We are searching data for your request:
Upon completion, a link will appear to access the found materials.
Los protocolos a menudo parecen usar promotores regulables cuando expresan un gen heterólogo en un huésped como la levadura, donde agregan algo como IPTG para inducir la expresión de (digamos) el promotor lac.
¿Hay alguna razón para hacer esto en lugar de utilizar un promotor constitutivo? es decir, ¿hay razón para pensar que los promotores regulables (inducibles) tienen niveles de expresión más altos que los promotores constitutivos?
En otras palabras, ¿qué utilidad tiene tener un "interruptor" externo, es decir, el IPTG para activar la expresión a pedido en lugar de simplemente aumentar el nivel de expresión predeterminado utilizando un promotor que no requiera inducción?
El objetivo aquí es la síntesis de pequeñas biomoléculas por fermentación industrial de una levadura transgénica.
Protocolo de ejemplo:
Las células de E. coli L21 Star ™ (DE3) (Invitrogen) se cotransformaron con los plásmidos pACYCDuet-4506 y Ct94-pETDuet y las células transformadas se seleccionaron en carbenicilina (50 μg / ml) cloranfenicol (34 μg / ml) LB-agarosa platos. Se utilizaron colonias individuales para inocular 5 ml de medio LB con 50 μg / ml de carbenicilina y 34 μg / ml de cloranfenicol. El cultivo se incubó durante la noche a 37ºC. Al día siguiente, se inocularon 2 ml de medio TB suplementado con los mismos antibióticos con 0,2 ml del cultivo nocturno. Después de 6 horas de incubación a 37 ° C, el cultivo se enfrió a 28 ° C e IPTG 1 mM, mevalonato 2 mg / mL (preparado disolviendo mevalonolactona (Sigma) en NaOH 0.5N a una concentración de 1 g / mL e incubando la solución durante 30 minutos a 37ºC) y se añadieron 0,2 ml de decano a cada tubo. Los cultivos se incubaron durante 48 horas a 28 ° C.Los cultivos se extrajeron luego dos veces con 2 volúmenes de acetato de etilo, la fase orgánica se concentró a 500 μL y se analizó por GC-MS como se describió anteriormente en el Ejemplo 3. En estas condiciones sesquiterpeno rutinariamente se alcanzaba una producción superior a 200 mg / L. Se produjo beta-santaleno.
Los promotores heterólogos a menudo expresan genes que son tóxicos para el organismo cuando se expresan en cantidades demasiado elevadas. Cuando los genes se expresan de manera constitutiva, el organismo crecerá lentamente o morirá antes de alcanzar una alta densidad adecuada para la producción de la proteína.
Como tal, no se trata de expresar los genes todo el tiempo, sino de expresar la máxima cantidad de producto génico durante el período de tiempo más corto. No tiene sentido que las células expresen el producto génico todo el tiempo, si primero no pueden alcanzar densidades suficientes. Se producirá más producto si se permite que las células crezcan hasta una densidad relativamente alta, y luego se induzca la expresión en todas ellas. Esto permitiría niveles de producción relativamente grandes en un corto período de tiempo.