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¿Se transcriben ambas copias (parciales) de ADN en las fases S y G2 del ciclo celular?

¿Se transcriben ambas copias (parciales) de ADN en las fases S y G2 del ciclo celular?


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Durante un poco menos de la mitad del ciclo celular, una cantidad significativa de genes se representan dos veces (justo antes de dividirse). ¿La célula diferencia entre estos ADN de alguna manera o las tasas de transcripción están limitadas por la cantidad de polimerasa de todos modos?


No puedo decir inequívocamente, al menos sin una revisión adicional de la literatura, que ambas cromátidas hermanas se transcriben por igual en todas partes, especialmente porque la célula tiene mecanismos para diferenciar entre las cadenas de ADN antiguas y nuevas (como el estado de metilación). Sin embargo, sería concebible esperar que los mismos factores reguladores que estaban presentes antes de la replicación tengan el mismo efecto en el ADN recién sintetizado que en el antiguo. Aquí hay algunas micrografías electrónicas que muestran la transcripción de ambas cromátidas en algún locus.

McKnight SL, Miller, OL Jr. 1979. Unidades de transcripción no ribosomales post-replicativas en embriones de D. melanogaster. Celda 17: 551-563

Aquí puede ver ARN (línea continua en el esquema, b) de longitud creciente ramificándose de ambas cromátidas hermanas (línea de puntos):

Una imagen similar pero esta vez mostrando la bifurcación de replicación (flecha):

Esta imagen muestra espacios libres de ARN (flechas) en una sola unidad de transcripción, que son simétricos entre las dos cromátidas:

De lo que concluyen:

La observación de que los espacios libres de fibras a menudo ocurren en posiciones simétricas en las unidades de transcripción de cromátidas hermanas sugiere que las dos unidades de transcripción idénticas responden de manera similar a los mecanismos que controlan la iniciación de la cadena de la ARN polimerasa. Estos no se pueden especificar ahora, pero podrían incluir el suministro local de ARN polimerasa u otras moléculas de control.


¿Se transcriben ambas copias (parciales) de ADN en las fases S y G2 del ciclo celular? - biología

El reloj circadiano y el ciclo celular están estrechamente acoplados y oscilan con la misma frecuencia (acoplamiento 1: 1).

Los genes del reloj circadiano regulan los puntos de control del ciclo celular y la progresión del ciclo celular.

La expresión de los genes del reloj circadiano a menudo está desregulada en el cáncer y la alteración circadiana predispone al cáncer.

Las diferencias en el acoplamiento entre el reloj circadiano y el ciclo celular en células normales y cancerosas podrían usarse para optimizar la terapia del cáncer (cronoterapia).


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Mitosis y meiosis

Una G0P0 de 36 años acude a la clínica de fertilidad porque ha tenido problemas para quedar embarazada. Es profesora de biología en la escuela secundaria y acaba de enseñar a sus alumnos sobre la mitosis y la meiosis. Ella le pide que le explique cómo se forman los óvulos y usted comienza explicando el proceso de maduración desde la célula germinal primordial hasta el ovocito primario. ¿En qué fase de la división celular se detienen los ovocitos primarios?

Enlaces a exámenes de mitosis y meiosis

Revisores de contenido:

Colaboradores:

Prácticamente todo lo que está vivo, desde una humilde bacteria hasta una ballena azul bebé, tiene dos objetivos principales: crecer y reproducirse.

Nuestras células no son diferentes. Crecen y se reproducen.

Pero la parte de reproducción se puede realizar de dos formas distintas: mitosis o meiosis.

La mitosis da lugar a células hijas que son casi idénticas a la célula madre en términos de su información genética.

Mientras que en la meiosis las células hijas o gametos, los espermatozoides en los machos y los óvulos en las hembras, obtienen solo la mitad de la información genética de la célula madre.

Estos gametos pueden luego emparejarse con gametos completamente diferentes para formar una célula que es bastante diferente de la célula madre.

Esta célula recién formada puede hacer mitosis para formar un organismo completamente nuevo.

La mayor parte del ciclo celular se lleva a cabo por interfase, que son las actividades celulares habituales del día a día, incluido el crecimiento, la síntesis de proteínas, la creación de nuevos orgánulos, etc.

La interfase tiene tres fases: G1, S y G2.

La primera fase se llama G1.

Durante G1, la célula se agranda en preparación para la división celular.

En este punto, los 46 cromosomas parecen espaguetis y se denominan fibras de cromatina.

Cada fibra de cromatina está hecha de una única copia del material genético, llamada cromátida.

Durante la fase S, cada cromátida se copia y pega, por lo que todavía hay 46 cromosomas, pero cada cromosoma ahora tiene dos cromátidas hermanas.

Las dos cromátidas se unen en una región llamada centrómero, lo que suma un total de 92 cromátidas.

Durante G2, la célula crece un poco más antes de entrar finalmente en la mitosis.

Algunas células, como las neuronas, entran en lo que se llama la fase G0, donde básicamente continúan viviendo pero no se dividen.

Pero la mayoría de las células entran en la mitosis después de G2, y la mitosis se puede dividir en cuatro fases distintas: profase, metafase, anafase y telofase, y puede recordarlas como PMAT, una alfombra sobre la que orinas.

Al comienzo de la profase, las fibras de cromatina se condensan, lo que significa que comienzan a desenredarse para formar cromosomas individuales.

Cada cromosoma inicia la mitosis con dos cromátidas hermanas.

Durante la profase, hay dos orgánulos llamados centrosomas que se encuentran uno frente al otro justo fuera del núcleo.

Entonces, si el núcleo es un "globo", un centrosoma está en el Polo Norte, mientras que el otro está en el Polo Sur.

Cada centrosoma tiene dos centríolos, que son estructuras de proteínas colocadas en ángulos rectos entre sí, por lo que parecen un signo "+".

Ahora, cada centríolo envía fibras del huso hechas de proteínas de microtúbulos que se extienden desde el centríolo hacia los centrómeros en todos los cromosomas.

Estas fibras del huso ayudan a posicionar suavemente el cromosoma hacia el centro exacto entre los dos centrosomas.

El siguiente paso en la mitosis es la metafase, que tiene una fase temprana llamada prometafase, y una fase tardía que se conoce como la "metafase" real.

Durante la prometafase, la membrana nuclear y el nucleolo se desintegran.

Luego, durante la metafase, los cromosomas se alinean perfectamente en la línea media de la célula, a lo largo de lo que se llama placa de metafase.

A lo largo de la metafase, las fibras del huso continúan uniéndose a un punto específico en el centrómero de cada cromosoma, llamado cinetocoro.

Cuando un microtúbulo de cada centrosoma se ha conectado al cinetocoro de cada cromosoma, comienza la anafase.

Durante la anafase, los centrosomas comienzan a tirar de las fibras del huso para separar las cromátidas hermanas, como un breve pero poderoso juego de tira y afloja.

Dado que ambos centrosomas tiran con la misma fuerza en direcciones opuestas, las cromátidas hermanas se separan y se tiran hacia los polos opuestos de la célula.

Finalmente, durante la telofase, se forma una nueva envoltura nuclear alrededor de cada centrosoma y los cromosomas, que, en este punto, están formados por una sola cromátida cada uno.

Entonces, por un breve momento, la célula tiene dos núcleos.

Ahora, durante toda la mitosis, la membrana celular se aprieta gradualmente más y más, como un cinturón invisible, hasta que realmente separa la célula en dos células hijas.


¿Se transcriben ambas copias (parciales) de ADN en las fases S y G2 del ciclo celular? - biología

Mitosis es el nombre para el tipo de división celular que produce un mayor número de células = multiplicación celular tras división, las células hijas tienen aproximadamente la mitad del tamaño de su progenitor y crecen antes de que vuelva a ocurrir la división. Una célula se divide en dos células hijas que son genéticamente idénticas a la célula original y entre sí. Las células se multiplican para agrandar un organismo, reparar daños o multiplicar el número de organismos de ese tipo.

El ciclo celular se refiere a la serie continua de divisiones que alternan con el crecimiento celular: interfase & # 151mitosis & # 151interfase & # 151mitosis & # 151interfase. Un acrónimo del ciclo celular es. IPMAT IPMAT IPMATI. La mayor parte del tiempo una célula está en interfase, la etapa de crecimiento y preparación del ciclo.

Mitosis, el proceso real de división tiene cuatro fases definidas: profase, metafase, anafase y telofase, luego las células hijas entran en interfase. La mitosis es un proceso continuo, y las fases se mezclan entre sí, a menudo puede ser difícil saber si una imagen está en la última parte de una fase o en la primera parte de otra. Los vemos mostrados en los libros como instantáneas de un instante particular en el proceso, tienes que juzgar lo que estaba sucediendo & # 147 cuando la música se detuvo & # 148.

Nota: Las células vegetales a menudo tienen forma de cajas porque están rodeadas por una pared celular al final de la mitosis, la placa celular divide las dos células hijas. Las células animales toman una variedad de formas diferentes al final de la mitosis, se forma un cuello para separar las dos células hijas.

Diapositivas y # 151 FASES DEL CICLO CELULAR:

DIVISIÓN DE CÉLULAS VEGETALES & # 151 meristema de raíz de Allium cepa, la cebolla de jardín

Allium punta de la raíz:

Telofase y citocinesis:

DIVISIÓN DE CÉLULAS ANIMALES Y # 151 Etapa de blástula embrionaria del pescado blanco

Blastula de pescado blanco:

Telofase y citocinesis:

REAFIRMANDO LO QUE APRENDIÓ ACERCA DE LOS PASOS EN MITOSIS

Modelado de la mitosis con limpiapipas y perlas: los limpiapipas representan cromosomas y las perlas representan centrómeros.

Utilice estos modelos para mostrar en detalle el comportamiento de los cromosomas a través de una ronda del ciclo celular, es decir, la interfase (G 1 , S, G 2 ) a través de la división celular (pasos de mitosis [profase, metafase, anafase y telofase] y citocinesis) de regreso a la interfase. Revisará las etapas de las células haploides y diploides.

TRAE POR LO MENOS CUATRO LÁPICES DE DIFERENTES COLORES A LA CLASE.

Células haploides que sufren mitosis

  • 4 limpiapipas: 2 limpiapipas largas del mismo color y 2 limpiapipas cortas del mismo color.
  • 4 cuentas del mismo color.

Mientras trabaja con los limpiapipas, use sus lápices de colores para diagramar cada etapa en los círculos del diagrama.

  1. Configure los limpiapipas y las perlas para representar la Interfase G 1 .
  2. Exprima un limpiapipas idéntico a través de cada centrómero para representar el resultado de la replicación en la Interfase S.
  3. Continuar por G 2
  1. profase
  2. metafase
  3. anafase (agregue centrómeros según sea necesario)
  4. telofase
  5. citocinesis

Terminos adicionales debería haber aplicado / aprendido: replicación, cromosoma bicatenario, cromátida hermana, cromosoma monocatenario, centrómero, aparato del huso, plano ecuatorial, placa celular (solo para plantas) y surco de escisión (solo para animales).

Células diploides que sufren mitosis

  • 4 limpiapipas largos: 2 limpiapipas largos de un color y 2 limpiapipas largos de un color diferente.
  • 4 limpiapipas cortos: 2 limpiapipas cortos de un color 2 limpiapipas cortos de un color diferente.
  • 8 cuentas del mismo color.

Mientras trabaja con los limpiapipas, use sus lápices de colores para diagramar cada etapa en los círculos del diagrama.

  1. Configure los limpiapipas y las perlas para representar la Interfase G 1 .
  2. Exprima un limpiapipas idéntico a través de cada centrómero para representar el resultado de la replicación en la Interfase S.
  3. Continuar por G 2
  1. profase
  2. metafase
  3. anafase (agregue centrómeros según sea necesario)
  4. telofase
  5. citocinesis

Terminos adicionales: cromosomas homólogos

Explique a su vecino y a su instructor lo que ha hecho. Relacione su modelo con las imágenes de mitosis en Allium meristemo de la punta de la raíz y blástula de pescado blanco.


Resultados

La estratificación de las HSPC mediante el análisis del transcriptoma de una sola célula destacó 15 grupos diferentes

Para caracterizar las poblaciones de HSC por RNAseq de célula única (scRNA-seq), purificamos HSPC, incluidas LTHSC, STHSC, MPP2 y MPP3 por FACS de grupos de BM de jóvenes (norte = 5 2-3 meses) y envejecido (norte = 5 17-18 meses) ratones que aplican la estrategia de marcadores Lin -, Sca1 +, cKit + (LSK) ampliamente utilizada con la adición del marcador Flt3 para excluir los LSK Flt3 + también denominados MPP4 (Fig. 1a y archivo adicional 1 : Fig. S1A). Se sometieron cuatro grupos (2 grupos de jóvenes y 2 de ancianos) de miles de HSPC a la plataforma de captura de cromo genómico 10x y se secuenciaron un total de 15.000 transcriptomas de HSPC individuales (grupos jóvenes, con 5189 y 2244 células y grupos envejecidos con 3328 y 4154 células después del control de calidad Archivo adicional 2: Cuadro S1). Como asumimos que el envejecimiento no modificaría drásticamente la identidad de las HSC, primero analizamos las HSPC jóvenes y envejecidas juntas utilizando el flujo de trabajo de Seurat [25] para la integración de las diferentes muestras para corregir el efecto del lote. La reducción de la dimensión y la agrupación no supervisada se realizaron en datos corregidos por ciclo celular utilizando Aproximación y proyección de colector uniforme (UMAP) [26]. Se identificaron un total de 15 conglomerados (Fig.1b), que se caracterizaron aún más identificando sus marcadores mediante el análisis de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en los datos normalizados logarítmicamente sin ninguna corrección (archivo adicional 3: Tabla S2) y deduciendo su características (Fig. 1c) del análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (Ontología de genes, KEG y vías de Reactome Archivo adicional 4: Tabla S3) y firmas de genes relacionados con la hematopoyesis (Archivo adicional 5: Tabla S4a). Seis grupos se clasificaron como grupos cebados por linaje, ya que estaban claramente enriquecidos para HSPC con marcadores de genes de compromiso de megacariocitos (pMk), eritroides (pEr), neutrófilos (pNeu), mastocitos (pMast) y linfocitos (pL1 y pL2) (Fig. 1b – d Archivo adicional 3: Tabla S2, Archivo adicional 4: Tabla S3 y Archivo adicional 5: Tabla S4a). Nueve agrupaciones se consideraron no preparadas debido a su falta de expresión de genes restringidos de linaje. Representaron una gran mayoría de las celdas analizadas (90%) (Fig. 1b – d Archivo adicional 3: Tablas S2 y Archivo adicional 5: S4b). Las 4 HSPC fenotípicamente distintas, LTHSC, STHSC, MPP2 y MPP3 se asignaron mediante clasificación supervisada utilizando datos de scRNA-seq publicados anteriormente de HSPC etiquetados con FACS [11] (Archivo adicional 1: Fig. S1B) y se superpusieron en el UMAP ( Figura 1e). Esto mostró que globalmente MPP2 y MPP3 se componían de grupos primarios de linaje, lo que sugiere su estado "más diferenciado" en comparación con los grupos restantes, mientras que las LTHSC se enriquecieron con grupos no primarios (Fig. 1e). La distribución de las diferentes poblaciones entre los conglomerados mostró que el conglomerado con sesgo de neutrófilos (pNeu) estaba casi exclusivamente enriquecido con MPP3 (98%), mientras que pMast y pEr estaban enriquecidos tanto con MPP2 como con MPP3 (Fig.1f y archivo adicional 5: Tabla S4c). El grupo de pMK estaba compuesto por casi el 50% de las LTHSC, lo que respalda el trabajo previo que sugiere que las células madre con sesgo de plaquetas residen en el vértice de la jerarquía de las HSC [27].

La agrupación no supervisada de HSPC jóvenes y envejecidas reveló 15 grupos que reunían principalmente HSPC inmaduras y, en menor medida, preparadas por linaje. a Descripción general de la preparación y el análisis de muestras de scRNA-seq. Las células se aislaron de la médula ósea (BM) de ratones jóvenes y envejecidos y se combinaron para obtener 2 grupos para cada edad. Se analizaron grupos de 2 y 3 BM para ratones jóvenes y ancianos. Las células de BM se clasificaron mediante FACS para purificar las células Lin -, Sca-1 +, c-Kit + (LSK) Flt3 - que definían las HSPC. Los cuatro grupos de HSPC se procesaron mediante secuenciación de una sola célula basada en gotas (10X Genomics) y se realizaron múltiples análisis utilizando herramientas bioinformáticas para caracterizar los efectos del envejecimiento. B Gráfico UMAP de HSPCs jóvenes y envejecidas (15.000 células) analizadas usando Seurat. Los colores marcaron los 15 grupos distintos identificados por agrupamiento no supervisado y caracterizados con expresión de genes diferencial y análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. Cada punto representa una celda. C Enriquecimiento seleccionado de nuestro análisis (Ontología genética, Vías KEG y Reactome, Tabla complementaria S3) para los marcadores de cada grupo y los correspondientes pag valores ajustados para pruebas múltiples (padj). NA indica enriquecimiento no relevante. D Gráficos UMAP coloreados por expresión de marcadores de racimo seleccionados. Los nombres de los conglomerados se indican entre paréntesis. mi Localización en el UMAP de LTHSC, STHSC, MPP2 y MPP3, identificados por clasificación supervisada. F Porcentaje de LTHSC, STHSC, MPP2 y MPP3 dentro de la población de HSPC, en cada uno de los 15 grupos. gramo Porcentaje de fases del ciclo celular asignadas computacionalmente (G1 / G0, S y G2 / M) en cada uno de los 15 grupos

Cuatro grupos no preparados, np1, np2, np3 y np4, se superpusieron y se colocaron en el centro de la UMAP (Fig.1b) con pocos marcadores genéticos específicos (Fig.1c, d Archivo adicional 3: Tabla S2 y archivo adicional 1: Fig. S2). Se caracterizaron por un alto porcentaje de LTHSC (Fig. 1e, f Archivo adicional 3: Tabla S2). Por el contrario, 2 grupos, también compuestos principalmente de LTHSC, albergaron una firma muy distinguible para la señalización del factor de crecimiento (tgf) y la respuesta de interferón (ifn) respectivamente (Fig. 1b-dy Archivo adicional 4: Tabla S3), lo que demuestra la existencia de células con características de señalización en la parte superior de la jerarquía de diferenciación. Los 3 grupos restantes (diff, div y rep) estaban compuestos por menos del 50% de LTHSC (Fig. 1e y archivo adicional 5: Tabla S4c), lo que sugiere su estado intermedio en términos de diferenciación. El grupo llamado diff tenía muy pocos marcadores distinguibles pero estaba enriquecido con Cd34 expresar las células (Fig. 1d y archivo adicional 1: Fig. S2). Curiosamente, este grupo fue el más enriquecido con STHSC (Fig. 1e y Tabla complementaria S4c), que se han caracterizado por la aparición de Cd34 en su superficie [2]. El clúster div, caracterizado por el enriquecimiento de la vía del ciclo celular KEGG (Fig.1c y archivo adicional 4: Tabla S3) y genes implicados en la división como Hmmr2 (Fig. 1d y archivo adicional 1: Fig. S2), fue particularmente diferente de los otros grupos por su enriquecimiento en células G2 / M (Fig. 1g y archivo adicional 5: Tabla S4d). El grupo rep se caracterizó por genes involucrados en la reparación y replicación del ADN y presentó una alta expresión específica de Uhfr (Fig. 1c, dy archivo adicional 1: Fig. S2 y archivo adicional 4: Tabla S3).

En conjunto, estos resultados destacan el interés de la firma de expresión génica para identificar la heterogeneidad en la población de HSC. Apoyan la presencia de células con sesgo de diferenciación en el compartimento hematopoyético inmaduro y demuestran que los programas transcripcionales pueden subdividir las HSPC en diferentes grupos además de su estado de diferenciación clásico definido por marcadores de superficie celular.

El envejecimiento afecta a los grupos de HSPC de manera diferente

Para evaluar el efecto del envejecimiento a nivel de las poblaciones de HSC, primero confirmamos mediante análisis FACS y predicciones de población celular basadas en la transcriptómica la acumulación bien descrita de LTHSC que se produce a expensas de las STHSC y el MPP3 al envejecer (archivo adicional 1 : Fig. S1C y D). El análisis de células jóvenes versus envejecidas en el gráfico UMAP mostró que las células envejecidas estaban significativamente más distribuidas en los grupos no cebados mientras que los grupos cebados por linaje se enriquecieron con HSPC jóvenes (Fig. 2a, b). De hecho, los grupos linfoide cebado (pL1) y mieloide cebado (pMast, pNeu y pEr) estaban compuestos predominantemente por células jóvenes (Fig. 2b y archivo adicional 5: Tabla S4e). Se observó una excepción para el grupo pL2, aunque representaba muy pocas células, este grupo, caracterizado con marcadores de células B, estaba compuesto principalmente por personas de edad avanzada (Fig. 2b y archivo adicional 5: Tabla S4b y e). Curiosamente, estas células potencialmente envejecidas con sesgo B se caracterizaron, además de la expresión de marcadores de células B tempranas como Ly6d y Cd79a (Fig.1d, archivo adicional 1: Fig. S3 y archivo adicional 3: tabla S2), por Trp53inp1 expresión, por lo que recientemente demostramos su participación en el bloqueo del paso temprano del desarrollo de células B [28]. El análisis de los números absolutos de HSPC clasificadas por ratón confirmó el mayor aumento de los grupos no cebados en comparación con los cebados al envejecer (Fig. 2c). Este aumento en las subpoblaciones de HSC se marcó especialmente para los grupos np1, np2, ifn y tgf no cebados que se amplificaron en gran medida en condiciones de edad (Fig. 2c y archivo adicional 5: Tabla S4e). Este resultado destaca una amplificación de las LTHSC que son capaces de responder a diferentes estímulos como la señalización inf y tgf que pueden superponerse con subpoblaciones de HSC previamente informadas, lo que promueve respuestas diferenciales al desafío inflamatorio en las HSC envejecidas [29]. Notablemente, observamos que la disminución inducida por la edad del clúster pL1 y el aumento del clúster tgf fueron impulsados ​​principalmente por un lote, específico para cada uno de ellos (Archivo adicional 5: Tabla S4e) que presencia la heterogeneidad del envejecimiento entre grupos de ratones.

El envejecimiento afecta a los grupos de HSPC de manera diferente. a Gráfico UMAP (igual que en la Fig. 1b) que muestra las HSPC jóvenes (naranja) y envejecidas (púrpura). B Distribución de HSPC jóvenes (naranja) y envejecidas (violetas) en los racimos. El panel de la izquierda presenta los porcentajes de HSPCs jóvenes y envejecidas en los racimos cebados / no cebados reunidos y en cada uno de los 15 racimos. La línea vertical negra indica las proporciones esperadas de células jóvenes y envejecidas según el tamaño del conjunto de datos. Nombres de los grupos para los que la proporción de células jóvenes o envejecidas fue significativamente mayor de lo esperado (prueba hipergeométrica pag value & lt 0.05) están coloreadas de púrpura para las células envejecidas y de naranja para las células jóvenes. A la derecha, los diagramas de barras representan el número de celdas que componen cada conjunto: clústeres cebados / no cebados reunidos y clústeres individuales. C Número absoluto por ratón de HSPC jóvenes y envejecidas clasificadas en los 15 grupos

A partir de estos resultados, llegamos a la conclusión de que ni las HSPC ni los individuos se ven afectados por igual por el envejecimiento. A nivel mundial, la hematopoyesis envejecida proviene de HSPC que no están cebadas por linaje y se caracterizan por firmas de señalización específicas.

La expresión génica se altera más con el envejecimiento en grupos no preparados, con una pérdida de diferenciación y una ganancia de firmas de hemostasia

Para revelar cambios dependientes de la edad en la expresión génica, primero comparamos los transcriptomas de HSPC jóvenes y mayores. El análisis de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) destacó una firma global de envejecimiento de las HSC que se caracterizó por una regulación positiva del gen del estrés Nupr1, los marcadores de linaje plaquetario Vwf y Clu, y marcadores de HSPC indiferenciados como Procr y Slamf1, así como por una regulación a la baja de genes que marcan la diferenciación de las HSC, como Cd34 y Cd48 (Archivo adicional 1: Fig. S4 y Archivo adicional 6: Tabla S5). Estos resultados están en consonancia con el potencial de diferenciación alterado y el sesgo plaquetario de las HSPC envejecidas [23] y una firma de envejecimiento completa de las HSC publicada recientemente [30].

Con el fin de evaluar la heterogeneidad de los cambios del transcriptoma en el envejecimiento de acuerdo con los grupos de HSC, analizamos los cambios en la expresión génica de cada grupo por separado (archivo adicional 7: Tabla S6). El mapa de calor de los genes expresados ​​de forma más diferencial (DEG) (cambio de pliegues logarítmicos & gt 0.5) tras el envejecimiento analizados por grupos mostró que los grupos no cebados exhibían más diferencias en su transcriptoma que los cebados y que estas diferencias estaban dirigidas a un aumento de la expresión génica en lugar de una disminución, lo que sugiere una mayor variabilidad transcripcional de célula a célula al envejecer (Fig. 3a y archivo adicional 1: Fig. S6). Para estos grupos no cebados, excepto para el grupo tgf, el análisis de expresión génica diferencial por grupo siguió la firma de envejecimiento que se observó al analizar la totalidad de las células (R 2 & GT 0.8 Archivo adicional 6: Fig. S5). El análisis de enriquecimiento de DEG al envejecer reveló una regulación negativa del desarrollo de órganos hematopoyéticos o linfoides (HLOD) marcada por la regulación a la baja de Cd34, Plac8, y Foxo3 (Archivo adicional 8: Tabla S7A), junto con una regulación positiva de la hemostasia con Clu y Selp aumento de la expresión, genes de la molécula de adhesión celular (CAM), como Alcam, Jam2, Complejo principal de histocompatibilidad (MHC), genes H-2 y genes involucrados en la regulación errónea de la transcripción en el cáncer (TMC) (Archivo adicional 8: Tabla S7B). Enriquecimiento de TMC, además de TF como Fli1 y Pbx1, se basa en inhibidores de la quinasa del ciclo celular Cdkn1a y Cdkn2c y el gen de respuesta al estrés Nupr1 sugiriendo una desregulación de las fases del ciclo celular al envejecer. A nivel mundial, encontramos que las diferencias de puntuación de características de envejecimiento eran más pronunciadas en los grupos no preparados que en los grupos preparados por linaje (Fig. 3b Archivo adicional 8: Tabla S7C). Sin embargo, destacamos que dos clústeres cebados por linaje, los clústeres pL1 y pMK, se vieron afectados transcripcionalmente por el envejecimiento, con un aumento en las firmas HEM, TMC y CAM (Fig. 3b y archivo adicional 8: Tabla S7C). Estas observaciones se confirmaron mediante el análisis de una puntuación de firma de envejecimiento calculada recuperada de una firma de envejecimiento integral [30] a través de los grupos (Fig. 3b y archivo adicional 8: Tabla S7C). Al observar algunos genes de forma individual, pudimos destacar algunos cambios relacionados con la edad que afectan a grupos particulares. Observamos una regulación a la baja del gen de las células T Tcrg-C4 en el grupo pL1 envejecido y una regulación positiva del gen de mastocitos de proteasa Mcpt8 y gen de la integrina mieloide Fcer1a en el clúster pMast y pNeu envejecido respectivamente (Fig. 3c y archivo adicional 7: Tabla S6). Observamos una regulación al alza de Alcam requerido para el mantenimiento de HSC en el clúster np2 envejecido (Fig. 3c y archivo adicional 7: Tabla S6). Finalmente, también observamos un transcriptoma muy específico en el clúster de tgf envejecido caracterizado por un aumento de genes involucrados en la quiescencia de las HSC como Cdkn1a, Nr4a1 (Fig. 3c), que se agruparon en el mapa de calor de DEG al envejecer (Fig. 3a).

La expresión génica se altera más durante el envejecimiento en grupos no cebados con pérdida de diferenciación y ganancia de firmas de hemostasia. a Mapa de calor de los genes expresados ​​diferencialmente (DEG) más significativos durante el envejecimiento (pag valor & lt 0,05 y cambio log veces mayor & gt 0,5 en al menos un grupo) en los diferentes grupos revelados por el análisis de Seurat (Fig. 1b). Las agrupaciones preparadas por linaje se recopilan y etiquetan como preparadas. Las barras de colores superiores indican la identidad del grupo de acuerdo con el código de color de la Fig. 1b. Las barras de colores inferiores indican la proporción de células jóvenes (naranja) y envejecidas (violetas) en un grupo determinado. La expresión genética está estandarizada en todo el conjunto de datos. B Gráficos de violín combinados que muestran puntuaciones distintivas (eje x) en condiciones jóvenes (naranja) y envejecidas (violeta) por grupo. Las puntuaciones de firma representan la expresión global de genes anotados para términos seleccionados del análisis de enriquecimiento emitido por DEG durante el envejecimiento (pag value & lt 0.05 y log fold change & gt 0.25 en al menos un grupo) y para la firma de envejecimiento de HSC de Svendsen et al. (enriquecimiento significativo, prueba hipergeométrica pag valor & lt 10 −78). Términos significativos (enriquecimiento gprofiler pag valor & lt 0,05) son: Desarrollo de órganos hematopoyéticos o linfoides (HLOD) recuperado de GO: Proceso biológico, Hemostasia (HEM) recuperado de las vías REACTOM, Molécula de adhesión celular (CAM) recuperada de las vías KEGG, Complejo proteico MHC (MHC) recuperado de GO : Componente celular, falta de regulación transcripcional en cáncer (TMC) recuperado de la vía KEGG. Consulte las Tablas complementarias 7A y amp B para ver las listas de genes enriquecidos en los términos. Las estrellas muestran diferencias significativas entre los puntajes característicos de las células jóvenes y envejecidas, por grupo (diferencia de puntaje promedio & gt 0.1 y pag valor & lt 0.05). C Gráfico de violín combinado que muestra la expresión del marcador de envejecimiento en condiciones jóvenes (naranja) y envejecidas (púrpura) para los diferentes grupos. Las estrellas muestran diferencias significativas en la expresión génica entre las células jóvenes y las envejecidas (cambio promedio logarítmico & gt 0,25 y pag valor & lt 0.05)

En conjunto, nuestros resultados revelaron cambios particulares relacionados con la edad que afectan principalmente al transcriptoma de HSPC de grupos no cebados y se caracterizan por una pérdida de genes de diferenciación que podrían explicar los cambios funcionales del compartimento hematopoyético envejecido.

La trayectoria de diferenciación muestra una progresión de HSPC hacia los destinos T, Mast / Neu y Mk / Er que se altera con la edad

Recientemente se ha sugerido que las HSC se someten a un proceso de diferenciación continuo en lugar de un proceso escalonado [12]. Con el fin de captar y comprender mejor la progresión de este proceso de diferenciación durante el envejecimiento, construimos trayectorias de pseudotime ordenando las HSPC basadas en las similitudes entre sus perfiles de expresión con Monocle [31]. Primero generamos las trayectorias de las HSPC jóvenes y envejecidas por separado, que mostraban una forma muy similar, con la excepción de un grupo de células que se separaban de la trayectoria envejecida, y hechas exclusivamente de células pL2 (archivo adicional 1: Fig. S7A). Debido a que estas células se detectaron solo en HSPC envejecidas y estaban claramente distantes del resto de las células en el UMAP (Fig. 1b), las excluimos para la agrupación y el pedido de células para ambas edades. Por lo tanto, analizamos la trayectoria de diferenciación inferida a partir de células jóvenes y envejecidas agrupadas, sin células pL2. La trayectoria resultante se dividió en 5 segmentos, denominados estados 1, 2, 3, 4 y 5 del monóculo (Fig. 4a). La salida de la trayectoria se identificó en el extremo del estado 1, ya que este estado poseía el mayor porcentaje de LTHSC (Fig. 4b, c). Los estados 2, 4 y 5 se enriquecieron con MPP, lo que sugiere su progresión hacia estados diferenciados (Fig. 4b, c). Caracterizamos los 5 estados de la trayectoria con firmas previamente publicadas relacionadas con las HSPC y la hematopoyesis (referenciada en el archivo adicional 9: Tabla S8A) y con nuestro análisis de marcadores de estado (archivo adicional 9: Tabla S8B & amp S8C). Revelamos que las HSPC en el estado 1 expresaron una firma de HSC con especialmente células que expresan el marcador de HSC inactivo (Procr) las células del estado 2 (después de la primera bifurcación) se caracterizaron con firma de células T vírgenes y expresaban Gata3, lo que sugiere un estado de diferenciación linfoide cebado (Fig. 4d) estado 4 las células se caracterizaron por una firma mieloide [32] y una alta expresión de Hdc, reportado previamente como un marcador de HSPCs con sesgo mieloide [33], mientras que las células en el estado 5 presentaron una firma de Progenitores de Eritrocitos Megacariocitos (MEP) [34] y expresaron Gata1 un marcador MEP (Fig. 4d).

La trayectoria de diferenciación de HSPC reveló una clara división entre las células cebadas L, MastNeu y MkEr. a Trayectoria de diferenciación generada usando Monocle 2 con todas las HSPC excepto las células pL2 que fueron excluidas. Las celdas están coloreadas según cinco estados (1 gris, 2 amarillos, 3 verdes, 4 naranjas y 5 azules), que dividen la trayectoria. B Gráficos de barras que representan las proporciones de LTHSC, STHSC, MPP2 y MPP3 en los cinco estados. C Trayectoria de diferenciación de HSPC coloreada según los valores de pseudotime de HSPC y que representa su progresión de diferenciación. D Trayectorias de diferenciación de HSPC coloreadas de acuerdo con las puntuaciones de HSPC para las firmas de linaje hematopoyético recuperadas de la literatura (panel superior) y de acuerdo con el nivel de expresión de los marcadores de diferenciación de HSPC (panel inferior). Para las firmas, las puntuaciones positivas (rojo) o negativas (azul) indican si la expresión del conjunto de genes probado es más o menos importante que un conjunto de genes de control equivalente. Las firmas identificadas son HSC, T naive, mieloide y MEP (progenitor de eritrocitos de megacariocitos). Los marcadores de diferenciación de HSPC que se muestran son: Procr para LTHSC, Gata3 para HSPC con cebado linfoide, Hdc para las HSPC preparadas con mieloide y Gata1 para HSPC cebadas con eritrocitos-megacariocitos. mi Repartición de los clusters de Seurat a lo largo del pseudotime. Los diagramas de caja (medianas) de los valores de pseudotiempo se colorean de acuerdo con el estado más representado. F Repartición (en porcentaje) de los diferentes estados (1 a 5) de la trayectoria para cada clúster de Seurat. gramo Representación de árbol de la trayectoria de diferenciación de HSC, los bordes que representan los estados (estado 1 en gris, 2 amarillo, 3 verde, 4 naranja y 5 azul) y nodos que representan puntos pseudotime: el punto (s) de inicio, el primer punto de bifurcación ( p), el punto de bifurcación mieloide cebado (pMye) y los tres destinos: Linfocito (L), Neutrófilo / Mastocito (NeuMast) y Megacariocito / Eritroide (MkEr). h Diagrama de caja de valores de pseudotiempo para células jóvenes y envejecidas. * indica una diferencia significativa entre la distribución del valor de pseudotiempo para jóvenes y ancianos (diferencia de la mediana & gt 2,9, pag valor & lt 10 −16 prueba de suma de rangos de Wilcoxon) I, j Porcentaje de estados de Monocle en condiciones de jóvenes y ancianos, al considerar todos los estados (I) o solo los estados 2, 4 y 5 (j). * indica una dependencia significativa entre el estado y la distribución de edades (pag valor & lt 10 −10 prueba de chi-cuadrado de Pearson)

El análisis de la posición del conglomerado de Seurat y la propagación en la trayectoria fortaleció la relevancia de la diferenciación pseudotime con los conglomerados cebados por linaje ubicados en los dos extremos de la trayectoria y sugirió una especificidad de diferenciación de los estados (Fig. 4e Archivo adicional 1: Fig. S8). Además, evaluamos la similitud de nuestros valores de células pseudotime con una puntuación HSC publicada para validar su grado de tallo [35]. Al hacerlo, identificamos los dos clústeres no preparados np2 y np3, ubicados al comienzo de la trayectoria, como los más inmaduros (Archivo adicional 1: Fig. S9). El análisis de las proporciones de cinco estados en los grupos reveló una primera bifurcación que separa las células pL1 (estado 2), de las células preparadas para linajes mieloides (estado 3), y luego una clara ramificación entre las HSPC preparadas con Neu / Mast (NeuMast) (estado 4) ) y HSPC cebados con Mk / Er (MkEr) (estado 5) (Fig. 4f). La especificidad del estado 5 para la diferenciación de megacariocitos fue apoyada por la alta representación del grupo rep (Fig. 4f), caracterizado por una firma genética de reparación (Archivo adicional 4: Tabla S3), que anteriormente se asoció con el destino de los megacariocitos [36]. El orden de pseudotiempo separado de las HSPC jóvenes y envejecidas proporcionó una segregación muy similar entre las HSPC preparadas por linaje, con una bifurcación desde LTHSC (estado 6) hacia HSPC preparadas con Neu / Mast (NeuMast) (estado 7) y preparadas con Mk / Er (MkEr) ) HSPC (estado 8) (Archivo adicional 1: Fig. S7A-E). Sin embargo, la bifurcación hacia el destino de los linfocitos no se recuperó probablemente debido a la reducción del número de células pL1 debido a la división de la muestra (archivo adicional 1: Fig. S7A). Por lo tanto, para sintetizar nuestros análisis, propusimos una representación en árbol de la trayectoria de diferenciación de HSC (Fig. 4g) donde los nodos representan los puntos pseudotime y los bordes para los estados de Monocles. Contiene 6 nodos: una raíz, el (los) punto (s) de partida, dos nodos internos, el primer punto de bifurcación (p) y el punto de bifurcación mieloide cebado (pMye) y tres nodos de salida, los tres destinos Linfoide (L), Neutrófilos / Mastocitos ( NeuMast) y Megacariocitos / Eritroides (MkEr).

A continuación, comparamos la progresión de la diferenciación de las HSPC jóvenes y envejecidas. Las HSPC envejecidas parecen estar significativamente retrasadas en el pseudotime (Fig.4h), mientras que el clúster de Seurat que se extiende a lo largo de la trayectoria no mostró diferencias claras de ninguna posición de pseudotime del clúster según la edad (ninguna diferencia media superior a 0,8 unidades de pseudotime Archivo adicional 1: Fig. S10A). Al observar la proporción de los diferentes estados de Monocle de la trayectoria según la edad, se observó un aumento en las HSPC envejecidas en los estados 1 y 3 en comparación con las jóvenes (Fig.4i), pertenecientes a los grupos no primados np3, tgf, ifn, np4, diff y div (archivo adicional 1: Fig. S10B). Al centrarnos en las células de los estados 2, 4 y 5, que reflejan los 3 estados HSPC preparados por linaje, observamos que la proporción del estado 5 (destino MkEr) era mayor en la condición de edad avanzada que en la de la juventud (Fig. 4j), aunque la edad no estaba afectando el porcentaje de los estados de Monocle de las células del clúster cebadas por linaje (archivo adicional 1: Fig. S10B). Esto sugiere que, si bien se detectaron HSC menos envejecidas en las tres rutas de diferenciación, las células con destino MkEr se mantienen más al envejecer que las que están hacia los destinos NeuMast y L.

En conclusión, nuestro análisis de trayectoria reveló una preparación de las HSPC para el linaje linfoide que se produce al principio del proceso de diferenciación y evidenció una clara división entre el destino de las HSC NeuMast y MkEr que identificaron una especificación de linaje temprano de las HSC (Fig. 4g). Si bien la forma global de la trayectoria y la especificación de linaje de las HSPC se conservan con el envejecimiento, la distribución de las HSPC envejecidas a lo largo de la trayectoria de diferenciación se altera con una disminución en los estados terminales 2 y 4 que conducen respectivamente a los destinos L y NeuMast, a favor de celdas de los estados iniciales 1 y 3.

La trayectoria de diferenciación de HSPC está asociada con programas transcripcionales que se alteran con el envejecimiento.

La decisión del destino celular y la función adecuada de las HSC se basan en programas transcripcionales estrictamente controlados orquestados por la actividad del factor de transcripción (TF) [37]. Dado que el nivel de expresión de TF no es suficiente para evaluar su actividad, medimos los cambios en la actividad de TF durante la diferenciación y envejecimiento de las HSPC. Para ello, aprovechamos el enfoque de agrupación e inferencia de red reguladora de una sola célula (SCENIC) [38] que calcula la actividad de un determinado TF (puntuación de regulón) en función de la expresión objetivo y los elementos reguladores cis. Consideramos 154 TF, seleccionados de la literatura o de nuestro análisis de datos de expresión de una sola célula (marcadores de grupo Seurat), de los cuales, 58 fueron identificados como regulones activos en nuestras HSPC (Archivo adicional 10: Tabla S9A). Al observar las actividades de regulon de las HSPC jóvenes a lo largo de la trayectoria, revelamos una firma de regulon específica para cada estado (archivo adicional 10: Tabla S9B).El estado 1 se caracterizó con la actividad de los sensores de estrés Atf3, los factores de señalización de interferón, Irf1, Irf7, Irf9 y los objetivos aguas abajo de la señalización de Tgfbeta, Stat1, Klf4, Egr1, Klf6, Junb, que representan un estado de tallo (clústeres de regulones C1a y C1b Fig. 5a y C1a Fig. 5b, panel joven). La comparación de las actividades de TF entre el estado 2 y el estado 3 en la primera bifurcación (p) enfatizó el destino L del estado 2 con la detección de alta actividad de los factores de transcripción de células T Ikzf1, Sox4 (grupo de regulones C2 Fig.5a, panel joven) mientras que las células del estado 3 entran en un programa de diferenciación más general con un ligero aumento de las actividades de los regulones como Myc (grupo de regulones C3, Fig. 5a, panel joven). Como era de esperar, el envejecimiento redujo la actividad de los dos regulones en el estado 2, presenciando la reducción de la actividad linfoide durante el envejecimiento. Por el contrario, las actividades de Klf6, Junb, Jun y Stat1 de las HSC envejecidas se propagaron y aumentaron en los estados de edad 1 y 3 (Fig.5a, by Archivo adicional 10: Tabla S9C), lo cual fue consistente con la actividad de las células madre de estados de edad 1 y 3 que contienen principalmente LTHSC (Fig. 4b).

La trayectoria de diferenciación de HSPC se asocia con programas transcripcionales que se alteran con el envejecimiento. a, B Mapas de calor que muestran puntuaciones de actividad de regulón estandarizadas, recuperadas con el procedimiento AUCell de Scenic, para HSPC jóvenes (panel izquierdo) y envejecidas (panel derecho) en los estados de Monocle. Las celdas (columnas) se ordenaron según su pseudotiempo, y las barras de color en la parte superior de los mapas de calor indican el estado al que pertenece la celda (1 gris, 2 amarillas, 3 verdes, 4 naranjas y 5 azules). Los regulones (filas) se agruparon jerárquicamente, en función de su puntuación de actividad en las HSPC jóvenes. En a, Se destacan 4 grupos de regulones cuando se analiza la actividad de los regulones a lo largo de trayectorias de pseudotiempo desde sa L destino y desde sa pMye punto de bifurcación (es decir, a través de los estados 1, 2 y 1, 3 de Monocle). En B, se analiza la actividad de los regulones a lo largo de trayectorias de pseudotiempo desde s hasta NeuMast y desde s hasta MkEr (es decir, a través de los estados 1, 3, 4 y 1, 3, 5) y se destacan otros 4 grupos de regulones. Las flechas marcan los regulones para los que existe una diferencia significativa de actividad con el envejecimiento (diferencia promedio de la puntuación AUCell entre células jóvenes y envejecidas & gt 0,002 y pag valor & lt 0.05) se encontraron en al menos uno de los estados considerados (es decir, estados 1, 2 y 3 en a y 1, 3, 4 y 5 en B). El color indica si la actividad del regulón aumenta (violeta) o disminuye (naranja) en condiciones de envejecimiento.

Al observar la segunda bifurcación (pMye) entre el estado 4 y el estado 5, confirmamos que el estado 4 tenía sesgo de neutrófilos y mástil, ya que estaba respaldado con una alta actividad de C / ebpa-e, Runx1 e Irf8, involucrados en diferenciación mieloide (grupo de regulones C4 Fig. 5b, panel joven). Notablemente, el envejecimiento disminuyó la actividad de los regulones involucrados en el destino mieloide como Cebpa y -e en el estado 4 (Fig. 5b y archivo adicional 10: Tabla S9C). Este resultado fue consistente con la disminución del número de células cebadas de neutrófilos y mastocitos con el envejecimiento (observado en la Fig. 2b) y fortaleció nuestra hipótesis de que el sesgo mieloide de la hematopoyesis envejecida no vendría de esta ruta de la trayectoria. El grupo C5 del mapa de calor muestra que el estado 5 se caracterizó con una fuerte actividad de Klf1, E2f8, Ybx1, Gfi1b y Ezh2, todos los cuales están implicados en el desarrollo de eritroides / megacariocitos (grupo de regulones C5, figura 5b, panel joven). Curiosamente, la actividad de E2f8 se redujo significativamente con el envejecimiento en el estado 5, mientras que la actividad de Gfi1b aumentó considerablemente en este estado de envejecimiento. Cabe señalar que Gfi1b es el regulón que experimentó el mayor aumento de actividad con el envejecimiento, no solo en el estado 5, sino también al inicio de la trayectoria en el estado 1. Como Gfi1b es un regulador maestro de la trombopoyesis (revisado en [39 ]) y como encontramos algunos de sus objetivos, como Clu, Esam, y Serpinb1a, anotado para la hemostasia (Archivo adicional 10: Tabla S9A) regulado positivamente con el envejecimiento (Archivo adicional 8: Tabla S7B), sugerimos que Gfi1b mantiene el sesgo plaquetario de las HSPC envejecidas.

Por tanto, los análisis de actividad de TF durante el pseudotime corroboraron las características de la trayectoria e identificaron claramente una separación en la actividad de TF que explica el cebado de L (Fig. 5a) y los dos destinos mieloides distintos, NeuMast y MkEr (Fig. 5b). También indicó que el envejecimiento está asociado con cambios marcados en la expresión y actividad de TF con una ganancia de TF implicados en la actividad de las plaquetas y el tallo y una pérdida de factores específicos del linaje que impulsan el compromiso del linaje y la diferenciación terminal.

El análisis del ciclo celular a lo largo del pseudotiempo destaca un retraso en la diferenciación asociado con la detención del ciclo celular en condiciones de envejecimiento

Como una de las características distintivas del envejecimiento de las HSC es la reducción del ciclo de las HSC [40], analizamos las fases del ciclo celular de acuerdo con la edad de la BM. Mostramos un aumento de HSPC no cíclicas (G1 / G0) a expensas de las fases S y G2 / M en la BM envejecida en comparación con la joven (Fig. 6a). El análisis de la población LTHSC, STHSC, MPP2 y MPP3 por separado mostró que la edad no afectaba típicamente la proporción de fases del ciclo dentro de cada subtipo, con la excepción de un cambio leve pero significativo en LTHSC y MPP2 (Fig. 6b). Esto sugiere que el aumento de la proporción de fase G1 / G0 observado durante el envejecimiento se debe principalmente a la acumulación de LTHSC inactivas que se sabe que se detienen en la fase G1 / G0 [41] y, en menor medida, a las células intrínsecas LTHSC y MPP2. cambios de ciclo inducidos por el envejecimiento.

El análisis del ciclo celular a lo largo del pseudotiempo destaca un retraso en la diferenciación asociado con la detención del ciclo celular en condiciones de envejecimiento. a Repartición (en porcentaje) de las fases del ciclo celular (estimada con ciclón) en HSPC jóvenes y envejecidas. B Repartición (en porcentaje) de las fases del ciclo celular (estimada con ciclón) en LTHSC, STHSC, MPP2 y MPP3 en condiciones de jóvenes y ancianos. Para a y B, * indica una dependencia significativa entre la fase del ciclo celular y la distribución de edades (pag valor & lt 0.05 prueba de chi-cuadrado de Pearson). C Panel izquierdo, trayectoria de diferenciación de HSPC coloreadas de acuerdo con su puntuación para las firmas de quiescencia y proliferación previamente publicadas. Panel derecho, comparación de las puntuaciones de las firmas de quiescencia y proliferación entre HSPC jóvenes y envejecidas en pseudotiempo. D Gráfico de densidad de células jóvenes (naranja) y envejecidas (violetas) a lo largo del pseudotiempo para los destinos T (izquierda), NeuMast (centro) y MkEr (derecha). Las líneas punteadas negras y rojas marcan respectivamente los puntos de bifurcación py pMye. mi Tasa de división a lo largo del pseudotiempo para las HSPC jóvenes (naranja) y envejecidas (violeta) para los destinos T (izquierda), NeuMast (centro) y MkEr (derecha). Sobre Xeje, el pseudotiempo se cortó en 50 contenedores y se calcula una tasa de división para cada contenedor, dividiendo el número de crías (resp. envejecidas) asignadas a la fase G2M por el número total de jóvenes (resp. envejecido) celdas del contenedor. Las líneas estiradas negras y rojas marcan p y pMye pseudotime puntos de bifurcación respectivamente. F Gráfica apilada de tipos de células pronosticadas a lo largo de pseudotiempo cortado en 50 contenedores para jóvenes (parte superior de las parcelas) y envejecidas (parte inferior de las parcelas), para los destinos L (izquierda), NeuMast (medio) y MkEr (derecha). Las líneas estiradas negras y rojas marcan el pseudotiempo del punto de bifurcación py pMye, respectivamente. gramo Expresión génica suavizada a lo largo del pseudotiempo de marcadores seleccionados para HSPC jóvenes (panel superior) y envejecidas (panel inferior). Los puntos representan celdas, que están coloreadas según su pertenencia a los 5 estados diferentes (1 gris, 2 amarillos, 3 verdes, 4 naranjas y 5 azules). los y-eje está en escala logarítmica. * indica diferencias significativas en la expresión génica entre células jóvenes y envejecidas (pag value & lt 0.05) y el color de la estrella indica el estado donde se encuentra la diferencia

El posicionamiento de las células en reposo frente a las proliferativas a lo largo de las trayectorias mostró que las células en reposo estaban en la salida de la trayectoria, mientras que las células en proliferación se dirigían hacia los estados diferenciados (Fig. 6c, panel izquierdo). La comparación de las firmas de quiescencia y proliferación entre HSPC jóvenes y envejecidas mostró una ganancia de quiescencia en la condición de envejecido en la primera parte de la trayectoria (estados 1, 2 y 3) mientras que la firma de proliferación permaneció sin cambios (Fig.6c, panel derecho y Adicional archivo 11: Tabla S10A).

A continuación, abordamos la cuestión del ciclo celular y su influencia en el envejecimiento de las HSPC. Primero observamos la distribución de HSPCs jóvenes y envejecidas a lo largo de la trayectoria, analizando los destinos T, NeuMast y MkEr por separado (Fig. 6d). Al hacerlo, confirmamos la acumulación de HSPC envejecidas en el estado 1 antes del primer punto de bifurcación py la disminución de células envejecidas en los estados diferenciados 2, 4 y 5 (Fig. 6d). Para asociar el estado del ciclo celular y la acumulación celular, realizamos un análisis de alta resolución del ciclo celular de HSC a lo largo de la trayectoria trazando la proporción de células en división en contenedores de pseudotime para células jóvenes y envejecidas en destinos linfoides, NeuMast y MkEr por separado (Fig. 6e). Esto puso de relieve una pérdida dramática de células en división en condición de envejecimiento en el estado 1, con la excepción de las células ubicadas al comienzo de la trayectoria (Fig. 6e). Presumimos que estas células en división (que son LTHSC y pertenecen al grupo np3) representan la actividad del ciclo celular de las LTHSC autorrenovables. Curiosamente, no encontramos diferencias en la proporción de la fase del ciclo celular entre estos LTHSC jóvenes y ancianos (pag value & gt 0.3 Prueba de chi-cuadrado de Pearson Archivo adicional 1: Fig. S12), lo que sugiere una conservación del potencial de autorrenovación en las células madre hematopoyéticas de edad avanzada. Por oposición, la ausencia de actividad del ciclo celular de las HSPC envejecidas más adelante en el estado 1, que puede representar la actividad del ciclo celular vinculada a la diferenciación, subraya un defecto en la división celular de las HSPC envejecidas asociadas a la diferenciación (Fig. 6e). La tasa de división de las HSPC envejecidas se volvió positiva después de la primera bifurcación y fue similar a lo que observamos en las HSPC jóvenes (Fig. ciclo en HSPC envejecidas preparadas con Neu. La visualización de la distribución de los diferentes subconjuntos de HSPC confirmó la acumulación de LTHSC envejecidas a expensas de las STHSC y reveló una pérdida dramática de células preparadas con NeuMast al envejecer (Fig. 6f).

Extrajimos de nuestros análisis DEG con envejecimiento (archivo adicional 11: Tabla S10B) DEG implicados en la proliferación, diferenciación y ciclo celular y analizamos su perfil de expresión en células jóvenes y envejecidas a lo largo de la trayectoria. Observamos un aumento pronunciado en la expresión de los dos genes de división de proliferación, Ccnb1 y Mki67, en HSPC jóvenes que ocurría en el estado 1 concomitante al aumento del marcador de diferenciación Cd48 (Figura 6g). En las células envejecidas, también se detectó un aumento en la expresión de estos tres genes, pero se retrasó hasta el punto de ramificación pMye, lo que sugiere un retraso en el compromiso de las HSPC envejecidas. Para comprender los mecanismos moleculares que podrían estar involucrados en este retraso, comparamos la expresión del inhibidor del ciclo celular en trayectorias de HSPC jóvenes y envejecidas. Cdkn1a y Cdkn2c fueron regulados al alza a lo largo de la trayectoria de edad (excepto en el estado 4 para Cdkn2c) especialmente en la primera parte de la trayectoria (estados 1, 2 y 3) en comparación con la joven. Por el contrario, Cdkn1b fue regulado a la baja en los estados 1 y 2 de la trayectoria de edad (Fig. 6g y Tabla Suplementaria S10B). El cambio en la expresión con el envejecimiento de los tres inhibidores del ciclo celular que se sabe controlan el destino de las HSC indica la desregulación de las fases del ciclo celular en las HSC envejecidas. Es interesante notar que Cdkn1a se encontró que era un objetivo de Stat1, Jun y Junb, que son a su vez objetivos del regulón Klf6 (archivo adicional 10: Tabla S9A), cuatro regulones cuyas actividades aumentaron con el envejecimiento en el mismo rango de pseudotime que los cambios en el nivel de Cdkn1a expresión (Figs. 6g y 5b).

Juntos, estos resultados sugieren que las HSC envejecidas tienen un ciclo celular predeterminado, concomitante a un retraso en su programa de diferenciación, que ocurre antes del cebado del linaje de las HSPC.


Contenido: Replicación Vs Transcripción

Gráfica comparativa

Base para la comparaciónReplicaciónTranscripción
DefiniciónLa replicación es la duplicación de hebras de ácidos desoxirribonucleicos (ADN), lo que da dos hebras hijas y cada hebra contiene la mitad del ADN original. La transcripción es la formación de un único ácido ribonucleico (ARN) idéntico a partir del ADN bicatenario, lo que significa que la transcripción es el proceso posterior a la replicación.
PrincipioLa función principal de la replicación es mantener el conjunto completo del genoma para la próxima generación.La función principal de la transcripción es hacer copias de ARN de los genes de uno y aquí los genes se expresan del ADN replicado.
En que fase ocurre Ocurre en la fase S del ciclo celular.Ocurre en las fases G1 y G2 del ciclo celular.
Enzimas involucradasADN helicasa, enzimas ADN polimerasa, girasa (eucariotas).ARN polimerasa, transcriptasa.
ComprendeDesenrollamiento y división de toda la molécula de ADN (cromosoma).Desenrollar y escindir solo esos genes, que se van a transcribir.
También copia de todo el genoma.Copia de unos pocos genes seleccionados solamente.
Existe un enlace de hidrógeno entre la hebra de ADN replicada y la hebra molde.Las hebras de ARN transcritas se separan de su hebra de plantilla de ADN.
Los productos no se degradan después de su función.
Los productos se degradan después de completar su función.
El sitio del procesoEl producto permanece en el núcleo.El producto se mueve desde el núcleo hasta el citoplasma.
Requisito de imprimaciónRequiere cebador de ARN.No se requiere imprimación.
Material requerido El trifosfato de desoxirribonucleósido como dATP, dTTP, dCTP, dGTP sirve como materia prima.El trifosfato de ribonucleósido como ATP, CTP, GTP, UTP sirven como materias primas.
Resultado finalDa lugar a la formación de dos moléculas de ADN de doble hebra a partir de una molécula de ADN y, por lo tanto, da lugar a dos nuevas células hijas idénticas.Da como resultado la formación de una molécula de ARN a partir de una sección de una hebra que incluye ARNt, ARNr, ARNm y ARN no codificante (como microARN).

Definición de replicación

El ADN es una macromolécula, que transporta información genética de una generación a la siguiente. El ADN puede considerarse como banco de reserva de genética información. Es responsable de preservando la identidad de la especie durante varios años.

En el proceso de división celular, cuando la célula se divide en dos células hijas idénticas, también transfiere la información genética de la célula madre. Entonces, podemos decir que la replicación es un proceso en el que el ADN se copia a sí mismo y produce moléculas hijas idénticas de ADN.

El proceso de la replicación es diferente en procariotas y eucariotas. Aunque implica los pocos pasos comunes como el origen de la replicación, es el sitio desde donde comienza la replicación, en este sitio la enzima se adhiere y desenrolla la estructura de doble hélice en una forma simple y accesible asistida por la enzima Helicasa de ADN.

La única hebra se llama principal (hebra continua o hacia adelante) hebra mientras que la otra se llama rezagado hebra (discontinua o retrógrada). Este desenrollado expone las bases no apareadas para que sirvan como plantilla para la formación de nuevas hebras. Los extremos de la hebra tienen su nombre como 5 & ​​# 8242 y 3 & # 8242, y el proceso de replicación comienza en las direcciones 5 & # 8242 a 3 & # 8242, simultáneamente en ambas hebras.

Se dice que en procariotas la síntesis de ADN es semi-discontinuo. Se agrega el cebador (un pequeño segmento de ARN), procediendo finalmente a la adición de nucleótidos, que son el par de bases complementarias con la base no apareada.

La enzima llamada ADN polimerasa ayuda en la formación de esta asamblea. Además, el patrón de replicación en procariotas y eucariotas es el mismo, es decir, del tipo semiconservador, donde se conserva la mitad del ADN original y el otro es ADN recién formado. Esta evidencia de la replicación del ADN semiconservador fue proporcionada por Meselson y Stahl (1958).

Ahora el diferencia entre el proceso de los dos se debe a la complejidad de las células donde los eucariotas son más complejos y por lo tanto tienen múltiples orígenes de replicación, mientras que los procariotas tienen un solo origen de replicación. Además, la replicación es unidireccional en eucariotas, que es bidireccional en procariotas.

Enzimas como ADN polimerasa son solo dos en número en procariotas, mientras que en eucariotas es de cuatro a cinco como (α, β, γ, δ, ε). La tasa de replicación es mucho más rápida en procariotas que en eucariotas. El ADN de los procariotas es circular y no tiene extremos para sintetizar. El proceso de replicación corta en procariotas continúa continuamente, mientras que la replicación del ADN de los eucariotas se completa en Fase S del ciclo celular.

El proceso se realiza con alta fidelidad, para que la información genética se transfiera correctamente de una generación a otra. Corrección de pruebas La actividad también es realizada por ADN polimerasa III, que comprueba la unión de los nucleótidos al par de bases correcto. La ADN polimerasa corrige los errores de cualquier desajuste encontrado entre el emparejamiento de bases de las bases complementarias.

Definición de transcripción

los producto intermedio de ADN es ARN, donde los genes se expresan después de la replicación. Por eso se llama sitio de expresión de la información genética. En este proceso, una de las dos hebras formadas después de la replicación funciona como un plantilla (hebra no codificante o hebra de sentido) y otra como antisentido (hebra codificante o hebra antisentido). Casi todo el proceso es el mismo tanto en procariotas como en eucariotas, pero existen algunas diferencias básicas entre ellos.

La molécula completa de ADN no se expresa en la transcripción, sino que una parte seleccionada del ADN solo se sintetiza como ARN. Se desconoce la razón de esto, pero se dice que podría deberse a la señalización interna.

El producto formado en la transcripción se denomina transcripción primaria, como estos son inactivo. Entonces, para hacerlos funcionalmente activos, se someten a cierto tipo de alteraciones como empalmes, modificaciones de base, adiciones de terminales, etc. Estos se conocen como Publicar & # 8211 modificaciones transcripcionales.

Algunos de los similitudes entre los procariotas y eucariotas, el proceso de transcripción es similar en ambos tipos, el ADN actúa como plantilla para el proceso, la composición química (pares de bases) es la misma, la ARN polimerasa juega un papel importante en ambos grupos.

Mientras que la diferencia radica en el proceso, que es simple en procariotas y está muy complejo en eucariotas. En procariotas, solo un tipo de ARN polimerasa produce los tres tipos de ARN (ARNm, ARNt, ARNr), mientras que en eucariotas diferentes tipos de ARN producen diferentes tipos de ARN similar al tipo I produce ARNr, el tipo II es ARNm y tipo III para ARNt y ARNr 5S.

Aparte de esto, existen otras diferencias como en el sitio de inicio, factor Rho, región promotora, punto de terminación, presencia de intrones, modificaciones postranscripcionales, etc.

Aunque en muchos virus, el material genético también está contenido en ARN y tiene la capacidad de realizar otras funciones celulares como el ADN. Pero se encuentra químicamente que El ADN es más estable que el ARN, por lo tanto, el ADN solo se prefiere como macromolécula más adecuada para almacenar la información genética durante una larga vida.


Abstracto

Después del daño del ADN, muchas células parecen entrar en una detención sostenida en el G2 fase del ciclo celular. Se muestra aquí que esta detención podría sostenerse solo cuando p53 estaba presente en la célula y era capaz de activar transcripcionalmente el inhibidor de quinasa dependiente de ciclina p21. Después de la interrupción del gen p53 o p21, las células radiadas γ progresaron a la mitosis y exhibieron un G2 Contenido de ADN solo debido a un fallo de la citocinesis. Por tanto, p53 y p21 parecen ser esenciales para mantener la G2 punto de control en células humanas.

Video. p53 es un gen supresor de tumores recesivo que detiene el ciclo celular cuando se daña el ADN de la célula.


Referencias

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