentro de las células R controlan la selección del objetivo. No se han identificado ni las señales de direccionamiento ni las células que las producen en la lámina. Si bien se ha propuesto que las células gliales actúen como objetivos intermedios para los conos de crecimiento R1-R6, basándose en sus posiciones características en la lámina, esta hipótesis no se ha abordado críticamente. Se ha demostrado que la pérdida de células gliales pero no de neuronas en una etapa temprana del desarrollo de la lámina da como resultado un error de orientación de R1-R6. Estos hallazgos proporcionan evidencia de que las células gliales pueden regular la especificidad diana de las conexiones neuronales (Poeck, 2001).

Non-stop se expresa en el citoplasma de las células del lóbulo óptico y del cerebro central. Sin embargo, se observan niveles más altos de expresión en las células precursoras de la lámina pero no en las neuronas de la lámina diferenciadas. Non-stop también se expresa a niveles más altos en las células gliales marginales, epiteliales y medulares adyacentes a la lámina del plexo. Basado en el patrón de expresión, sin escalas podría funcionar en las LPC para controlar tanto el direccionamiento de R1-R6 como la migración de células gliales. Alternativamente, sin escalas podría funcionar directamente en las células de la lámina gliales para promover su migración. El fracaso para migrar conduce a la pérdida de objetivos intermedios y al error de orientación de R1-R6. Uno de los objetivos de la investigación fue distinguir entre estas posibilidades y se utilizaron dos enfoques genéticos diferentes. Primero, la capacidad de expresión dirigida de sin escalas a las células gliales, utilizando el sistema GAL4 / UAS para rescatar los fenotipos mutantes. Dado que la expresión basal de UAS-sin escalas (es decir, en ausencia de GAL4 impulsado en las células de la lámina gliales) es suficiente para rescatar tanto la migración de las células gliales como los defectos de dirección, este enfoque para resolver el problema no es posible. Por lo tanto, el sistema FLP / FRT se utilizó para generar clones de células de la lámina glial o neuronas (y sus precursores) mutantes homocigotos para sin escalas en un tipo salvaje (no 1 / +) fondo. A choque térmico-FLP (hsFLP) el transgén proporcionó recombinasa en células mitóticamente activas en el área objetivo. Los animales portaban un gen expresado en todas las células, que codificaba la proteína verde fluorescente bajo el control de un promotor de ubiquitina (Ub-GFP). Como resultado de la recombinación mitótica, sin escalas las células mutantes homocigotas no expresaron GFP las células heterocigotas expresaron niveles moderados de GFP, ya que llevan una sola copia del gen marcador y los clones de tipo salvaje, que llevan dos copias de Ub-GFP, fueron identificados por sus niveles de expresión más altos. sin escalas Los clones mutantes homocigotos se compararon con los clones de control creados de la misma manera utilizando una FRT de tipo salvaje en lugar de una no 1 Cromosoma FRT (Poeck, 2001).

Los complejos ojo-cerebro se tiñeron con mAb24B10 para visualizar los axones de las células R y con anti-Repo para identificar las células gliales. Aproximadamente el 10% de todos los animales examinados contenían clones en el área objetivo. En animales de mosaico con clones en precursores de láminas y neuronas de láminas, el patrón de proyección de células R parecía normal. Además, debajo de estos clones se formaron filas normales de células gliales epiteliales, marginales y medulares de tipo salvaje. Esto indica que sin escalas no se requiere en las neuronas de la lámina para regular el direccionamiento de R1-R6 o el desarrollo de células gliales (Poeck, 2001).

Las células gliales se generan en las áreas de GPC y migran a sus posiciones adyacentes a la lámina del plexo. En aproximadamente la mitad de las muestras de control de tipo salvaje, los clones de células gliales eran grandes y contenían al menos cinco células gliales epiteliales o marginales. Las áreas de GPC mostraron clones de tamaños variables, con células sin marcar junto a grupos de células marcadas que llevaban una o dos copias de GFP. La región adyacente a la línea media dorsoventral cercana a la superficie del lóbulo óptico parece dar lugar a clones especialmente grandes. Además, se observó que 21 de 23 clones consistían en células gliales tanto epiteliales como marginales, dos clones pequeños contenían sólo células gliales epiteliales (Poeck, 2001).

El número de sin escalas Las células epiteliales y gliales marginales mutantes que bordean la lámina del plexo se redujeron notablemente en comparación con los clones de control. En los clones de control de tipo salvaje, se contaron 203 células no marcadas en 23 clones. En contraste, en sin escalas clones mutantes, había 125 células en 39 clones examinados. Esto representa una diferencia de aproximadamente 3 veces. Además, para las células gliales marginales, esta diferencia fue de 10 veces en los clones de tipo salvaje, había 71 células en 23 clones, mientras que había 11 células en 39 sin escalas clones mutantes. los sin escalas Los clones mutantes y de control en el área de GPC eran similares tanto en tamaño como en frecuencia. En seis casos, aunque homocigotos sin escalas los clones estaban presentes en las áreas de GPC, no había células gliales mutantes en la diana. Por el contrario, se observaron células gliales marginales y epiteliales no marcadas a lo largo de la lámina del plexo en todos los clones de tipo salvaje examinados. Bloques de sin escalas Nunca se observaron células gliales mutantes adyacentes a la lámina del plexo. Presumiblemente, en los animales mosaico, las células de tipo salvaje migran a estas regiones, reemplazando eficazmente las células gliales mutantes y rescatando el defecto de dirección R1-R6 observado en sin escalas mutantes. Estos datos apoyan un modelo en el que sin escalas se requiere en las células gliales, sus precursores u otros tipos de células dentro del área GPC para la migración de células gliales epiteliales y marginales desde la GPC al área objetivo (Poeck, 2001).

Si bien los estudios de mosaico genético establecieron que sin escalas se requiere en las células gliales para su migración, era formalmente posible que sin escalas se requirió en las neuronas de la lámina para mediar la terminación R1-R6 en la lámina. Para evaluar críticamente este problema, se intentó eliminar las neuronas de la lámina de la región objetivo. Si sin escalas fueron necesarios en las neuronas de las láminas, luego la eliminación completa de las neuronas de las láminas debería conducir a una orientación errónea de R1-R6. erizo 1 (hh 1 ) es una mutación reguladora que afecta específicamente al sistema visual. En hh 1 ,

Se forman 12 filas de grupos de células R con axones de células R, sin embargo, carecen de Hh y no inducen neuronas de la lámina. Por el contrario, la migración y diferenciación de las células gliales no dependen de la señalización de Hh. Se visualizó un subconjunto de axones R1-R6 en hh 1 mutantes, usando el marcador Ro-taulacZ. Estos axones se detuvieron en la lámina, a pesar de la ausencia de neuronas de la lámina, como se detectó usando un anticuerpo contra Dachshund. El marcado con mAb24B10 para visualizar todos los axones de células R reveló que la matriz de conos de crecimiento R7 y R8 en la médula era indistinguible del tipo salvaje. Estos hallazgos demuestran que el direccionamiento inicial de los axones R1-R6 no requiere neuronas laminares (Poeck, 2001).

Se desconocen los mecanismos que controlan la migración de las células gliales en la lámina y las vías moleculares implicadas. Ese sin escalas codifica una proteasa específica de ubiquitina sugiere que las vías de degradación de proteínas pueden desempeñar un papel importante en este proceso. En la ruta ubiquitina-proteasoma, las proteínas se dirigen a la degradación del proteasoma 26S después de ser "etiquetadas" con ubiquitina. La modificación de ubiquitina es reversible. La desubiquitinación está catalizada por dos familias de proteasas específicas, las hidrolasas de ubiquitina-C-terminal y las proteasas específicas de ubiquitina (UBP). Si bien estas familias son estructuralmente distintas, tienen funciones superpuestas. Non-stop está relacionado con la segunda familia debido a dos secuencias consenso conservadas dentro del dominio catalítico, los dominios Cys e His. Se ha demostrado que las UBP desempeñan diversas funciones al inhibir o estimular la degradación de proteínas. Pueden prevenir la degradación de proteínas y revertir la modificación de la ubiquitina para "corregir" proteínas ubiquitinadas por error o para regular la estabilidad de las proteínas al antagonizar la actividad del proteasoma. También se ha descubierto que las UBP estimulan la degradación de las proteínas editando el tamaño de las cadenas de poliubiquitina, liberando ubiquitina después de que la proteína se ha dirigido al proteasoma o desarmando las cadenas de poliubiquitina para restaurar el conjunto celular de ubiquitina libre (Poeck, 2001).

La observación de que las proteínas ubiquitinadas adicionales se acumulan en las larvas mutantes es coherente con el hecho de que actúa sin parar como UBP. Además, la mejora de los defectos de focalización en sin escalas Los mutantes que resultan de eliminar una sola copia de un gen que codifica una subunidad del proteosoma sugieren que Non-stop promueve la degradación de proteínas. Desde la perdida de sin escalas da como resultado un defecto específico en el sistema visual en desarrollo, puede regular los niveles de sustratos específicos necesarios para la migración de las células gliales. De hecho, otra UBP de Drosophila, Ubiquitin-63E, controla la migración de las células fronterizas durante la ovogénesis indirectamente estabilizando el factor de transcripción C / EBP (R & oslashrth, 2000). También existe un precedente para la regulación dependiente de ubiquitina de proteínas de señalización, como los receptores de la superficie celular y los reguladores citoesqueléticos, que pueden estar directamente involucrados en la migración celular (Poeck, 2001).

sin escalas Las mutaciones proporcionan un reactivo clave para abordar el requisito celular para el direccionamiento R1-R6. Pérdida de función sin escalas las mutaciones interrumpen selectivamente el desarrollo de las células gliales en una etapa temprana. Durante el tiempo que se generan las células gliales en la región precursora, se interrumpe la migración hacia la lámina en desarrollo. Como tal, grandes regiones de la lámina diana están agotadas de células gliales. Los análisis de mosaico genético argumentan que la clasificación errónea de R1-R6 resulta de una pérdida de células gliales en el objetivo de la lámina y no de un requisito de sin escalas en los axones de las células R o en las neuronas de la lámina. El hecho de que las neuronas de la lámina sean prescindibles para el direccionamiento R1-R6 está respaldado por el análisis de erizo 1 mutantes en los que la selección de capas es normal en ausencia de neuronas laminares. El análisis genético, sin embargo, no permite la exclusión de la posibilidad formal (aunque poco probable) de que sin escalas funciona en las células gliales en dos procesos distintos para regular la migración y el direccionamiento R1-R6 por separado (Poeck, 2001).

No se pudieron determinar las contribuciones relativas de las células epiteliales, marginales y de la médula glial en el direccionamiento de R1-R6, ya que las tres parecen afectadas en sin escalas mutantes. Su morfología, sin embargo, sugiere que tienen diferentes funciones. Los conos de crecimiento R1-R6 en la lámina del plexo están en contacto íntimo con una franja densa de procesos de células gliales de la glía epitelial y marginal, pero no con procesos de la glía medular. Es probable que las células gliales marginales emitan las señales de parada, ya que los axones R1-R6 crecen más allá de las células gliales epiteliales pero terminan a lo largo de la cara distal de las células gliales marginales. Además, tanto las células epiteliales como las gliales marginales pueden proporcionar señales a los conos de crecimiento R1-R6, "manteniéndolos" en su lugar. El óxido nítrico (ver Óxido nítrico sintasa de Drosophila) juega un papel importante en el mantenimiento de la posición de los axones R7 y R8 dentro del neurópilo de la médula durante el desarrollo temprano de la pupa y esto plantea la intrigante posibilidad de que un mecanismo similar pueda mantener las neuronas R1-R6 dentro de la lámina (Poeck , 2001).

En resumen, el requisito de sin escalas en el desarrollo de las células gliales, el fracaso de los conos de crecimiento R1-R6 para terminar en la lámina en sin escalas mutantes y la estrecha asociación entre las células de la lámina glial y los conos de crecimiento R1-R6 en la lámina del plexo argumentan que las células epiteliales y gliales marginales proporcionan señales de orientación para las neuronas R1-R6 (Poeck, 2001)

La existencia de objetivos intermedios es esencial para generar patrones específicos de conexiones de células R. Estos objetivos proporcionan un medio para retrasar la formación de conexiones neuronales hasta que se hayan formado los futuros socios sinápticos de las células R, las neuronas de la lámina. Los axones R1-R6 se proyectan desde el primordio del ojo de forma secuencial hasta su capa objetivo durante el desarrollo larvario. Los conos de crecimiento de las células R dentro del mismo ommatidio forman un grupo compacto ubicado entre las células epiteliales y gliales marginales y se detienen dentro de esta región durante el desarrollo temprano de la pupa. Los axones de células R que llegan temprano esperan unas 70 horas, mientras que los axones que llegan más tarde se detienen durante unas 36 horas. Durante este período, las neuronas de la lámina se ensamblan en columnas, adoptan destinos celulares específicos (es decir, L1-L5) y proyectan axones a través del plexo de la lámina y dentro de la médula. La maduración de las neuronas de la lámina se refleja en la expresión del marcador molecular Elav. Este marcador se ve inicialmente en células individuales dentro de las columnas más cercanas al surco de la lámina y se acumula en todas las neuronas de la lámina en las columnas más maduras en el borde posterior de la lámina en desarrollo. Por lo tanto, la matriz precisa de neuronas de la lámina se desarrolla mucho después de que los conos de crecimiento de las células R entren en la región objetivo (Poeck, 2001).

Además, la formación de conexiones entre la retina y la lámina requiere el premontaje de un campo objetivo organizado con precisión. Durante el desarrollo de la pupa, los conos de crecimiento R1-R6 se desasciclan de su paquete original. Cada cono de crecimiento se proyecta a diferentes objetivos postsinápticos vecinos y se desarrolla en una terminal extendida, formando muchas sinapsis al paso con un subconjunto de neuronas laminares. La formación de sinapsis se completa con el desarrollo tardío de la pupa. Esta compleja reorganización de los axones de las células R dentro del objetivo asegura que, en el adulto, las células R que 'miran' desde el ojo en el mismo punto en el espacio se conecten con las mismas neuronas postsinápticas en la lámina (Poeck, 2001).

El papel de las neuronas como dianas transitorias intermedias está bien documentado en el hipocampo y el neocórtex de mamíferos en desarrollo. Al igual que en la lámina en desarrollo, los socios sinápticos finales aún no están en su lugar en estos sistemas cuando llegan los primeros axones aferentes. En este artículo, se ha demostrado que las células gliales también pueden actuar como objetivos intermedios. De hecho, esta función para las células gliales puede estar más extendida. En el sistema olfativo en desarrollo de la polilla. Manduca sexta, los axones antenales interactúan con las células gliales en el área objetivo antes de establecer contactos con las neuronas objetivo centrales. En animales con deficiencia glial por tratamiento con hidroxiurea o irradiación gamma, los axones olfatorios no limitan sus proyecciones a sus objetivos normales, los glomérulos olfatorios. Este tratamiento también previene el desarrollo de células gliales específicas, que segregan axones en fascículos distintos cuando entran en la región objetivo desde el nervio antenal. Por tanto, no está claro si son estas células gliales o, alternativamente, las células gliales asociadas a neuropilos en el área diana las que son críticas para regular la especificidad diana en este sistema. Las células gliales también pueden funcionar como dianas intermedias en algunas regiones del sistema nervioso de los mamíferos. Por ejemplo, los axones olfativos de roedores interactúan con las células gliales radiales, antes del reclutamiento de los procesos mitral y periglomerular (p. Ej., Los objetivos sinápticos de las neuronas olfativas) en los glomérulos. En ausencia de células mitrales o periglomerulares, los axones olfatorios seleccionan sus objetivos glomerulares apropiados. Sobre la base de estas observaciones, se ha propuesto que la orientación de axones olfatorios a glomérulos específicos está regulada por células gliales. Si bien el papel de las células gliales en la especificación del objetivo es nuevo, anteriormente se ha demostrado que las células gliales desempeñan funciones clave como "guías" a lo largo de las trayectorias de los axones hacia sus objetivos. Por ejemplo, en el sistema nervioso central embrionario de Drosophila, las células gliales de la línea media proporcionan una señal repelente, Slit, para evitar que los axones crezcan de forma inapropiada a través de la línea media (Poeck, 2001 y sus referencias).

La identificación de células gliales como dianas intermedias para las neuronas R1-R6 proporciona un paso importante en el aislamiento de las señales de dirección que regulan la especificidad de R1-R6. Esto se puede lograr mediante exámenes moleculares utilizando células gliales marcadas con GFP aisladas del lóbulo óptico en desarrollo para identificar genes que codifican proteínas de la superficie celular expresadas selectivamente en estas células. Alternativamente, dirigiendo la recombinación mitótica a células precursoras gliales usando el método FLP / FRT, puede ser posible aislar específicamente los genes requeridos en las células gliales para controlar la selección de la capa diana (Poeck, 2001).

dDsk2 regula H2Bub1 y ARN polimerasa II haciendo una pausa en los genes diana del complejo dHP1c

dDsk2 (Ubqln2 / Ubiquilin) ​​es un receptor de ubiquitina extraproteasomal conservado que se dirige a las proteínas ubiquitiladas para su degradación. Este estudio informa que dDsk2 desempeña una función no proteolítica en la regulación de la transcripción. dDsk2 interactúa con el complejo dHP1c, se localiza en los promotores de los genes del desarrollo y es necesario para la transcripción. A través del dominio de unión a ubiquitina, dDsk2 interactúa con H2Bub1 (H2B monoubiquitilado), una modificación que se produce en los sitios de unión del complejo dHP1c. No se requiere H2Bub1 para la unión del complejo, sin embargo, el agotamiento de dDsk2 reduce fuertemente H2Bub1. El co-agotamiento de H2Bub1 deubiquitylasa dUbp8 / Nonstop suprime esta reducción y rescata la expresión de genes diana. La ARN polimerasa II está fuertemente pausada en los promotores de los genes diana del complejo dHP1c y el agotamiento de dDsk2 interrumpe la pausa. En conjunto, estos resultados sugieren que dDsk2 previene la desubiquitilación de H2Bub1 dependiente de dUbp8 / Nonstop en los promotores de genes diana del complejo dHP1c y regula la pausa de la ARN polimerasa II. Estos resultados amplían el catálogo de funciones no proteolíticas de los receptores de ubiquitina para la regulación epigenética de las modificaciones de la cromatina (Kessler, 2015).

Este estudio informa que el receptor de ubiquitina extraproteasomal dDsk2 interactúa con el complejo dHP1c, se localiza en los promotores y es necesario para la transcripción. Los sitios de unión del complejo dHP1c están marcados por H2Bub1 y los resultados sugieren que, a través del dominio UBA, dDsk2 se une a H2Bub1. Sin embargo, la reducción de los niveles de H2Bub1 afecta la unión del complejo solo débilmente, lo que indica que la interacción con H2Bub1 tiene solo una contribución menor al reclutamiento. En realidad, dDsk2 contiene un único sitio de unión a ubiquitina de baja afinidad (Kd

400 & muM), que contrasta con la mayoría de los receptores de ubiquitina que contienen varios sitios de unión a ubiquitina que actúan sinérgicamente para proporcionar una unión de alta afinidad. De manera similar, la interacción de dDsk2 con H2Bub1 es de baja especificidad, ya que el reconocimiento selectivo de sustratos ubiquitilados se basa en gran medida en el reconocimiento del tipo de enlace, la longitud y el sitio de anclaje de una cadena de poliubiquitina y, en consecuencia, requiere la presencia de varios enlaces de ubiquitina. sitios. De hecho, el dominio UBA de dDsk2 reconoce una monoubiquitylation en PTEN con una afinidad similar a la de H2B. Por otro lado, la unión del complejo dHP1c probablemente implica el reconocimiento de secuencias de ADN específicas, ya que depende de las proteínas con dedos de zinc WOC y ROW. Cabe destacar que los sitios de unión al complejo dHP1c están significativamente enriquecidos en un motivo de secuencia de ADN específico. Sin embargo, aunque la interacción con H2Bub1 es débil, la unión del complejo depende inesperadamente de dDsk2. Además, dHP1c es prescindible para la unión de WOC y ROW, así como para la unión de dDsk2). Estos efectos no parecen ser la consecuencia de cambios en los niveles de expresión génica, ya que los niveles de ARNm de dDsk2 no cambian significativamente en el agotamiento de WOC, ROW o dHP1c. Además, el agotamiento de dDsk2 regula al alza el ROW y regula a la baja débilmente los niveles de ARNm de dHP1c. Finalmente, se informó que dHP1c interactúa con el ARN pol II, lo que sugiere que la unión del complejo dHP1c podría depender del ARN pol II. Sin embargo, argumentando en contra de esta posibilidad, se observó que la unión del complejo a los promotores es resistente al tratamiento con actinomicina D. En conjunto, estos resultados sugieren que WOC, ROW y dDsk2 constituyen el módulo de unión real del complejo, siendo completamente interdependiente para la unión. a la cromatina y necesaria para la unión de dHP1c. En este sentido, la ligera reducción de los niveles de proteína ROW y dHP1c observada en el agotamiento de dDsk2 se debe muy probablemente a su incapacidad para unirse a la cromatina, como se describió anteriormente para dHP1c en derribos de ROW y WOC, así como para otras proteínas asociadas a la cromatina cuando su la unión a la cromatina está alterada (Kessler, 2015).

Estos resultados sugieren que la función principal de dDsk2 en el complejo dHP1c es prevenir la desubiquitilación de H2Bub1 por dUbp8 / Nonstop, ya que los niveles de H2Bub1 se reducen fuertemente en el agotamiento de dDsk2 y se recuperan después del co-agotamiento de dUbp8 / Nonstop. También se ha informado de protección contra la desubiquitilación para Rad23 y parece ser una característica común de muchos receptores de ubiquitina. El agotamiento simultáneo de dDsk2 y dUbp8 / Nonstop también restaura la expresión de los genes diana, mientras que no tiene ningún efecto sobre el reclutamiento del complejo en los promotores. Además, la sobreexpresión de la construcción ΔUBA-dDsk2, que pierde el dominio UBA que media la interacción con H2Bub1 in vitro, reduce los niveles de H2Bub1 en los promotores y regula negativamente la expresión de genes diana. En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que la contribución de dDsk2 a la regulación de la transcripción se basa principalmente en esta función protectora (Kessler, 2015).

Los genes diana del complejo dHP1c muestran características asociadas con una fuerte pausa de ARN pol II. Los resultados apoyan una contribución de dDsk2 a la pausa, ya que su agotamiento reduce la ocupación de ARN pol II preferentemente en TSS y disminuye fuertemente los niveles de NELF-E. El agotamiento de dDsk2 regula negativamente la expresión y, de acuerdo, se reduce la ocupación total de ARN pol II a través de los genes diana. Curiosamente, la mayoría de los genes diana de NELF también están regulados negativamente en el agotamiento de NELF en las células S251, y NELF potencia la expresión génica en el embrión de Drosophila. Realmente,

El 80% de los genes diana del complejo dHP1c que cambian la expresión en las condiciones de desactivación de NELF están regulados negativamente. Además, el agotamiento de NELF-E muestra una reducción similar de la ocupación total de ARN pol II en los genes diana. En conjunto, estas observaciones sugieren que la interrupción de la pausa del ARN pol II generalmente no aumenta la transcripción productiva, pero da como resultado una menor ocupación del ARN pol II total y una disminución de la expresión. Es posible que la liberación de pausa prematura interfiera con la activación del ARN pol II en elongación, dando como resultado una transcripción abortiva que, a su vez, podría afectar el reclutamiento y / o reinicio del ARN pol II. Sin embargo, observe que el agotamiento de dDsk2 no afecta el grado de acetilación de histonas detectado en los promotores diana, lo que sugiere que retienen el estado de cromatina activa transcripcional (Kessler, 2015).

En particular, el co-agotamiento de dUbp8 / Nonstop, que rescata H2Bub1, también rescata el defecto de pausa causado por el agotamiento de dDsk2 y se restauran los niveles de expresión, lo que sugiere que la regulación dinámica de los niveles de H2Bub1 en los promotores de los genes diana dHP1c juega un papel en la pausa del ARN pol II . En este sentido, el trabajo realizado en levadura sugirió que la activación transcripcional implica ciclos secuenciales de ubiquitilación y desubiquitilación de H2B y que Ubp8 promueve la fosforilación dependiente de Ctk1 de Ser2 en CTD33, una modificación que se requiere para la activación en la forma de alargamiento Pol IIoser2. Sin embargo, la desubiquitilación de H2Bub1 en TSS no parece ser suficiente por sí sola para inducir la liberación de pausa, ya que el agotamiento de dBre1, que también reduce H2Bub1 en TSS, no tiene un efecto significativo en la pausa. En este sentido, debe tenerse en cuenta que dBre1 viaja con el ARN pol II en alargamiento a lo largo de las regiones codificantes para inducir H2Bub1, que estimula la actividad Facilita-Cromatina-Transcripción (FACT) y, por tanto, facilita la elongación. Por otro lado, la actividad dUbp8 / Nonstop está restringida principalmente a los promotores, ya que su depleción en células deficientes en dBre1 tiene poco efecto en los niveles de H2Bub1 en las regiones codificantes. Por el contrario, el agotamiento de dUbp8 / Nonstop en células deficientes en dDsk2 rescata fuertemente los niveles de H2Bub1 en las regiones codificantes. Curiosamente, mientras que el agotamiento de dUbp8 / Nonstop restaura la expresión de los genes diana en las células agotadas de dDsk2, solo tiene un efecto leve en las células deficientes en dBre1. En conjunto, estos resultados sugieren que el agotamiento de dBre1 altera el alargamiento y, por lo tanto, podría prevenir la liberación de ARN pol II en pausa al alterar su compromiso real en el alargamiento. Se requiere más trabajo para comprender mejor los mecanismos que regulan la pausa del ARN pol II, la contribución real de dDsk2 y si involucra H2Bub1 y / o factores adicionales también dirigidos por la ubiquitilación (Kessler, 2015).

El complejo dHP1c parece tener una contribución particularmente importante al desarrollo y la función del sistema nervioso, ya que los genes diana se enriquecen en funciones relacionadas y las condiciones de desactivación afectan preferentemente la expresión génica en el sistema nervioso. En realidad, WOC y ROW se expresan en gran medida en el sistema nervioso durante el desarrollo embrionario y larvario, y las larvas mutantes muestran defectos cerebrales. Además, en humanos, el homólogo de WOC DXS6673E / ZNF261 se ha implicado en el retraso mental ligado al cromosoma X. Interestingly, mutations in the human Dsk2 homologues (Ubqln-1/2) have been associated with Alzheimer's disease as well as other neurodegenerative diseases. Noteworthy, Ubqln-1/2 are detected in both the nucleus and the cytoplasm, and the development and progression of neurofibrillary tangles in Alzheimer's disease brains associate with an altered nuclear Ubqln-1 content. Whether the role of dDsk2 in transcription regulation is conserved in humans and contributes to disease remains to be determined (Kessler, 2015).

In summary, these results indicate that the ubiquitin receptor dDsk2 plays a nonproteolytic function in the regulation of H2Bub1 and RNA pol II pausing at promoters of dHP1c complex target genes. Ubiquitin receptors have been previously reported to play nonproteolytic functions in DNA repair and transcription elongation. Furthermore, in response to DNA damage, human Rad23B was found to interact with ubiquitylated p53, localize at chromatin and accumulate at the p21 promoter. In addition, in mouse embryonic stem cells, several components of the NER complex, including Rad23B, have been shown to act as an Oct4/Sox2 co-activator complex that associates with chromatin and is required for stem cell maintenance. Recruitment of NER factors to active promoters has also been reported in HeLa cells in the absence of DNA damage. However, in these cases, the precise function of the ubiquitin receptor has not been elucidated. In this regard, these results expand the catalogue of nonproteolytic functions of ubiquitin receptors to the epigenetic regulation of chromatin modifications and transcription initiation. It must also be noted that ubiquitylation participates in the regulation of multiple genomic functions and that the number of proteins containing ubiquitin-binding domains is large,

100 in humans. Therefore, a role of ubiquitin-binding proteins as epigenetic regulators of chromatin emerges as a distinct possibility (Kessler, 2015).

los non-stop expression pattern was examined in the target area as a first step toward assessing in which cells non-stop may function. In situ hybridization labeling of eye-brain complexes with non-stop antisense mRNA probes revealed weak expression in the optic lobe and higher expression in the lamina precursor cells. Since the resolution of in situ hybridization in the optic lobe is not high, protein expression was examined by placing a c-mi c tag at the C terminus of the non-stop open reading frame in a genomic clone and the transgene was introduced into flies. Since this transgene rescues the projection phenotype and lethality associated with non-stop mutations and expression is similar in two independently derived transgenic lines, it is concluded that the transgene is expressed in a pattern similar to wild type. Anti-mi c labeling reveals ubiquitous expression in the cytoplasm of cells in the optic lobe and central brain. Higher levels of expression, however, are observed in lamina precursor cells but not in differentiated lamina neurons. Non-stop is also expressed at higher levels in marginal, epithelial, and medulla glial cells adjacent to the lamina plexus (Poeck, 2001).

The simple cellular composition and array of distally pointing hairs has made the Drosophila wing a favored system for studying planar polarity and the coordination of cellular and tissue level morphogenesis. A gene expression screen was carried out to identify candidate genes that functioned in wing and wing hair morphogenesis. Pupal wing RNA was isolated from tissue prior to, during and after hair growth and used to probe Affymetrix Drosophila gene chips. 435 genes were identified whose expression changed at least 5 fold during this period and 1335 whose expression changed at least 2 fold. As a functional validation, 10 genes were chosen where genetic reagents existed but where there was little or no evidence for a wing phenotype. New phenotypes were found for 9 of these genes providing functional validation for the collection of identified genes. Among the phenotypes seen were a delay in hair initiation, defects in hair maturation, defects in cuticle formation and pigmentation and abnormal wing hair polarity. The collection of identified genes should be a valuable data set for future studies on hair and bristle morphogenesis, cuticle synthesis and planar polarity (Ren, 2005).

The expression of the non-stop (not) gene decreased 3.9 fold from 24 to 40 hrs. Mutaciones en no result in photoreceptor neurons projecting through the lamina instead of terminating there. The mutations also result in approximately 20% of ommatidia being misoriented -- a planar polarity phenotype. Strong alleles of no die as prepupae so no clones were examined in both adult and pupal wings. Large numbers of clones were induced. Perhaps 25% of wing cells are found in clones. All adult wings of this genotype had regions where there were cells that failed to form hairs or that had very small hairs. These were found only in proximal medial regions on the ventral wing surface. All such wings also had subtle polarity abnormalities small groups of hairs with slightly abnormal polarity in all regions of the wing. Consistently finding such defects leads to the conclusion that these were due to no clones. Of 47 such wings examined 27 also contained multiple hair cells and a further 10 contained regions with planar polarity defects reminiscent of genes such as fz y dsh. When marked no clones were examined in pupal wings most, but not all, showed cells where hair differentiation was delayed or absent. Such clones were seen in all wing regions. It is suggested that all no clones have delayed hair formation. When the clones are located in wing regions where hairs normally form first (distal or peripheral regions) the hairs form later than normal but still have enough time to reach a relatively normal length. In contrast, when clones are located in regions where hair formation is normally late (proximal and medial regions on the ventral wing surface) not enough time remains prior to cuticle deposition to produce a normal hair. los no gene encodes a ubiquitin carboxyterminal hydrolase likely to function in the removal of ubiquitin from proteins during protein degradation (Ren, 2005).

Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation

The Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase (SAGA) complex was discovered from Saccharomyces cerevisiae and has been well characterized as an important transcriptional coactivator that interacts both with sequence-specific transcription factors and the TATA-binding protein TBP. SAGA contains a histone acetyltransferase and a ubiquitin protease. In metazoans, SAGA is essential for development, yet little is known about the function of SAGA in differentiating tissue. This study analyzed the composition, interacting proteins, and genomic distribution of SAGA in muscle and neuronal tissue of late stage Drosophila embryos. The subunit composition of SAGA was the same in each tissue however, SAGA was associated with considerably more transcription factors in muscle compared with neurons. Consistent with this finding, SAGA was found to occupy more genes specifically in muscle than in neurons. Strikingly, SAGA occupancy was not limited to enhancers and promoters but primarily colocalized with RNA polymerase II within transcribed sequences. SAGA binding peaks at the site of RNA polymerase pausing at the 5' end of transcribed sequences. In addition, many tissue-specific SAGA-bound genes required its ubiquitin protease activity for full expression. These data indicate that in metazoans SAGA plays a prominent post-transcription initiation role in tissue-specific gene expression (Weake, 2011).

SAGA has been purified from Drosophila and mammalian cells and was found to contain homologs of most of the yeast SAGA subunits, including the Gcn5 (see Drosophila Pcaf) and Ubp8 catalytic subunits. In metazoans, SAGA may have roles in both normal development and cancer (Koutelou, 2010). Individual loss of the SAGA subunits Gcn5, Ada2b, Ada3, WDA, Sgf11, and SAF6 results in developmental defects and larval lethality in flies (Weake, 2009 and references therein). Similarly, Gcn5 deletion in mice leads to defects in mesoderm development and embryonic lethality (Xu, 2000). However, catalytic site mutations in Gcn5 survive longer but suffer neural tube closure defects and exencephaly (Bu, 2007). Furthermore, loss of the ubiquitin protease in Drosophila SAGA (Nonstop) leads to defects in photoreceptor axon targeting followed by lethality at late larval stages (Weake, 2011).

A system was designed in which SAGA could be isolated from different cell types in Drosophila embryos so that its composition and localization pattern could be determined in different tissues. To this end, the GAL4/UAS system was used to express a Flag-HA tagged version of the SAGA-specific protein Ada2b (Ada2bH1F2) in muscle or neuronal cells using the mef2-GAL4 and elav-GAL4 drivers, respectively. Expression of Ada2bH1F2 under the control of its genomic enhancer sequences rescues viability of the lethal ada2b 1 alelo. Mientras que mef2 is expressed in committed mesoderm, the somatic and visceral musculature, and cardiac progenitors, elav is expressed prominently in neuronal cells and transiently in glial cells of the embryonic CNS. Ada2bH1F2 is expressed at levels similar to those of endogenous Ada2b using this system. To enrich for cell populations of interest that express tagged Ada2b, muscle and neuronal cells were labelled using GFP, and these cells were isolated using fluorescence-activated cell sorting (FACS). To determine whether the purified cells exhibit the characteristic gene expression profiles of each cell type, GFP-labeled neuronal and muscle cells were isolated from late stage embryos by FACS. RNA isolated from these tissues was compared with RNA extracted from whole embryos using cDNA microarrays, and genes were identified that are differentially expressed in muscle or neurons using significance analysis of microarrays. The differentially expressed genes identified using this approach were compared with ImaGO terms that describe the expression pattern of individual genes during Drosophila embryogenesis as determined by in situ hybridization. Genes identified as being expressed preferentially in muscle relative to neurons were enriched for ImaGO terms including embryonic/larval muscle system and dorsal prothoracic pharyngeal muscle. In contrast, genes identified as being expressed preferentially in neurons were enriched for ImaGO terms such as ventral nerve cord and dorsal/lateral sensory complexes. It is concluded that cells isolated using the FACS approach are enriched for the cell types of interest (Weake, 2011).

This study examined SAGA composition and localization in muscle and neuronal cells of late stage Drosophila embryos. Surprisingly, extensive colocalization of SAGA with Pol II was observed at both promoters and coding regions in muscle cells. Notably, genes at which SAGA was not detected in this assay have low levels of Pol II bound. It is suggested that SAGA might be important for recruitment and/or retention of high levels of Pol II at the promoter-proximal pause site in flies, and perhaps, therefore, more generally in higher eukaryotes. SAGA has been previously observed on the coding sequence of a small number of individual transcribed genes in yeast. Recently, low levels of Ada2b were detected on the 3' region of several different genes during larval development (Zsindely, 2009). It is noted that although some SAGA is present across the coding region of many genes, the peak of acetylated H3-Lys9 is restricted to the 5' region of the two genes that were examined: wupA y exba. A similar 5' bias of acetylated H3-Lys9 has been observed previously in genome-wide studies of histone modifications. It is speculated that the acetylation activity of SAGA in the 3' region of the gene is counteracted by histone deacetylases such as Rpd3S that have been shown to associate with the elongating form of Pol II (Weake, 2011).

SAGA localizes to different genes in muscle and neurons of late stage Drosophila embryos, and the number of genes bound by the complex in each tissue correlates with the number of transcription factors associated with the complex. These findings indicate that the differential localization of SAGA may be regulated by its association with different transcription factors in different cell types. A number of studies have found that transcription factor-binding sites tend to be clustered within the fly genome. This observed colocalization of transcription factors, together with the current data showing the association of SAGA with a large number of different transcription factors, indicates that multiple transcription factors might be involved in recruiting SAGA to its target genes (Weake, 2011).

SAGA is present at the promoter-proximal pause site together with Pol II at genes that are stalled or infrequently transcribed. The presence of SAGA together with paused Pol II is consistent with a role for SAGA in post-initiation deubiquitination of H2B, which has been shown in yeast to be important for phosphorylation of Ser-2 of the Pol II CTD and its subsequent transition into transcription elongation. In flies, phosphorylation of Ser-2 of the Pol II CTD by P-TEFb is also required for release of the paused polymerase into transcription elongation. Hence, the strong colocalization of SAGA with polymerase that has initiated transcription but is paused prior to elongation suggests a prominent function for SAGA in regulating tissue-specific gene expression at a step occurring post-initiation in metazoans. Consistent with the possibility, it was observe that the SAGA-bound genes that are most dependent on its ubiquitin protease activity for full expression are preferentially expressed in a specific tissue (Weake, 2011).

Biochemical and genetic studies support a role for Non-stop acting as a ubiquitin-specific protease. Three ubiquitinated proteins of 29, 55, and 200 kDa accumulated in P-element insert mutations not 1 and not 2 extracts of third instar larval tissue, as assessed on Western blots probed with an anti-Ubiquitin antibody. Both the non-stop targeting defect and prepupal lethality are dominantly enhanced by loss of one copy of a proteasome subunit encoded by l(3)73Ai . This suggests that Non-stop functions to regulate the degradation of a substrate via a ubiquitin-dependent pathway (Poeck, 2001).

It was necessary to show that non-stop is not required in the eye to regulate R cell target selection. To examine the genetic requirement of non-stop in targeting, the FLP/FRT system was used to induce eye-specific mitotic recombination and the marker Rh1-taulacZ was used to assess R1-R6 projections in adult cryostat sections. los sin ojos-FLP (eyFLP) transgene was used to provide FLP recombinase activity in dividing cells of eye imaginal discs. To increase the size and number of clones in the eye, the FRT chromosome carried either a recessive cell lethal mutation (rfc) or a Minute mutation [M(3)RpS17 4 ]. Using an eye pigment marker, it was estimated that about 60% (with Rfc) to 80% (with RpS) of the cells in mosaic eyes were homozygous mutant. As in wild type, all axons of Rh1-taulacZ-expressing R cells in non-stop mutant eye tissue terminate in the lamina. Minor defects in ommatidial polarity and cell number were observed in non-stop mosaic eyes. However, because the projections are normal, these defects cannot account for the R1-R6 targeting errors. In further support of this finding, the projections of non-stop mutant R cell axons into a wild-type target in third instar larvae, as visualized by mAb24B10, were largely indistinguishable from wild type. Thus, it is concluded that non-stop function is required in the target but not in R cell axons for normal layer selection (Poeck, 2001).

Si non-stop were to act in the target tissue, then it could do so in two different ways. It could be directly required for the production of a targeting signal. Alternatively, it could be required for the development of the cells expressing targeting signals. To distinguish between these possibilities, the development of lamina neurons and glial cells was examined in the target area in non-stop mutantes. A subpopulation of neuroblasts in the outer proliferation center, adjacent to the developing lamina, generates lamina precursor cells (LPCs) that, in response to inductive signals from R cell axons, give rise to neurons. Older R cell axon bundles are associated with columns of lamina neurons and are shifted posteriorly as additional R cell axon bundles enter the target region. Lamina neuron development in non-stop mutants was assessed using the early neuronal differentiation marker Dachshund, the late neuronal differentiation marker Elav, and an antibody to a Brain-specific homeobox (Bsh) protein. In addition, the organization of lamina neurons into columns was examined. As in wild type, Dachshund is expressed in LPCs and was maintained in differentiating lamina neurons in non-stop mutantes. Elav is expressed in mature lamina neurons L1-L5, and anti-Bsh is restricted to L5. Lamina neurons in non-stop mutants form columns largely as in wild type. Por eso, non-stop is not required for lamina neuron differentiation (Poeck, 2001).

R cell axons encounter different glial cell types in the eye disc and in the optic stalk as they project into the optic lobe. Glial cells in the larval eye-brain complex can be visualized using the nuclear glial cell-specific marker anti-Repo. R cell axons grow past subretinal glial cells at the base of the optic stalk as well as satellite glial cells, which are interspersed among lamina neurons. R1-R6 growth cones terminate between rows of epithelial (distal) and marginal (proximal) glial cells. A third row of glial cells (medulla glial cells) lies beneath the marginal glial cells, demarcating the boundary between the developing lamina and medulla. Analysis of glial cell morphology using specific Gal4 drivers to express cytoplasmic ß-galactosidase has shown that epithelial and marginal glial cells have a unique morphology in comparison with the other glial cell types in the larval visual system. In contrast to the long ensheathing processes of eye disc, satellite, and medulla glial cells, epithelial and marginal glial cells assume a cuboidal shape and elaborate numerous fine processes, especially from the surface juxtaposing R1-R6 growth cones within the lamina plexus. The close contact between these glial cells and R1-R6 growth cones is consistent with a role as intermediate target cells (Poeck, 2001).

The development of glial cells in non-stop homozygous mutant eye-brain complexes was assessed using the marker anti-Repo. While glial cells found in the eye imaginal disc, optic stalk, and the entrance to the optic lobe appear normal in non-stop mutants, the rows of epithelial, marginal, and medulla glial cells are severely disrupted. The number of Repo-positive glial cells surrounding the lamina plexus is reduced in non-stop when compared to wild type. Whereas an average of 55 epithelial, marginal, and medulla glial cells is found in optical sections of third instar larval optic lobes in wild type, only about 20 glial cells are observed in non-stop mutantes. The number of glial cells in wild type was determined using single optical sections, while the number of these cells in non-stop mutants was assessed using a merged image comprising between 4 and 11 1 µm thick optical sections. Hence, this difference is an underestimate (Poeck, 2001).

Glial cells in the target area originate from glial precursor cell areas that are located at the most dorsal and ventral edges of the R cell projection field on the surface of the optic lobe. Glial cells migrate to their characteristic positions along the lamina plexus. In wild type, a small number of migrating glial cells express Repo as they enter the R cell projection field. En non-stop mutants, however, a marked increase (57% wild type, n = 13 non-stop, n = 31) is observed in the number of Repo-expressing glial cells in this region. This indicates that non-stop, either directly or indirectly, affects the migration of epithelial, marginal, and medulla glial cells into the target region (Poeck, 2001).

SAGA-mediated H2B deubiquitination controls the development of neuronal connectivity in the Drosophila visual system

Nonstop, which has previously been shown to have homology to ubiquitin proteases, is required for proper termination of axons R1-R6 in the optic lobe of the developing Drosophila eye. This study establish that Nonstop actually functions as an ubiquitin protease to control the levels of ubiquitinated histone H2B in flies. Nonstop is the functional homolog of yeast Ubp8, and can substitute for Ubp8 function in yeast cells. In yeast, Ubp8 activity requires Sgf11. In Drosophila, loss of Sgf11 function causes similar photoreceptor axon-targeting defects as loss of Nonstop. Ubp8 and Sgf11 are components of the yeast SAGA complex, suggesting that Nonstop function might be mediated through the Drosophila SAGA complex. Indeed, it was found that Nonstop does associate with SAGA components in flies, and mutants in other SAGA subunits display nonstop phenotypes, indicating that SAGA complex is required for accurate axon guidance in the optic lobe. Candidate genes regulated by SAGA that may be required for correct axon targeting were identified by microarray analysis of gene expression in SAGA mutants (Weake, 2008).

This study has identified a novel role for the coactivator complex dSAGA in Drosophila neural development. The Gcn5 (KAT2) HAT acts as the catalytic subunit of the yeast SAGA, SLIK, ADA and A2 multi-subunit protein complexes. Although many studies in multicellular organisms have focused on the HAT activity of the Gcn5 (KAT2) complexes, SAGA itself possesses a second catalytic activity. In addition to its HAT activity, yeast SAGA contains an H2B deubiquitinating enzyme, Ubp8. Ubp8 functions as part of a modular subunit domain within yeast SAGA that contains two additional proteins, Sgf11 and Sus1. Previous studies on histone deubiquitination have focused on its role in transcription in yeast. This study has characterized a role for histone deubiquitination in gene regulation in Drosophila (Weake, 2008).

Nonstop and Sgf11 constitute the H2B deubiquitination module within dSAGA. Moreover, both Nonstop and Sgf11 are required for correct axon targeting in the developing visual system. As in yeast, the two catalytic functions of SAGA are separable. However, mutations that differentially affect the two catalytic activities of dSAGA have overlapping but distinct effects on gene expression. Despite the differences in activity, both catalytic modules of dSAGA are required for correct axon targeting in the optic lobe. This implicates dSAGA in the regulation of pathways essential for neural development in higher eukaryotes (Weake, 2008).

This analysis of the axon-targeting defects in the nonstop, sgf11 y ada2b mutants indicates that the R-cell misprojection phenotype is associated in all three cases with a loss of glial cells from the lamina region of the optic lobe, and an increase in the number of glial cells at the dorsal and ventral margins of the lamina. Clonal analysis indicates that nonstop glial cells fail to migrate from these dorsal and ventral regions into the lamina plexus. This suggests that dSAGA may be required within glial cells to regulate pathways important for their migration. It is possible that the requirement of dSAGA may be due to its role in the ecdysone response as indicated by microarray analysis of genes downregulated in nonstop, sgf11 y ada2b larvas mutantes. However, further studies on the role of dSAGA in these glial cells will be required to determine which pathway(s) are primarily responsible for the axon-targeting defect observed in these dSAGA mutants (Weake, 2008).

Mutations that affect the deubiquitination activity of dSAGA, such as nonstop y sgf11, appear to result in a more severe axon-targeting defect than those that affect the acetylation activity, such as ada2b. However, there is some variability in the degree of expressivity of the phenotype in all three mutant genotypes, and some ada2b mutants show phenotypes very similar to nonstop y sgf11. It is evident from studies on yeast SAGA that both enzymatic activities are required for optimal transcription upon gene induction. The variability in the ada2b mutant may be due to the large maternal contribution of Ada2b, and it is notable that the ada2b mutant larvae show considerably less developmental delay in comparison to nonstop, sgf11 y gcn5. Thus far, mutations in other components of dSAGA, such as wda y nipped-A, have not been examined for this phenotype because these do not reach the third instar larval stage of development (Weake, 2008).

Although in this study a specific effect was observed of the dSAGA deubiquitination module on histone H2B, it remains likely Nonstop and Sgf11 are also required for deubiquitination of other target proteins within the cell. Previous studies observed an increase in the level of three ubiquitinated proteins of 29, 55 and 200 kDa in extracts from nonstop third instar larval tissue relative to wild-type extracts. The smallest of these may correspond to ubiquitinated H2B, but the others may correspond to as yet unidentified potential targets of the deubiquitination module within dSAGA (Weake, 2008).

It is likely that the role of SAGA and H2B deubiquitination in neural development may be conserved in mammalian systems, as there is a striking degree of similarity between Sgf11 and ATXN7L3/ATXN7 in humans. ATXN7 is a subunit of the human STAGA and TFTC complexes. Polyglutamine expansions in the Spinocerebellar ataxia type 7 (sca7) gene, encoding ATXN7, result in a dominant neurodegenerative disorder that affects the retina. There is increased recruitment of STAGA/TFTC containing this polyQ-expanded ATXN7 at certain promoters in a mouse SCA7 model, resulting in hyperacetylation of H3. Interestingly, despite this increased promoter recruitment and hyperacetylation, these genes show decreased levels of transcription. However, in other studies incorporation of polyQ-expanded ATXN7 into STAGA reduces the acetyltransferase activity of the complex. The effect of the polyQ expansions in ATXN7 on the putative deubiquitination activity of mammalian STAGA/TFTC has not yet been examined (Weake, 2008).

Van der Knaap (2005) has demonstrated that another ubiquitin protease in flies, USP7, specifically deubiquitinates Histone H2B in vitro. However, RNAi of USP7 had little effect on global levels of ubiquitinated H2B, and it was found that USP7 cannot functionally replace UBP8 in yeast. Yeast Ubp15, the putative homolog of USP7, also deubiquitinates H2B in vitro, but the biological role of this activity is presently unknown. In addition to Ubp8 in yeast, Ubp10 is also required for deubiquitination of H2B at the telomeres and at the rDNA locus. It is unknown whether the putative homolog of Ubp10 in flies, CG15817, is also required for H2B deubiquitination and gene silencing. It is intriguing that both Ubp10 and USP7 (via an interaction with the Polycomb complex) function in regulating heterochromatin structure, while Ubp8/Nonstop are required for active transcription. It remains to be determined whether alternative mechanisms for regulating histone ubiquitination at distinct chromatin environments exist within the genomes of higher eukaryotes (Weake, 2008).

Taken together, these results advance the understanding of the role of histone deubiquitination in transcription, while demonstrating a novel role for SAGA in regulating neural development in the visual system of Drosophila. These findings have implications for the use of Drosophila as a model system to understand the underlying mechanisms of neurodegenerative diseases (Weake, 2008).

Bu, P., Evrard, Y. A., Lozano, G. and Dent, S. Y. (2007). Loss of Gcn5 acetyltransferase activity leads to neural tube closure defects and exencephaly in mouse embryos. Mol. Cell Biol. 27: 3405-3416. PubMed Citation: 17325035

Kessler, R., Tisserand, J., Font-Burgada, J., Reina, O., Coch, L., Attolini, C. S., Garcia-Bassets, I. and Azorin, F. (2015). dDsk2 regulates H2Bub1 and RNA polymerase II pausing at dHP1c complex target genes. Nat Commun 6: 7049. PubMed ID: 25916810

Koutelou, E., Hirsch, C. L. and Dent, S. Y. (2010). Multiple faces of the SAGA complex. Curr. Opin. Cell Biol. 22: 374-382. PubMed Citation: 20363118

Martin, K. A., Poeck, B., Roth, H., Ebens, A. J., Conley Ballard, L. and Zipursky, S. L. (1995). Mutations disrupting neuronal connectivity in the Drosophila visual system. Neuron 14: 229-240. 7857635

Poeck, B., Fischer, S., Gunning, D., Zipursky, S. L. and Salecker, I. (2001). Glial cells mediate target layer selection of retinal axons in the developing visual system of Drosophila. Neuron 29: 99-113. 11182084

Ren, N., Zhu, C., Lee, H. and Adler, P. N. (2005). Gene expression during Drosophila wing morphogenesis and differentiation. Genetics 171(2): 625-38. 15998724

Rørth, P., Szabo, K., and Texido, G. (2000). The level of C/EBP protein is critical for cell migration during Drosophila oogenesis and is tightly controlled by regulated degradation. Mol. Cell 6: 23-30. PubMed Citation: 10949024

van der Knaap, J. A., et al. (2005). GMP synthetase stimulates histone H2B deubiquitylation by the epigenetic silencer USP7. Mol. Cell 17: 695-707. PubMed Citation: 15749019

Weake, V. M., et al. (2008). SAGA-mediated H2B deubiquitination controls the development of neuronal connectivity in the Drosophila visual system. EMBO J. 27(2): 394-405. PubMed Citation: 18188155

Weake, V. M., et al. (2009). A novel histone fold domain-containing protein that replaces TAF6 in Drosophila SAGA is required for SAGA-dependent gene expression. Genes Dev. 23: 2818-2823. PubMed Citation: 20008933

Weake, V. M., et al. (2011). Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation. Genes Dev. 25(14): 1499-509. PubMed Citation: 21764853

Xu, W., et al. (2000). Loss of Gcn5l2 leads to increased apoptosis and mesodermal defects during mouse development. Nat. Gineta. 26: 229-232. PubMed Citation: 11017084

Zsindely, N., et al. (2009). The loss of histone H3 lysine 9 acetylation due to dSAGA-specific dAda2b mutation influences the expression of only a small subset of genes. Ácidos nucleicos Res. 37: 6665-6680. PubMed Citation: 19740772


Ver el vídeo: Epigenética: mucho más que genes 12 (Octubre 2022).