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Variedades de hemoglobina de monóxido de carbono y alta afinidad por oxígeno

Variedades de hemoglobina de monóxido de carbono y alta afinidad por oxígeno


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Recientemente aprendí sobre el concepto de "afinidad" con respecto a la hemoglobina. Para la hemoglobina en humanos, el dióxido de carbono tiene una afinidad menor que el oxígeno, lo que permite que se produzca el intercambio de gases en nuestros pulmones.

El monóxido de carbono es problemático para nosotros porque tiene una afinidad aún mayor por la hemoglobina que el oxígeno. Esto significa que nuestros glóbulos rojos no intercambiarán monóxido de carbono por oxígeno en nuestros pulmones.

Mi pregunta es: para los organismos adaptados a las grandes altitudes como el ganso con cabeza de barra, cuya hemoglobina tiene una mayor afinidad por el oxígeno que la nuestra, ¿el monóxido de carbono sigue siendo venenoso?


Mi pregunta es: para los organismos adaptados a las grandes altitudes como el ganso con cabeza de barra, cuya hemoglobina tiene una mayor afinidad por el oxígeno que la nuestra, ¿el monóxido de carbono sigue siendo venenoso?

Si. Para publicar algunos otros datos de la Escuela de Medicina Stritch:

El CO tiene 250 veces más afinidad por la hemoglobina que el O2 La Hb se satura al 100% con CO a PCO = 0,6 mm Hg La Hb se satura al 100% con O2 a PO2 = 600 mm Hg

¿Qué significa eso? Bueno, eso significa que cuando la presión parcial de CO es de 1 mmHg, estás realmente muerto. Entonces, si el ganso con cabeza de barra pudiera sobrevivir en un ambiente con más del 1% de CO, su hemoglobina tendría que unirse al oxígeno molecular muy, muy fuertemente por debajo de 1 mmHg. Si esto fuera cierto, esperaría que su curva de unión alcance un alto% de saturación de O2 por debajo de una presión parcial de 1 mmHg. ¿Exhibe eso?

No. A 1 mmHg (recuerde, el CO tiene un 100% de unión a 0,6 mmHg), la saturación de hemoglobina de ganso con cabeza de barra es inferior al 2%. De hecho, son bastante similares a los humanos:

¿Es concluyente esta mirada casual? Bien… No completamente. No pude encontrar ningún dato de monóxido de carbono para el ganso con cabeza de barra, pero para superar la afinidad 250 veces mayor por el CO, la hemoglobina del ganso tendría que ser muy, muy diferente a la de los humanos y al mismo tiempo exhibir una curva de unión similar. No he recibido la educación para determinar si eso es posible o cómo ocurriría, pero es una posibilidad muy remota.

Sin embargo, pecando del lado de "lo más probable", creo que es seguro decir que dada una habitación llena de CO al 1%, eventualmente terminaría matando cualquier cosa que dependiera de la hemoglobina para transportar el oxígeno necesario a los tejidos.


Relaciones estructura-función de las hemoglobinas humanas

En 1949 Pauling y sus colaboradores demostraron que la hemoglobina de células falciformes (HbS) pertenecía a una especie molecular anormal. En 1958, Ingram, que utilizó un sistema bidimensional de electroforesis y cromatografía para descomponer la molécula de hemoglobina en una mezcla de péptidos más pequeños, definió el defecto molecular en la HbS mostrando que se diferenciaba de la hemoglobina adulta normal por un solo péptido. Desde entonces, se han descrito más de 200 hemoglobinas variantes y anormales. Además, la construcción de un modelo atómico de la molécula de hemoglobina basado en un análisis de rayos X de alta resolución por el Dr. Max Perutz en Cambridge ha permitido el estudio de la parte estereoquímica de los residuos de aminoácidos, que fueron reemplazados, eliminados, o añadido en cada una de las variantes de hemoglobina. Algunas de las variantes se han asociado con condiciones clínicas. La demostración de una base molecular para una enfermedad fue un punto de inflexión significativo en la medicina. Una nueva hemoglobina de ingeniería derivada de la sangre de cocodrilo, con una afinidad por el oxígeno notablemente reducida y un mayor suministro de oxígeno a los tejidos, señala el camino para futuros avances en la medicina.

La hemoglobina ha jugado un papel espectacular en la historia de la biología, la química y la medicina. Este documento, escrito principalmente para el médico, es un breve resumen de los complejos problemas asociados con las hemoglobinas anormales. Las talasemias se omitieron intencionalmente y se presentarán en una publicación separada.

La hemoglobina es un portador respiratorio bidireccional, que transporta oxígeno desde los pulmones a los tejidos y facilita el transporte de retorno de dióxido de carbono. En la circulación arterial, la hemoglobina tiene una alta afinidad por el oxígeno y una baja afinidad por el dióxido de carbono, los fosfatos orgánicos y los iones de hidrógeno y cloruro. En la circulación venosa, estas afinidades relativas se invierten. Para subrayar estas notables propiedades, Jacques Monod otorgó a la hemoglobina el título de & # x0201enzima coonoraria & # x0201d. Si llamamos al hemo su sitio activo, al oxígeno su sustrato y a los iones de hidrógeno sus inhibidores, entonces la hemoglobina imita las propiedades de una enzima. Por lo tanto, se hizo evidente que era necesario desentrañar las propiedades de la hemoglobina para comprender el mecanismo de la función de la hemoglobina en lo que respecta a la fisiología respiratoria.

En 1937, el Dr. G. S. Adair le dio al Dr. Max Perutz cristales de hemoglobina de caballo (comunicación personal, Max Perutz, 1966). Esto puso al Dr. Perutz en el camino que condujo al esclarecimiento de la estructura de la hemoglobina (1). Por este esfuerzo fue galardonado con el Premio Nobel de Química en 1962.

En 1957, Ingram demostró que la anemia de células falciformes era causada por el reemplazo de uno de los 287 residuos de aminoácidos en la mitad de la molécula de hemoglobina (2). Este hallazgo facilitó la comprensión de la enfermedad a nivel molecular, ya que por primera vez se demostró que una mutación puntual en un gen estructural provoca la sustitución de un aminoácido en la proteína controlada por ese gen. Además, la acumulación del gen de las células falciformes en las regiones palúdicas del mundo se convirtió en una ilustración convincente de la evolución por selección natural (3). Las personas con el rasgo de células falciformes (HbA / S) tienen una ventaja selectiva sobre las personas normales cuando contraen paludismo por P. falciparum porque el recuento de parásitos permanece bajo y se evita el paludismo cerebral letal.

Hasta la fecha, se han descrito más de 200 variantes de hemoglobina. Se prefiere el término & # x0201cvariante & # x0201d en lugar de & # x0201cabnormal & # x0201d porque la mayoría de las hemoglobinas no están asociadas con enfermedades. El difunto profesor Herman Lehmann de la Universidad de Cambridge en Inglaterra y sus & # x0201cmusketeers & # x0201d en diferentes partes del mundo han sido los responsables de descubrir muchas de estas variantes. Además, a medida que se acumulaba el conocimiento, se hizo evidente que las relaciones estructura-función de varias hemoglobinas en términos estereoquímicos podrían estar relacionadas con la sintomatología clínica (4, 5).


PRINCIPIOS BÁSICOS

Síntesis, estructura y función de la hemoglobina

La hemoglobina es un heterotetrámero compuesto de subunidades de globina de tipo α y β, cada una unida a un grupo protésico hem. Las principales funciones de la Hb son transportar oxígeno (O2) desde los pulmones hasta los tejidos periféricos y el dióxido de carbono (CO2) de los tejidos a los pulmones. La cinética de Hb-O2 la unión y la liberación se ajustan con precisión para este propósito y se adaptan de acuerdo con la ontogenia del desarrollo y las perturbaciones metabólicas. Además, la molécula de Hb debe limitar los problemas potenciales causados ​​por su hierro asociado y O libre.2, moléculas reactivas capaces de infligir daño mediante la producción de especies reactivas de oxígeno. Los esfuerzos para comprender cómo la estructura de la Hb imparte estas funciones críticas se han realizado durante más de 50 años. La hemoglobina fue una de las primeras proteínas en ser secuenciadas (Konigsberg et al. 1961 Schroeder et al. 1961 Watson y Kendrew 1961) y los genes de globina estuvieron entre los primeros en ser clonados (Rabbitts 1976). A finales de la década de 1950, Perutz y sus colegas determinaron la estructura tridimensional de la Hb mediante cristalografía de rayos X (Perutz 1960 Perutz et al. 1960). Estudios más recientes refinaron esta estructura a alta resolución (Paoli et al. 1996 Park et al. 2006). Además, O2 y se han medido en detalle otras propiedades de unión a ligandos para la Hb nativa y muchos mutantes de origen natural. Todo este trabajo proporciona un marco sustancial para definir el O2 propiedades de administración de Hb, así como las consecuencias moleculares de mutaciones variantes (véase, por ejemplo, Lehmann 1957 Konigsberg y Lehmann 1965 Shimizu et al. 1965 Perutz y Lehmann 1968 Perutz 1970 Bunn y Forget 1986).

Los polipéptidos de globina se sintetizan a partir de grupos de genes de globina de tipo α y β separados ubicados en los cromosomas humanos 16 y 11, respectivamente. Las cadenas de globina nacientes incorporan rápidamente hemo, que estabiliza su plegamiento nativo en subunidades de Hb compuestas por siete u ocho hélices α denominadas A – H, que se pliegan juntas en una estructura globular (fig. 1A). Las subunidades de Hb se unen a O2 y otros ligandos a través del hierro hemo enterrados dentro de un bolsillo hidrófobo conservado evolutivamente que mira hacia el exterior de los tetrámeros de HbA (Fig. 1B). El hierro hemo está coordinado axialmente con las proteínas de la globina mediante un residuo de histidina invariante en la hélice F8, denominado histidina "proximal" (Fig. 1C). La posición axial opuesta une O2, que se estabiliza mediante la interacción con la histidina "distal" conservada en la hélice E7 (Fig. 1C). Múltiples aminoácidos adicionales dentro de las proteínas de la globina estabilizan la unión del hemo a través de interacciones no covalentes (Fig. 1C). El hierro debe estar en su estado reducido (ferroso, Fe 2+) para que la Hb se una al O2. La Hb oxidada o "met" (férrica, Fe 3+) no puede unirse a O2 y es relativamente inestable, con tendencia a perder hemina y desnaturalizarse. Por lo tanto, los glóbulos rojos han desarrollado elaborados mecanismos para mantener la Hb en su estado reducido (Bunn y Forget 1986 Ganz y Nemeth 2012 Schechter 2012). Por ejemplo, el sistema de metahemoglobina reductasa convierte la metahemoglobina (metHb) en su forma reducida. No es sorprendente que las mutaciones de globina que alteran los aminoácidos dentro del bolsillo del ligando produzcan con frecuencia fuertes efectos funcionales, incluida la desestabilización y la afinidad alterada por O2y mayores tasas de formación de metHb y pérdida de hemo (consulte la sección sobre variantes seleccionadas que ilustran aspectos importantes de la biología de la hemoglobina). Las variantes que promueven la autooxidación se denominan “M-Hbs” (consulte las secciones sobre Variantes seleccionadas que ilustran aspectos importantes de la biología de la hemoglobina y las variantes de metahemoglobina (“Tipo M”)). Debido a que la Hb adquiere su color distintivo del grupo hemo, las alteraciones que afectan el entorno del hierro hemo, incluidos los cambios en los aminoácidos circundantes, los diferentes ligandos de gas o el estado redox, producen cambios característicos en la absorción de luz visible. Estos cambios de color se utilizan clínicamente para evaluar la Hb-O2 saturación, formación de metHb y efectos de las variantes de Hb.

La estructura de Hb. (A) Las subunidades de Hb α (rosa) y β (rojo) tienen pliegues α-helicoidales conservados. Las hélices se etiquetan A – H desde el extremo amino. La subunidad α carece de hélice D. (B) El alto O2 afinidad R estado estructura cuaternaria de Hb con O2 (esferas rojas) unidas en los cuatro sitios hem (protoporfirina-IX como palos amarillos, con el átomo de hierro central como esfera naranja). (C) Diagrama estereo (pared-ojo) del bolsillo hem de β que muestra las histidinas proximal (F8) y distal (E7) y residuos seleccionados en el bolsillo hem distal que influyen en la unión y autooxidación del ligando. (D) El tetrámero de Hb se ensambla a partir de dos dímeros αβ idénticos (mostrados en rojo y gris para mayor claridad). En el tetrámero, cada subunidad hace contacto con la cadena diferente a través de una interfaz α1β1 de dimerización de alta afinidad y una interfaz dímero-tetrámero α1β2 de menor afinidad (cian).

Dentro del tetrámero de Hb, cada subunidad de globina une la cadena diferente a través de dos interfaces distintas, denominadas α1β1 y α1β2 (Fig. 1D). Las subunidades de globina individuales forman dímeros a través de la interacción α1β1 de afinidad extremadamente alta. Los monómeros de la cadena de globina son relativamente inestables en comparación con los dímeros, con tendencia a formar precipitados intracelulares que dañan los eritrocitos y provocan anemia hemolítica. Por tanto, las mutaciones que alteran la interacción α1β1 pueden provocar eritrotoxicidad al favorecer la acumulación de subunidades monoméricas (Fig. 2C). La interacción α1β2, que es de menor afinidad, media la tetramerización. La unión de oxígeno desestabiliza la interacción α1β2, lo que resulta en una transición de la estructura cuaternaria del estado "T" (tenso, de baja afinidad, desoxigenado) al "R" (relajado, de alta afinidad, oxigenado), lo que facilita el O2 unión a subunidades adicionales (Fig. 2A). Este proceso provoca cooperativo O2 unión, que se ilustra por la forma sigmoidea característica de la Hb-O2 curva de equilibrio (Fig. 2B). La cooperatividad permite un O máximo2 liberación sobre gotas relativamente pequeñas de O2 tensión. Las mutaciones dentro de la región de interacción α1β2 pueden alterar las propiedades funcionales de la Hb, principalmente al alterar el O2-características de unión (Fig. 2C, esferas cian Tabla 1).

Variantes de Hb con interacciones de subunidades alteradas. (A) Conversión desde el bajo O2 afinidad (desoxi, estado T) a alto O2 La afinidad (oxi, estado R) implica una rotación relativa de los dímeros α1β1 y α2β2, con cambios en los contactos a través de la interfaz α1β2 (y α2β1) (cian). En esta caricatura, el dímero α1β1 se mantiene estacionario para revelar el movimiento relativo del dímero α2β2 al pasar de los estados desoxi (naranja) a oxi (rojo). (B) La forma sigmoidea de la Hb-O2 La curva de saturación muestra la regulación alostérica por cambios de pH, temperatura y 2,3DPG. Estos reguladores, así como las variantes de Hb, influyen en la forma de la curva. Las variantes de alta afinidad por el oxígeno, el pH alto, el 2,3DPG bajo o la temperatura baja inducen un "desplazamiento a la izquierda" en la curva de saturación (línea roja). Por el contrario, las variantes de baja afinidad por el oxígeno, el pH bajo, el 2,3DPG alto o la temperatura alta inducen un "desplazamiento a la derecha" (línea azul). (C) Las variantes de la secuencia de Hb en la interfaz α1β2 alostérica (esferas cian) muestran una respuesta alterada a O2 vinculante. Algunas variantes de secuencia interrumpen la unión a otros reguladores alostéricos, por ejemplo, las sustituciones en βK82 (verde) interrumpen las interacciones con 2,3DPG que normalmente estabilizan el bajo O2 estado T de afinidad. Las mutaciones que interrumpen la dimerización de α1β1 (y α2β2) (esferas azules) aumentan la concentración de monómeros libres, que son inestables. (D) Algunas mutaciones α que alteran la unión a β también pueden alterar la unión a la chaperona, AHSP. Otras variantes α, como Turriff y Beziers (esfera rosa) pueden inhibir solo la unión de AHSP.

La cooperatividad representa un fenómeno general denominado regulación alostérica, en el que las moléculas efectoras controlan las propiedades de las enzimas u otras proteínas al unirse a regiones distintas de los sitios activos. Varios reguladores alostéricos, además de O2, influyen en las propiedades de la Hb. Por ejemplo, H + se une a la Hb para promover O2 liberación en un proceso denominado efecto Bohr (Perutz et al. 1984). En tejidos periféricos, abundante CO2 es captado por los glóbulos rojos y metabolizado por la anhidrasa carbónica a ácido carbónico, lo que resulta en la producción de H + y el consiguiente O2 liberación. Por el contrario, CO relativamente bajo2 y un pH alto en el pulmón favorece el O2 unión a Hb. Además, CO2 forma aductos de carbamino con los extremos amino de las globinas α y β in vivo. Estas interacciones producen efectos menores en sangre total O2 afinidad en comparación con el impacto del CO2 sobre el pH (Bunn y Forget 1986). El compuesto 2,3-difosfoglicerato (2,3DPG), formado como un subproducto de la glucólisis y presente en concentraciones relativamente altas en los glóbulos rojos, es otro importante regulador alostérico de la Hb. 2,3DPG se une y estabiliza la Hb en estado T para facilitar O2 liberación. Se han identificado sitios de unión de hemoglobina para H + y 2,3DPG (Perutz et al. 1969, 1984 Perutz 1970 Arnone 1972). Juntas, estas interacciones permiten que la Hb detecte la actividad metabólica y module el O2 vinculante en consecuencia. Esta función sensorial ambiental puede verse alterada por mutaciones que afectan la afinidad de la Hb por sus reguladores alostéricos (Fig. 2C, esfera verde Tabla 1).

Identificación de variantes de Hb y sus implicaciones clínicas

Muchas variantes de Hb se determinan fácilmente mediante examen físico y / o pruebas de laboratorio de rutina, lo que explica por qué se han descubierto tantas. Con poca frecuencia, algunas variantes se identifican mediante la evaluación de pacientes enfermos con anemia grave o cianosis clínicamente significativa. Muchas sustituciones de aminoácidos alteran la carga superficial y, por lo tanto, se detectan mediante electroforesis o cromatografía, técnicas que se realizan de forma rutinaria en neonatos en América del Norte y Europa. Curiosamente, algunas variantes de Hb migran de manera similar a la HbA1c, una forma glicosilada de Hb que refleja el control a largo plazo de los niveles de glucosa en sangre en pacientes diabéticos (Tabla 1) (revisado en Little y Roberts 2009). De esta manera, las sustituciones específicas de los aminoácidos de la Hb pueden elevar artificialmente la HbA.1c medición e interferir con el manejo de la diabetes. Otras variantes de Hb son clínicamente benignas pero producen cambios evidentes en el color de la piel. Por ejemplo, mutaciones que aumentan la Hb-O2 La afinidad típicamente estimula el impulso eritropoyético inhibiendo O2 liberación de tejido, causando eritrocitosis asociada con una tez rubicunda (Nathan et al. 2009). Mutaciones que reducen el O2 La afinidad produce un tono azulado en la piel (cianosis) causado por niveles anormalmente altos de desoxiHb. Las mutaciones que favorecen la oxidación del hierro Hb a la forma met (M-Hbs) también provocan una piel teñida de azul, mientras que la sangre en sí parece marrón. Los estudios de una familia con cianosis congénita llevaron a Horlein y Weber a describir la primera hemoglobinopatía conocida, causada por la variante Hb-M Saskatoon (Horlein y Weber 1948). La variante Iwate de M-Hb, que causa "sangre negra" o "nigremia hereditaria", se describió por primera vez hace más de 200 años en Japón (Shibata et al. 1960).

Es importante señalar que muchas variantes de Hb que afectan el color de la piel no son clínicamente dañinas más allá de sus efectos cosméticos. Sin embargo, estas afecciones pueden imitar problemas más potencialmente mortales, como trastornos cardiopulmonares y mieloproliferativos, que deben excluirse. Por tanto, los pacientes con variantes de Hb cianóticas o policitemicas pueden sufrir por error procedimientos médicos innecesarios y potencialmente peligrosos. Los ejemplos históricos incluyen pacientes cianóticos sometidos a cirugía o cateterismo por presuntos defectos cardíacos y pacientes policitemicos que reciben 32 P radioactivo por presunta policitemia vera (Steinberg et al. 2001 Nathan et al. 2009). Como se dijo, “la razón principal para establecer el diagnóstico [de M Hbs] es prevenir desventuras iatrogénicas que pudieran surgir bajo la impresión errónea de que el paciente tiene un trastorno cardíaco o pulmonar” (Bunn y Forget 1986). La mayoría de las variantes de Hb con O alterado2 la afinidad son relativamente fáciles de diagnosticar mediante la historia, el examen físico y las pruebas de laboratorio (Wajcman et al. 2001 Wajcman y Moradkhani 2011).

La síntesis de genes de globina está regulada por el desarrollo

La regulación del desarrollo de las familias de genes de globina similar a α y β es de gran importancia médica (Sankaran y Orkin 2012). La hemoglobina F (α2γ2) es la forma más expresada durante la gestación fetal tardía. Después del nacimiento, la expresión cambia gradualmente a HbA (α2β2) durante varios meses. Por tanto, las mutaciones sintomáticas que afectan a las globinas α o γ están presentes antes del nacimiento o al nacer, mientras que las manifestaciones de las mutaciones de la β-globina suelen retrasarse hasta algunos meses después del nacimiento. Curiosamente, las mutaciones del gen de la γ-globina que son evidentes al nacer, generalmente reflejadas por cianosis o anemia hemolítica (p. Ej., Hb-F Toms River, secciones sobre variantes seleccionadas que ilustran aspectos importantes de la biología de la hemoglobina y variantes que afectan las funciones múltiples de la hemoglobina, y Tabla 1), se desvanecen en unas pocas semanas a medida que la producción de Hb cambia de F (α2γ2) a A (α2β2).

Pruebas de laboratorio para variantes de Hb

En muchos países, se realizan pruebas de rutina de todos los recién nacidos para identificar hemoglobinopatías comunes, como algunas talasemias y HbS. El enfoque isoeléctrico o la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), las pruebas más utilizadas, identifican la mayoría de las Hbs estructuralmente anormales (Wajcman et al. 2001). De esta forma, se descubren incidentalmente muchas variantes benignas de Hb. Las indicaciones clínicas para las pruebas de laboratorio para investigar posibles variantes de Hb se enumeran en la Tabla 2.

Indicaciones clínicas de las pruebas de laboratorio para diagnosticar variantes de Hb

Las pruebas de laboratorio específicas para investigar las variantes de Hb incluyen:

Métodos físicos de separación de Hb. Estos incluyen técnicas electroforéticas y cromatográficas que examinan las propiedades físicas de los dímeros α1β1 o las subunidades de globina individuales. Estándares específicos, como HbA, HbS, HbC, HbF y HbA2, normalmente se examinan como controles. Las variantes de Hb pueden mostrar una migración alterada en estos ensayos. Históricamente, la electroforesis en agar con acetato de celulosa y citrato se usaba más comúnmente para detectar Hbs variantes. Las pruebas clínicas actuales utilizan más típicamente el enfoque isoeléctrico y HPLC, que son más sensibles.

Hb-O2 curva de unión. Esta prueba, realizada en glóbulos rojos enteros o hemolizado, indica el porcentaje (%) de Hb oxigenada en un O dado2 presión parcial (Fig. 2B). Variantes de hemoglobina con O anormalmente alto2 afinidad (consulte las secciones sobre variantes seleccionadas que ilustran aspectos importantes de la biología de la hemoglobina y las variantes de alta afinidad de oxígeno) se saturará en O más bajo2 presiones que producen una O "desplazada a la izquierda"2 curva de equilibrio, mientras que las mutaciones que reducen O2 La afinidad (consulte las secciones sobre variantes seleccionadas que ilustran aspectos importantes de la biología de la hemoglobina y las variantes de baja afinidad por oxígeno) provocará el "desplazamiento a la derecha" opuesto. Determinación de Hb-O2 Las respuestas de afinidad a los reguladores alostéricos, particularmente 2,3DPG o H + (cambios de pH), pueden proporcionar información sobre las causas estructurales de los fenotipos observados. Desafortunadamente, pocos laboratorios clínicos ofrecen actualmente este ensayo.

Espectroscopia de longitud de onda visible. Las variantes de hemoglobina con sustituciones de aminoácidos en el bolsillo del hemo afectan la absorbancia de la luz visible. Por ejemplo, los Hbs de tipo M muestran espectros característicos que pueden distinguirlos de la metahemoglobinemia causada por una deficiencia enzimática en el sistema metHb reductasa (Bunn y Forget 1986 Dailey y Meissner 2012 Ganz y Nemeth 2012 Schechter 2012). La pulsioximetría es una prueba espectrofotométrica no invasiva que mide las relaciones de absorbancia a longitudes de onda específicas para sangre oxigenada (660 nm) y desoxigenada (940 nm) (Tremper y Barker 1989). Esto puede producir resultados confusos y, a veces, engañosos en pacientes con variantes de Hbs que muestran propiedades únicas de absorbancia de luz (Verhovsek et al. 2010). En estos casos, el análisis de sangre arterial O2 Es posible que se requiera concentración para descartar hipoxia. El análisis de estas variantes de Hbs utilizando la absorbancia de luz en todo el espectro de longitud de onda visible puede proporcionar información de diagnóstico útil.

Prueba de estabilidad de la hemoglobina. Por lo general, la estabilidad de la Hb se ve afectada en variantes que se asocian con anemia hemolítica. Las pruebas de estabilidad de la hemoglobina miden la propensión de la Hb a desnaturalizarse al exponerse a diversas tensiones, incluido el calor (Carrell y Kay 1972), isopropanol (Bender et al. 1981), agitación mecánica (Asakura et al. 1975) y acetato de zinc (Roth et al. 1976). La prueba corporal de Heinz utiliza tinciones supravitales, como azul de metileno o violeta cristal, para detectar globinas agregadas dentro de los eritrocitos (Eisinger et al. 1985).

Pruebas especializadas. El análisis de espectrometría de masas del hemolizado del paciente y la secuenciación del ADN de los genes de la globina son pruebas de confirmación especializadas para identificar alteraciones de aminoácidos y nucleótidos asociadas con variantes sospechosas de Hb (Wajcman et al. 2001 Wajcman y Moradkhani 2011). La secuenciación del ADN puede dilucidar fácilmente la presencia de una variante de Hb. Sin embargo, se requieren estudios bioquímicos y estructurales adicionales, incluidos los discutidos en esta sección, para determinar cómo la variante afecta la función de la Hb. El análisis cristalográfico es el enfoque de mayor resolución para determinar los efectos de las sustituciones de aminoácidos de globina sobre la estructura molecular. La cristalografía se ha utilizado históricamente como una herramienta de investigación para evaluar los efectos de algunas variantes interesantes de Hb (ver, por ejemplo, Pulsinelli et al. 1973 Perutz et al. 1984).


Cinética de la reacción del monóxido de carbono con el complejo hemoglobina-haptoglobina ☆

El complejo hemoglobina-haptoglobina (HbHp) tiene una alta afinidad por el oxígeno, no tiene "interacción hemo-hemo" ni efecto Bohr.

Los resultados presentados aquí demuestran que una tasa de combinación notablemente aumentada parece ser la base cinética de la alta afinidad del ligando del complejo hemoglobina-haptoglobina y que, como se ha observado anteriormente en las hemoglobinas que exhiben una alta afinidad por el oxígeno, existe una correlación entre la alta combinación velocidad y un cambio en los espectros de la banda de Soret de la forma desoxi (430 mμ).

La constante de velocidad (l′) Determinada con la técnica de flujo detenido para la reacción HbHp 1-1 + CO ai HbHp CO es 1,9 × 10 6 M −1 seg −1 a pH 7,4 y 25 ° C, con una energía de activación de 6,7 kcal./mol. Cuando se estudió la reacción para el complejo HbHp 2.2, se observó una mayor velocidad: 5,2 × 10 6 a pH 7,4 y 23 ° C, con una energía de activación de 4,3 kcal./mol. Utilizando la técnica de fotólisis ultrarrápida se obtuvieron resultados comparables, pero el comportamiento bifásico de la velocidad de reacción que es característico de la hemoglobina A estuvo ausente. Cambios conformacionales ligados al ligando del tipo postulado para la hemoglobina. A parece estar ausente en el complejo hemoglobina-haptoglobina.

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones AM 04502 y GM 14276-02 de los Institutos Nacionales de Salud y por la subvención G-6549 del Fondo de Investigación Médica de Seguros de Vida.


El modo de unión del oxígeno a la hemoglobina.

Oxígeno, el $ ce$ molécula, es un donante absolutamente bajo & # x3c3, especialmente en comparación con $ cePS Su esquema de orbitales moleculares es generalmente el del monóxido de carbono, excepto que es completamente simétrico y se incluyen dos electrones más: ellos pueblan los orbitales 2 & # x3c0 para dar un estado fundamental triplete. Estos orbitales son ahora los HOMO y apenas se extienden al espacio de una manera significativa; además, el par solitario todavía existente en cada átomo de oxígeno tiene ahora una energía mucho más baja y tampoco se extiende al espacio y, por lo tanto, no puede unirse a un centro metálico en una manera & # x3c3.

Lo que sucede aquí es bastante complejo, y la última conferencia que escuché sobre el tema básicamente decía que aún no se ha proporcionado evidencia concluyente final. Orthocresol analiza los diferentes puntos de vista en detalle en esta pregunta. Sin embargo, las propiedades diamagnéticas del complejo resultante son incuestionables y, por lo tanto, se debe asumir un estado fundamental singlete o uno en el que el acoplamiento antiferromagnético cancela cualquier espín a nivel molecular. Dado que el estado fundamental de la hemoglobina tiene un centro de hierro (II) de alto espín y el estado fundamental del oxígeno es un triplete paramagnético, tiene sentido asumir que esos dos son los competidores iniciales.

El profesor Klüfers ahora establece que los pasos son los siguientes:

  1. El hierro (II) está en un estado de alto espín con cuatro electrones desapareados

  2. Se aproxima el triplete paramagnético del oxígeno y uno de sus $ unicode [Times]^ * $ coordenadas orbitales al centro del hierro (II) en forma & # x3c3.

  3. Esto induce una transición de alto giro y bajo giro en el hierro y reorganiza ligeramente la esfera del ligando (acercando el oxígeno al centro del hierro). Ahora tenemos un centro de hierro singlete de bajo espín (II) y un medio enlace coordinativo & # x3c3 del oxígeno. Podemos atribuir ese electrón al centro de hierro.

  4. A través de la combinación lineal, podemos ajustar el orbital portador de espín & # x3c3 y los orbitales de hierro poblados para que se genere un orbital que pueda interactuar con el otro $ unicode [Times]^ * $ de oxígeno en una forma & # x3c0.

  5. Por lo tanto, esperamos un acoplamiento antiferromagnético y un estado general que se puede describir mejor como $ ce<>- ^ 2O2 ^ <.- >> $ - una oxidación formal de un electrón de hierro a hierro (III), que reduce el oxígeno a superóxido ($ ce$ ).

  6. Si los orbitales portadores de espines son todos tratado como centrado en el metal, obtenemos un $ ce<>- ^ 1O2> $ estado.

(El contenido del enlace que cité está traducido al alemán como mío y abreviado del original).

Solo debido a la esfera de ligando complejamente ajustada y también debido a la transición estabilizadora de alto giro y bajo giro (más la reorganización), el oxígeno es capaz de unirse al hierro. en absoluto. La histidina distal estabiliza aún más el complejo mediante un enlace de hidrógeno, aliviando ligeramente la carga. Es de suponer que la naturaleza hizo muchos ajustes a lo largo de la evolución, ya que todo el proceso es bastante complejo y está bien ajustado para recolectar oxígeno donde es abundante (en los pulmones) y liberarlo en los tejidos donde es escaso.


LAS α-TALASEMIAS

A diferencia de las β-talasemias, que generalmente son causadas por mutaciones puntuales del gen de la β-globina, los síndromes de α-talasemia generalmente son causados ​​por la deleción de uno o más genes de α-globina y se subclasifican según el número de α-globina -genes de la globina que están suprimidos (o mutados): un gen suprimido (α + -talasemia) dos genes suprimidos en el mismo cromosoma o en cis (α 0 -talasemia) tres genes eliminados (enfermedad de HbH) o cuatro genes eliminados (hidropesía fetal con Hb de Bart). También se han caracterizado formas de α-talasemia no deleción, pero son relativamente infrecuentes. Estos trastornos se analizan en detalle en Higgs (2013).

Clínicamente, la deleción de sólo uno de los cuatro genes de la α-globina no se asocia con anomalías hematológicas importantes y, en ocasiones, se denomina estado de “portador silencioso” de la α-talasemia. La deleción de dos genes de α-globina puede ocurrir de dos formas: (1) en los mismos cromosomas, o en cis o (2) en cromosomas opuestos, o en trans, que es el estado homocigoto para la deleción de un solo gen, o α + -talasemia homocigótica. los cis El genotipo es particularmente común en las poblaciones asiáticas, mientras que el trans El genotipo es altamente prevalente en personas de ascendencia negra / africana. El fenotipo clínico es similar con ambos genotipos y consiste en anemia microcítica hipocrómica leve, sin hemólisis, algo análoga a la del rasgo de β-talassemia, pero algo menos grave. La deleción (o expresión notablemente disminuida) de tres genes de α-globina se asocia con el síndrome de la enfermedad de HbH, una anemia hemolítica compensada que generalmente no requiere tratamiento con transfusión de glóbulos rojos. La base de la hemólisis es la acumulación excesiva de subunidades de β-globina que se autoasocian para formar tetrámeros de cadena β o HbH. En contraste con la situación en las β-talssemias en las que las subunidades de α-globina en exceso forman rápidamente agregados insolubles, las cadenas de β-globina en exceso pueden formar tetrámeros solubles (HbH). Sin embargo, la HbH es relativamente inestable y se precipita a medida que los glóbulos rojos envejecen, formando cuerpos de inclusión que dañan los glóbulos rojos y acortan su vida útil (ver Higgs 2013). La deleción de los cuatro genes de la α-globina suele ser fatal durante la última etapa del embarazo o poco después del nacimiento. Esta condición se llama hidropesía fetal con Hb Bart. La Hb de Bart es un tetrámero de cuatro subunidades de γ-globina y es ineficaz como transportador de oxígeno: tiene una afinidad por el oxígeno muy alta, similar a la de la mioglobina, y no libera oxígeno a los tejidos en condiciones fisiológicas. Por lo tanto, el bebé, cuyos glóbulos rojos carecen de HbF o HbA y contienen principalmente Hb de Bart, sufre una hipoxia severa que resulta en hidropesía fetal. Rare cases have been rescued by intrauterine transfusions, but these children subsequently require lifelong transfusion support similar to that required by children with β-thalassemia major.

One form of nondeletion α-thalassemia, called Hb Constant Spring (HbCS), is particularly prevalent in southeast Asia. It is caused by a chain termination mutation, which results in the synthesis of an elongated α-globin subunit that accumulates at very low levels in RBCs of affected individuals. When coinherited with the α 0 -cis deletion on the other chromosome, there results a form of HbH disease that is more severe than the typical HbH disease associated with full deletion of three α-globin genes (see Higgs 2013).

In addition to these forms of α-thalassemia inherited in a pattern consistent with Mendelian genetics, there are two α-thalassemia syndromes that are caused by de novo or acquired mutations affecting expression of the α-globin genes: (1) the α-thalassemia with mental retardation syndrome (ATR) and (2) acquired α-thalassemia (HbH disease) associated with myelodysplastic syndromes (ATMDS). These syndromes are described in detail in Gibbons (2012).


Discusión

Comparing P50 values and the distribution of HbO2/PO2 in relation to the standard O2-Hb dissociation curve in 100 COVID-19 patients and 100 non-COVID-19 patients, we found no argument to support the hypothesis that SARS-CoV-2 can be responsible for a clinically significant alteration of O2 binding to Hb, neither at baseline nor later in the disease course. In contrast, we were able to identify a shift in the relation between PO2 and HbO2, and variations in P50 value, in 55 patients with HbCO 𢙘% (increased Hb affinity) and 30 patients with sickle cell disease (decreased Hb affinity, even more when they were not treated by hydroxycarbamide). Moreover, no COVID-19 patients displayed hemolysis stigma.

Due to the huge number of BGA samples collected in our institution during the study period (3,706 in March-April 2019 and 5,346 between 2020/03/16 and 2020/04/12, regardless of the diagnosis), a random draw of patients had to be performed. Despite our 1:4 stratification on the number of collected samples, the COVID-19 group finally comprised 23 patients with only 1 BGA, whereas they were 27 in the non-COVID-19 group. This was due to two facts: for some patients with multiple BGAs, only one sample finally met our selection criteria conversely, for some patients that had only one BGA during the predefined period, we could analyze other samples collected before or after. Eventually, we were able to compare 253 BGAs from 100 COVID-19 patients with positive SARS-CoV-2 PCR, to 221 samples from 100 non-COVID-19 controls, providing extensive information about blood gases and Hb affinity for O2 in COVID-19.

Median P50 corrected for body temperature, pH and PCO2 at baseline was 26 mmHg [25.2�.8] in the COVID-19 group vs. 25.9 mmHg [24�.3] in the non-COVID-19 group. These values are slightly lower than the normal theoretical value of 26.8 mmHg, which is, however, calculated for normal HbCO and MetHb levels (West and Luks, 2016). In our study, non-COVID-19 patients displayed a slightly, but significantly, higher median HbCO level, which was consistent with the greater proportion of smokers in this group. On the contrary, COVID-19 patients displayed a slightly, but significantly, higher median MetHb level, probably secondary to the use of hydroxychloroquine in some of them, a drug which can potentially raise MetHb level (Hall et al., 1986). Both HbCO and MetHb are well known to increase Hb affinity for O2 and decrease P50 (Douglas et al., 1912 Darling and Roughton, 1942 Roughton and Darling, 1944). Moreover, [2,3-DPG] can be modified in diverse conditions: chronic hypoxia, alkalosis, heart failure and anemia can increase [2,3-DPG] while acidosis, blood transfusion, polycythemia, hypophosphatemia and greater age can decrease it (de Verdier and Garby, 1972 Purcell and Brozović, 1974). Because [2,3-DPG] was not routinely measured in our institution, and although the main confounding factors were assessed in the present work (pH, history of heart failure, phosphatemia, age), it is possible that some of our patients displayed a decreased [2,3-DPG]. This could be another possible explanation for P50 values lower than 26.8 mmHg in our cohort. Anyway, the clinical significance of the effects of 2,3-DPG variation on oxygen affinity is thought to be minimal (Macdonald, 1977). Another limit of our study is that P50 was calculated in a blood gas analyzer, i.e., not measured. The technique to directly measure P50 is longer and not routinely performed: it consists in the exposure of a blood sample to an increasing partial pressure of oxygen and subsequent deoxygenation with nitrogen gas in a Hemox-Analyzer. However, as stated in the manufacturer reference manual, ABL FLEX analyzers can estimate a reliable value of P50 from a blood sample with saturation 㲗%. We proceeded as would do the blood gas analyzer, but we calculated standardized P50 using the equations validated by Dash (Dash et al., 2016). Indeed, our model was able to identify pathological P50 values in our “positive control” groups, even in the presence of abnormal Hb: most P50 values were lower than normal in the HbCO group, with a median P50 of 22.5 mmHg [21.6�.8] on the contrary most P50 values were higher than normal in the SCD group, with a median P50 of 30 mmHg [26.9�.9] in untreated patients and 28.2 mmHg [27�.2] in the ones receiving hydroxycarbamide. Moreover, P50 calculation by blood gas analyzers is, under certain conditions, routinely used by some referral centers in the diagnostic approach of hemoglobins with high O2 affinity (Orvain et al., 2017). Anyway, in the present study, the sample distribution of high HbCO and SCD groups was shifted from the standard O2-Hb dissociation curve, indicating a modified Hb affinity, whatever the potential lack of precision of P50 calculation in our model compared to the gold-standard. On the contrary, no clinically significant change of Hb affinity could be observed in COVID-19 patients, whose samples were clearly distributed on the standard dissociation curve, as for the non-COVID-19 control group.

Our findings are in line with the results of a British study conducted in only 14 critically ill COVID-19 patients, and 11 age- and sex-matched controls (Daniel et al., 2020). Mean P50, measured by Hemox-Analyzer, was not statistically different between both groups: 29 ± 2.3 vs. 28.5 ± 1.8 mmHg, respectively. The reasons why P50 values were higher than the normal theoretical value were not discussed. In another British study, mean P50 of 43 intubated and ventilated COVID-19 patients, retrospectively calculated from blood gas analyzer results, was 23.4 ± 3.13 mmHg, even significantly lower than a historical cohort of unmatched critically ill controls (24.6 ± 5.42 mmHg) (Vogel et al., 2020). The authors hypothesized that those low values could be explained by reduced [2,3-DPG], and that for some reason it was even more reduced in COVID-19 patients. Another possible cause was the use of samples with saturation �% to calculate P50. At a cellular level, data are conflicting about the potential predisposition of impaired O2 transport during COVID-19 (Park et al., 2020 Thomas et al., 2020) but, to date, there is no biological evidence to support the hypothesis of Wenzhong and Hualan that SARS-CoV-2 could be responsible for a clinically significant alteration of Hb affinity for O2 (Wenzhong and Hualan, 2020). By the way, about 19% of COVID-19 patients are considered to display severe-to-critical pneumonia (Wu and McGoogan, 2020), with often profound hypoxemia which in no instance can be explained by altered Hb affinity (West and Luks, 2016).

Another claim in the preprint article of Wenzhong and Hualan (2020) was that SARS-CoV-2 could be responsible for hemolytic anemia. Indeed, potential causes of anemia are numerous and often intertwined in critically ill patients (hemodilution, iron deficiency by repeated blood sampling, surgical site bleeding or other invasive procedures, inflammation…) (Heming et al., 2011 Spinelli and Bartlett, 2016), particularly in such an inflammatory condition as COVID-19. In the present work, fever and dehydration could explain, at least in part, the higher median [Hb] in COVID-19 patients at baseline, compared to non-COVID-19 patients. Anyway, median [Hb] was normal at baseline, and although 24 COVID-19 patients later displayed anemia in the course of their disease, none of them exhibited obvious hemolysis. In a Chinese study comparing hematologic variables between critically ill COVID-19 and other COVID-19 patients not having required ICU, median [Hb] was normal at baseline in both groups, but the median [Hb] nadir was then lower in critically ill patients (11.1 g.dl 𠄱 [10.2�.9] vs. 13.6 g.dl 𠄱 [12.7�.1]) (Fan et al., 2020). In a literature review mostly analyzing data from Chinese centers, the authors stated that anemia was not a common laboratory finding in COVID-19 patients, but [Hb] tended to decline during hospitalization (Liu et al., 2020). At last, two meta-analyses showed that low [Hb] was associated with disease severity in COVID-19 (Alnor et al., 2020 Lippi and Mattiuzzi, 2020). Hemolysis was not mentioned in any of these articles. However, it cannot be excluded that occult intravascular hemolysis might occur at some level which could not be detected with classical biological signs, requiring more sensitive techniques such as detecting red blood cell microvesicles (Camus et al., 2015).

Several reports of acute hemolysis after SARS-CoV-2 infection were published, but not from direct viral action on Hb. Twelve patients presented with autoimmune hemolytic anemia (AIHA), among them 4 had B lymphoid malignancy, one had monoclonal gammapathy (Jensen et al., 2020 Lazarian et al., 2020 Lopez et al., 2020) and 2 had Evans syndrome (Li et al., 2020 Wahlster et al., 2020). Later, it was stated that AIHA could concern 12% of the subgroup of anemic COVID-19 patients (Algassim et al., 2021). Fourteen additional patients were described: five with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (Kulasekararaj et al., 2020 Pike et al., 2020) and 9 with previously undiagnosed glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency uncovered in context of acute hemolysis (Aguilar and Averbukh, 2020 Beauverd et al., 2020 De Franceschi et al., 2020 Kuipers et al., 2020 Maillart et al., 2020 Palmer et al., 2020 Sasi et al., 2020 Sgherza et al., 2020 Lopes et al., 2021). Indeed, infections are the most common trigger for hemolysis in G6PD-deficient individuals, and it is unclear if the use of chloroquine or hydroxychloroquine in these patients can worsen the phenomenon (Afra et al., 2020a,b).

In conclusion, the COVID-19 pandemic has greatly promoted preprint servers, with no less than 12,194 preliminary reports about COVID-19 hosted on arXiv platforms at the time of writing (MedRxiv, 2021). While it is a thrilling way to rapidly share information about the disease, the absence of conventional peer-review is at risk of spreading erroneous conclusions, sometimes amplified by the media and/or social networks (Smyth et al., 2020). The draft of Wenzhong and Hualan (2020) hypothesizing that SARS-CoV-2 could 𠇊ttack” hemoglobin received quite a wide coverage and drew the public’s attention, as well as some academics’. However, the present study found no biological argument to think that Hb affinity for O2 is significantly altered during COVID-19, nor that COVID-19 can directly induce significant hemolytic anemia.


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Medicina traslacional de la ciencia

Vol 8, Issue 368
07 December 2016

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By Ivan Azarov , Ling Wang , Jason J. Rose , Qinzi Xu , Xueyin N. Huang , Andrea Belanger , Ying Wang , Lanping Guo , Chen Liu , Kamil B. Ucer , Charles F. McTiernan , Christopher P. O’Donnell , Sruti Shiva , Jesús Tejero , Daniel B. Kim-Shapiro , Mark T. Gladwin

Medicina traslacional de la ciencia 07 Dec 2016 : 368ra173

A mutant five-coordinate neuroglobin with a very high carbon monoxide binding affinity acts as an antidote to bind and eliminate CO.


BASIC PRINCIPLES

Hemoglobin Synthesis, Structure, and Function

Hemoglobin is a heterotetramer composed of α-like and β-like globin subunits, each bound to a heme prosthetic group. The major functions of Hb are to transport oxygen (O2) from the lungs to peripheral tissues and carbon dioxide (CO2) from the tissues to the lungs. The kinetics of Hb-O2 binding and release are fine-tuned for this purpose and adaptable according to developmental ontogeny and metabolic perturbations. Moreover, the Hb molecule must limit potential problems caused by its associated iron and free O2, reactive molecules capable of inflicting damage through the production of reactive oxygen species. Efforts to understand how Hb structure imparts these critical functions have been ongoing for more than 50 years. Hemoglobin was one of the first proteins to be sequenced (Konigsberg et al. 1961 Schroeder et al. 1961 Watson and Kendrew 1961) and the globin genes were among the earliest to be cloned (Rabbitts 1976). In the late 1950s, Perutz and colleagues determined the three-dimensional structure of Hb through X-ray crystallography (Perutz 1960 Perutz et al. 1960). More recent studies refined this structure to high resolution (Paoli et al. 1996 Park et al. 2006). In addition, O2 and other ligand-binding properties have been measured in detail for native Hb and many naturally occurring mutants. All of this work provides a substantial framework for defining the O2 delivery properties of Hb, as well as the molecular consequences of variant mutations (see, for example, Lehmann 1957 Konigsberg and Lehmann 1965 Shimizu et al. 1965 Perutz and Lehmann 1968 Perutz 1970 Bunn and Forget 1986).

Globin polypeptides are synthesized from separate α-like and β-like globin gene clusters located on human chromosomes 16 and 11, respectively. Nascent globin chains rapidly incorporate heme, which stabilizes their native folding into Hb subunits composed of seven or eight α helices named A–H, which fold together into a globular structure ( Fig. 1 A). Hb subunits bind O2 and other ligands via the heme iron buried within an evolutionarily conserved hydrophobic pocket that faces the outside of HbA tetramers ( Fig. 1 B). Heme iron is axially coordinated to globin proteins by an invariant histidine residue in helix F8, termed the “proximal” histidine ( Fig. 1 C). The opposite axial position binds O2, which is stabilized by interaction with the conserved 𠇍istal” histidine in helix E7 ( Fig. 1 C). Multiple additional amino acids within the globin proteins stabilize heme binding through noncovalent interactions ( Fig. 1 C). Iron must be in its reduced (ferrous, Fe 2+ ) state for Hb to bind O2. Oxidized or “met” Hb (ferric, Fe 3+ ) cannot bind O2 and is relatively unstable, tending to lose hemin and denature. Thus, red blood cells have evolved elaborate mechanisms to maintain Hb in its reduced state (Bunn and Forget 1986 Ganz and Nemeth 2012 Schechter 2012). For example, the methemoglobin reductase system converts methemoglobin (metHb) to its reduced form. Not surprisingly, globin mutations that alter amino acids within the ligand pocket frequently produce strong functional effects, including destabilization, altered affinity for O2, and increased rates of metHb formation and heme loss (see the section on Selected Variants that Illustrate Important Aspects of Hemoglobin Biology). Variants promoting autoxidation are termed “M-Hbs” (see the sections on Selected Variants that Illustrate Important Aspects of Hemoglobin Biology and Methemoglobin (“M-Type”) Variants). Because Hb gains its distinctive color from the heme group, alterations that affect the environment of the heme iron, including changes in the surrounding amino acids, different gas ligands, or redox state, produce characteristic changes in visible light absorption. These color changes are used clinically to assess Hb-O2 saturation, metHb formation and the effects of Hb variants.

The structure of Hb. (A) The α (pink) and β (red) Hb subunits have conserved α-helical folds. Helices are labeled A–H from the amino terminus. The α subunit lacks helix D. (B) The high O2 affinity R state quaternary structure of Hb with O2 (red spheres) bound at all four heme sites (protoporphyrin-IX as yellow sticks, with central iron atom as orange sphere). (C) Stereo (wall-eye) diagram of the heme pocket of β showing the proximal (F8) and distal (E7) histidines and selected residues in the distal heme pocket that influence ligand binding and autoxidation. (D) Hb tetramer is assembled from two identical αβ dimers (shown in red and gray for clarity). In the tetramer, each subunit makes contact with the unlike chain through a high affinity dimerization 㬑㬡 interface and a lower affinity 㬑㬢 dimer–tetramer interface (cyan).

Within the Hb tetramer, each globin subunit binds the unlike chain through two distinct interfaces, termed 㬑㬡 and 㬑㬢 ( Fig. 1 D). Individual globin subunits form dimers through the extremely high affinity 㬑㬡 interaction. Globin chain monomers are relatively unstable compared with dimers, with a tendency to form intracellular precipitates that damage erythrocytes, causing hemolytic anemia. Thus, mutations that impair the 㬑㬡 interaction can cause erythrotoxicity by favoring the accumulation of monomeric subunits (Fig. 2C). The 㬑㬢 interaction, which is lower affinity, mediates tetramerization. Oxygen binding destabilizes the 㬑㬢 interaction, resulting in a transition of the quaternary structure from the “T” (tense, low affinity, deoxygenated) to “R” (relaxed, high affinity, oxygenated) state, which facilitates O2 binding to additional subunits ( Fig. 2 A). This process causes cooperative O2 binding, which is illustrated by the characteristic sigmoidal shape of the Hb-O2 equilibrium curve ( Fig. 2 B). Cooperativity allows maximal O2 release over relatively small drops in O2 tensión. Mutations within the 㬑㬢 interaction region can alter the functional properties of Hb, mainly by perturbing O2-binding characteristics ( Fig. 2 C, cyan spheres Table 1 ).

Hb variants with altered subunit interactions. (A) Conversion from the low O2 affinity (deoxy, T state) to high O2 affinity (oxy, R state) involves a relative rotation of the 㬑㬡 and 㬒㬢 dimers, with changes in contacts across the 㬑㬢 (and 㬒㬡) interface (cyan). In this cartoon, the 㬑㬡 dimer is held stationary to reveal the relative motion of the 㬒㬢 dimer in going from the deoxy (orange) to the oxy (red) states. (B) The sigmoidal shape of the Hb-O2 saturation curve shows allosteric regulation by changes in pH, temperature, and 2,3DPG. These regulators, as well as Hb variants, influence the shape of the curve. High oxygen affinity variants, high pH, low 2,3DPG, or low temperature induce a “left shift” in the saturation curve (red line). Conversely, low oxygen affinity variants, low pH, high 2,3DPG, or high temperature induce a “right shift” (blue line). (C) Hb sequence variants at the allosteric 㬑㬢 interface (cyan spheres) show an impaired response to O2 vinculante. Some sequence variants disrupt binding to other allosteric regulators, e.g., substitutions at βK82 (green) disrupt interactions with 2,3DPG that normally stabilize the low O2 affinity T state. Mutations that disrupt 㬑㬡 (and 㬒㬢) dimerization (blue spheres) increase the concentration of free monomers, which are unstable. (D) Some α mutations that disrupt binding to β may also disturb binding to the chaperone, AHSP. Other α variants, such as Turriff and Beziers (pink sphere) may inhibit only AHSP binding.

Cooperativity represents a general phenomenon termed allosteric regulation, in which effector molecules control the properties of enzymes or other proteins by binding to regions that are distinct from the active sites. Several allosteric regulators, in addition to O2, influence the properties of Hb. For example, H + binds Hb to promote O2 release in a process termed the Bohr effect (Perutz et al. 1984). In peripheral tissues, abundant CO2 is taken up by red blood cells and metabolized by carbonic anhydrase to carbonic acid, resulting in the production of H + and consequent O2 liberación. In contrast, relatively low CO2 and high pH in the lung favors O2 binding to Hb. Additionally, CO2 forms carbamino adducts with the amino termini of both α and β globins in vivo. These interactions produce minor effects on whole blood O2 affinity compared to the impact of CO2 on pH (Bunn and Forget 1986). The compound 2,3-diphosphoglycerate (2,3DPG), formed as a by-product of glycolysis and present at relatively high concentrations in red blood cells, is another important allosteric regulator of Hb. 2,3DPG binds and stabilizes T state Hb to facilitate O2 liberación. Hemoglobin binding sites for H + and 2,3DPG have been identified (Perutz et al. 1969, 1984 Perutz 1970 Arnone 1972). Together, these interactions allow Hb to sense metabolic activity and modulate O2 binding accordingly. This environmental sensory function can be altered by mutations that affect the affinity of Hb for its allosteric regulators ( Fig. 2 C, green sphere Table 1 ).

Identification of Hb Variants and Their Clinical Implications

Many Hb variants are readily ascertained through physical examination and/or routine laboratory testing, which explains why so many have been discovered. Uncommonly, some variants are identified through evaluation of ill patients with severe anemia or clinically significant cyanosis. Many amino acid substitutions alter surface charge and are thus detected by electrophoresis or chromatography, techniques which are routinely performed on neonates in North America and Europe. Interestingly, a few Hb variants migrate similarly to HbA1c, a glycosylated form of Hb that reflects long-term control of blood glucose levels in diabetic patients ( Table 1 ) (reviewed in Little and Roberts 2009). In this way, specific Hb amino acid substitutions can artificially elevate HbA1c measurement and interfere with diabetic management. Other Hb variants are clinically benign but produce obvious changes in skin color. For example, mutations that increase Hb-O2 affinity typically stimulate erythropoietic drive by inhibiting O2 tissue delivery, causing erythrocytosis associated with a ruddy complexion (Nathan et al. 2009). Mutations that reduce O2 affinity produce a bluish hue to the skin (cyanosis) caused by abnormally high levels of deoxyHb. Mutations that favor oxidation of Hb iron to the met form (M-Hbs), also cause blue-tinged skin, whereas the blood itself appears brown. Studies of one family with congenital cyanosis led Horlein and Weber to describe the first known hemoglobinopathy, caused by the variant Hb-M Saskatoon (Horlein and Weber 1948). The M-Hb variant Iwate, which causes 𠇋lack blood” or “hereditary nigremia,” was first described more than 200 years ago in Japan (Shibata et al. 1960).

It is important to note that many Hb variants affecting skin color are not clinically damaging beyond their cosmetic effects. However, these conditions can mimic more life-threatening problems such as cardiopulmonary and myeloproliferative disorders, which must be excluded. Thus, patients with cyanotic or polycythemic Hb variants may mistakenly undergo unnecessary and potentially dangerous medical procedures. Historical examples include cyanotic patients undergoing surgery or catheterization for presumed heart defects and polycythemic patients receiving radioactive 32 P for presumed polycythemia vera (Steinberg et al. 2001 Nathan et al. 2009). As stated, “the primary reason for establishing the diagnosis [of M Hbs] is to prevent iatrogenic misadventures that might arise under the mistaken impression that the patient has a cardiac or pulmonary disorder” (Bunn and Forget 1986). Most Hb variants with altered O2 affinity are relatively simple to diagnose through history, physical examination, and laboratory testing (Wajcman et al. 2001 Wajcman and Moradkhani 2011).

Globin Gene Synthesis Is Developmentally Regulated

Developmental regulation of the α-like and β-like globin gene families is of great medical significance (Sankaran and Orkin 2012). Hemoglobin F (α2γ2) is the most highly expressed form during late fetal gestation. After birth, expression gradually switches to HbA (α2& # x003b22) over several months. Thus, symptomatic mutations affecting α or γ globins are present prenatally or at birth, whereas the manifestations of β-globin mutations are typically delayed until a few months after birth. Interestingly, γ-globin gene mutations that are apparent at birth, most typically reflected by cyanosis or hemolytic anemia (e.g., Hb-F Toms River, sections on Selected Variants that Illustrate Important Aspects of Hemoglobin Biology and Variants that Affect Multiple Hemoglobin Functions, and Table 1 ), fade over a few weeks as Hb production switches from F (α2γ2) to A (α2& # x003b22).

Laboratory Testing for Hb Variants

In many countries, routine testing of all newborns is performed to identify common hemoglobinopathies such as some thalassemias and HbS. Isoelectric focusing or high-performance liquid chromatography (HPLC), the most commonly used tests, identify most structurally abnormal Hbs (Wajcman et al. 2001). In this way, many benign Hb variants are discovered incidentally. Clinical indications for laboratory testing to investigate potential Hb variants are listed in Table 2 .

Tabla 2.

Clinical indications for laboratory testing to diagnose Hb variants

Indications for hemoglobin testing
Routine newborn testing for common hemoglobinopathies (i.e., HbS, HbC, thalassemias)
Cyanosis with adequate arterial oxygenation and no apparent cardiopulmonary disease
Erythrocytosis with normal or elevated erythropoietin levels
Unexplained hemolytic anemia
Unexplained thalassemia phenotype
Family history consistent with an Hb variant

Specific laboratory tests to investigate Hb variants include:

Physical methods of Hb separation. These include electrophoretic and chromatographic techniques that examine the physical properties of 㬑㬡 dimers or individual globin subunits. Specific standards, such as HbA, HbS, HbC, HbF, and HbA2, are typically examined as controls. Hb variants may show altered migration in these assays. Historically, cellulose acetate and citrate agar electrophoresis were most commonly used to detect variant Hbs. Current clinical testing more typically uses isoelectric focusing and HPLC, which are more sensitive.

Hb-O2 binding curve. This test, performed on whole red blood cells or hemolysate, indicates the percent (%) oxygenated Hb at a given O2 partial pressure ( Fig. 2 B). Hemoglobin variants with an abnormally high O2 affinity (see sections on Selected Variants that Illustrate Important Aspects of Hemoglobin Biology and High Oxygen Affinity Variants) will become saturated at lower O2 pressures producing a “left-shifted” O2 equilibrium curve, whereas mutations that reduce O2 affinity (see sections on Selected Variants that Illustrate Important Aspects of Hemoglobin Biology and Low Oxygen Affinity Variants) will cause the opposite “right shift.” Determination of Hb-O2 affinity responses to allosteric regulators, particularly 2,3DPG or H + (pH changes), can provide insight into the structural causes of the observed phenotypes. Unfortunately, few clinical laboratories currently offer this assay.

Visible wavelength spectroscopy. Hemoglobin variants with amino acid substitutions in the heme pocket affect visible light absorbance. For example, M-type Hbs show characteristic spectra that can distinguish them from methemoglobinemia caused by an enzyme deficiency in the metHb reductase system (Bunn and Forget 1986 Dailey and Meissner 2012 Ganz and Nemeth 2012 Schechter 2012). Pulse oximetry is a noninvasive spectrophotometric test that measures absorbance ratios at specific wavelengths for oxygenated (660 nm) and deoxygenated (940 nm) blood (Tremper and Barker 1989). This can produce confusing and sometimes misleading results in patients with variant Hbs that show unique light absorbance properties (Verhovsek et al. 2010). In these cases, analysis of arterial blood O2 concentration may be required to rule out hypoxia. Analyzing these variant Hbs using light absorbance throughout the full visible wavelength spectrum can provide useful diagnostic information.

Hemoglobin stability testing. Typically, Hb stability is impaired in variants that are associated with hemolytic anemia. Hemoglobin stability tests measure the propensity for Hb to denature on exposure to various stresses including heat (Carrell and Kay 1972), isopropanol (Bender et al. 1981), mechanical agitation (Asakura et al. 1975), and zinc acetate (Roth et al. 1976). The Heinz body test uses supravital stains, such as methylene blue or crystal violet, to detect aggregated globins within erythrocytes (Eisinger et al. 1985).

Specialized testing. Mass spectrometry analysis of patient hemolysate and DNA sequencing of globin genes are specialized confirmatory tests to identify amino acid and nucleotide alterations associated with suspected Hb variants (Wajcman et al. 2001 Wajcman and Moradkhani 2011). DNA sequencing may readily elucidate the presence of an Hb variant. However, additional biochemical and structural studies, including those discussed in this section, are required to determine how the variant affects Hb function. Crystallographic analysis is the highest resolution approach to determine the effects of globin amino acid substitutions on molecular structure. Crystallography has been used historically as a research tool to assess the effects of some interesting Hb variants (see, for example, Pulsinelli et al. 1973 Perutz et al. 1984).


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Leghemoglobins are monomeric proteins with a mass around 16 kDa, and are structurally similar to myoglobin. [13] One leghemoglobin protein consists of a heme bound to an iron, and one polypeptide chain (the globin). [13] Similar to myoglobin and hemoglobin, the iron of heme is found in its ferrous state in vivo, and is the moiety that binds oxygen. [13] Despite similarities in the mechanism of oxygen binding between leghemoglobin and animal hemoglobin, and the fact that leghemoglobin and animal hemoglobin evolved from a common ancestor, there is dissimilarity in amino acid sequence between these proteins at about 80% of positions. [13]

Oxygen binding affinities of leghemoglobins are between 11 and 24 times higher than oxygen binding affinities of sperm whale myoglobin. [14] Differences in the affinities are due to differential rates of association between the two types of proteins. [14] One explanation of this phenomenon is that in myoglobin, a bound water molecule is stabilized in a pocket surrounding the heme group. This water group must be displaced in order for oxygen to bind. No such water is bound in the analogous pocket of leghemoglobin, so it is easier for an oxygen molecule to approach the leghemoglobin heme. [13] Leghemoglobin has a slow oxygen dissociation rate, similar to myoglobin. [15] Like myoglobin and hemoglobin, leghemoglobin has a high affinity for carbon monoxide. [15]

Heme groups are the same in all known leghemoglobins, but the amino acid sequence of the globin differs slightly depending on bacterial strain and legume species. [13] Even within one leguminous plant, multiple isoforms of leghemoglobins can exist. These often differ in oxygen affinity, and help meet the needs of a cell in a particular environment within the nodule. [dieciséis]

Results of a 1995 study suggested that the low free oxygen concentration in root nodule cells is actually due to the low oxygen permeability of root nodule cells. [17] It follows that the main purpose of leghemoglobin is to scavenge the limited free oxygen in the cell and deliver it to mitochondria for respiration. But, scientists of a later 2005 article suggest that leghemoglobin is responsible both for buffering oxygen concentration, and for delivery of oxygen to mitochondria. [18] Their leghemoglobin knockout studies showed that leghemoglobin actually does significantly decrease the free oxygen concentration in root nodule cells, and that nitrogenase expression was eliminated in leghemoglobin knockout mutants, assumably due to the degradation of nitrogenase with high free oxygen concentration. Their study also showed a higher ATP/ADP ratio in wild-type root nodule cells with active leghemoglobin, suggesting that leghemoglobin also assists with delivery of oxygen for respiration.

Globins have since been identified as a protein common to many plant taxa, not restricted to symbiotic ones. In light of this discovery, it has been proposed that the term phytoglobins be used for referring to plant globins in general. [19]

Phytoglobins can be divided into two clades. The 3/3-fold type contains Classes I and II of angiosperm phytoglobins, and is the one common to all eukaryotes (HGT of a bacterial flavohemoglobin). The leghemoglobin sensu stricto is a class II phytoglobin. The 2/2-fold "TrHb2" type contains class III in angiosperm nomenclature, and appears to be acquired from Chloroflexi by the ancestor of land plants. [19]

Impossible Foods asked the American FDA for their approval to use soy leghemoglobin in foods as an analog of meat-derived hemoglobin. [20] [21] Approval from the FDA came in July 2019, [22] which was later upheld on May 3rd, 2021, by a San Francisco federal appeals court, in a ruling that rejected a lawsuit filed by the non-profit advocacy organization Center for Food Safety. [23] [24] It is currently being used in their products to mimic the color, taste, and texture of meat. [25]